显微镜成像方法与技术-1

由无数的细胞所组成的。胡克对细胞学的发展作出了极大的贡
献。
单式镜
1674年，Leeuwenhoek(列文虎克)：发现原生动物学 的报导问世，并于九年后成为首位发现「细菌」存在的
人。
荷兰人安东尼· 列文虎克（Anthony Von 冯· Leeuwenhoek ，1632-1723）制造的显微镜让人们大 开眼界。列文虎克自幼学习磨制眼镜片的技术，热衷于
制造显微镜。他制造的显微镜其实就是一片凸透镜，而
不是复合式显微镜。不过，由于他的技艺精湛，磨制的 单片显微镜的放大倍数将近300倍，超过了以往任何一 种显微镜。
列文虎克用他的显微镜 观察细菌的记录
用列文虎克制作的显微镜 列文虎克设计的显微镜
列文虎克关于甲壳虫眼睛的 一封信中的插图
观察到的人血涂片
1830年，英国外科医生李斯特改良了球面晶片所映的影像不清的问题，制作出日后「复式 显微镜（ compound microscope ）」的原型。
物体或有深度的物体，一般用同轴光，如观察液晶常常使用到。
4、暗场照明：光线不需直接照射观察物体，光照射方向被遮挡后四周围通过漫反射而产生 。如暗视野显微镜。
透射光照明方式
反射光照明方式
同轴光照明方式
暗视野照明方式
聚光照明系统对显微观察的影响
聚光照明系统是对显微镜成像性能有较大影响但又易于被使用者忽视的环节。它的功 能是提供亮度足够且均匀的物面照明。 聚光镜发来的光束应能保证充满物镜孔径角，否则就不能充分利用物镜所能达到的最 高分辨率。为此目的，在聚光镜中设有类似照相物镜中的可以调节开孔大小的可变孔
径光阑，用来调节照明光束孔径，以与物镜孔径角匹配。观察高反差物体时，宜使照
不使用自由粒子，无需有透镜和专门的电子源，能在近天然的条件下对单个生物大分
子进行直接观察。
第二讲、光学显微镜介绍
光学显微镜的基本结构
普通光学显微镜的构造主要分为三部分：机械部分、照明部分和光学部分。
◆机械部分
（1）镜座：是显微镜的底座，用以支持整个镜体。 （2）镜柱：是镜座上面直立的部分，用以连接镜座和镜臂。 （3）镜臂：一端连于镜柱，一端连于镜筒，是取放显微镜时手握部位。 （4）镜筒：连在镜臂的前上方，镜筒上端装 有目镜，下端装有物镜转换器。 （5）物镜转换器(旋转器)：接于镜筒的下方， 可自由转动，盘上有3－4个圆孔，是安装物镜 的部位。转动转换器，可以调换不同倍数的物 镜，当听到碰叩声时，方可进行观察，此时物 镜光轴恰好对准通光孔中心，光路接通。转换 物镜后，不允许使用粗调节器，只能用细调节 器，使像清晰。
1872年，德国数学及物理学家阿贝提出阿贝正弦条件（ Abbe Sine Condition ） ，从而 令显微镜在设计过程中能达到最高清晰度。
1876年，Abbe(阿贝)：剖析影像在显微镜中成像时所产生的绕射作用，试图设计出最理想 的显微镜。 1879年，Flrmming(佛莱明)：发现了当动物细胞在进行有丝分裂时，其染色体的活动是 清晰可见的。 1881年，Retziue(芮祖)：动物组织报告问世，此项发表在当世尚无人能凌驾逾越。然而 在20年后，却有以Cajal(卡嘉尔)为首的一群组织学家发展出显微镜染色观察法，此举为日 后的显微解剖学立下了基础。 1882年，Koch(寇克)：利用苯安染料将微生物组织进行染色，由此他发现了霍乱及结核杆 菌。往后20年间，其它的细菌学家，像是Klebs 和 Pasteur(克莱柏和帕斯特)则是藉由显 微镜下检视染色药品而证实许多疾病的病因。
1886年，Zeiss(蔡氏)：打破一般可见光理论上的极限，他的发明--阿比式及其它一系列的 镜头为显微学者另辟一新的解像天地。
1898年，Golgi(高尔基)：首位发现细菌中高尔基体的显微学家。他将细胞用硝酸银染色而 成就了人类细胞研究上的一大步。
1924年，Lacassagne(兰卡辛)：与其实验工作伙伴共同发展出放射线照相法，这项发明便 是利用放射性钋元素来探查生物标本。
百度文库
伽利略显微镜
1933年制作的电镜
1945年Porter（细胞学之父）获 得的细胞电镜照片
显微镜的分类
根据显微原理的不同，可分为光学显微镜、电子显微镜和扫描探针显微镜三大类。 光学显微镜的种类很多，主要有明视野显微镜、暗视野显微镜、荧光显微镜、相差显 微镜、激光扫描共聚焦显微镜、偏光显微镜、微分干涉差显微镜、体视显微镜。 电子显微镜包括透射电镜TEM和扫描电镜SEM。 扫描探针显微镜包括：扫描隧道显微镜STM和扫描力显微镜SFM。扫描力显微镜SFM 包括：原子力显微镜AFM、摩擦力显微镜LFM、磁力显微镜MFM、静电力显微镜EFM 和化学力显微镜CFM。
1833年，Brown(布朗)：在显微镜下观察紫罗兰，随后发表他对细胞核的详细论述。
1838年，Schlieden and Schwann(施莱登和施旺)：皆提倡细胞学原理，其主旨即为「有 核细胞是所有动植物的组织及功能之基本元素」。 1857年，Kolliker(寇利克)：发现肌肉细胞中之线粒体。
显微成像方法与技术
第一讲、显微镜的发展简史和分类
显微镜的发展简史
早在公元前一世纪，人们就已发现通过球形透明物体去观察微小物体时，可以使其放 大成像。后来逐渐对球形玻璃表面能使物体放大成像的规律有了认识。
1590年，荷兰眼镜商Zaccharias Jansen和他的儿子以及意大利的眼镜制造者已经 造出类似显微镜的放大仪器，放大200倍左右。
1604年，Jansen创造地球上第一台显微镜。
1611年，Kepler(克卜勒) ：提议复合式显微镜的制作方式。 1665年，胡克（Hooke Robert ，1635-1703）发表了《显微 图集》一书，这是在他全部成就中最重要的一部著作，也是欧 洲17世纪最主要的科学文献之一。他开始应用显微镜于生物研 究，他将蜜蜂的刺、苍蝇的脚、鸟的羽毛、鱼鳞片以及跳蚤、 蜘蛛、草麻等，用显微镜详细地予以考察比较。他观察到软木 塞等物品的结缔组织，并使用“细孔”和“细胞”来说明， “细胞”（“cell”）一词从此被生物界直接采用。胡克的这一 发现，引起了人们对细胞学的研究。现在知道，一切生物都是
1941年，Coons(昆氏)：将抗体加上萤光染剂用以侦测细胞抗原。
1952年，Nomarski(诺马斯基)：发明干涉相位差光学系统。此项发明不仅享有专利权并以 发明者本人命名之。
1952年，英国工程师Charles Oatley制造出了第一台扫描电子显微镜（SEM）。
1953年，德国物理学家Zernike(卓尼柯)发明的「相位差显微镜（ phase-contrast microscope）」，获得 1953 年诺贝尔物理奖。 1965年，第一台商用的扫描电子显微镜（SEM）问世了。它把电子束发射到标本的表面 （而不是穿过标本），然后形成标本外观的精细三维图像。SEM能把标本放大15万倍。 1981年，Allen and Inoue(艾伦及艾纽)：将光学显微原理上的影像增强对比，发展趋于完 美境界。 1981瑞士人G. Binnig和H. RoherI在IBM苏黎世实验中心（Zurich Research Center）发 明了扫描隧道显微镜而与电镜发明者Ruska同获1986年度的诺贝尔物理学奖。 1988年，Confocal(共轭焦)扫描显微镜在市场上被广为使用。
射光照明。例如：观察生物切片及一些透明物体或观察物体的轮廓用透射光。透射光还有
一特点是：以工作台来划分为界，物镜与光源分别在工作台的上下两边。 2、反射光照明：物镜与光源在工作台的同一侧。光线自上而下照射被观物上再反射进入物 镜进行光学成像。大多数体视镜为反射光照明。观察物体为非透明，要求放大倍率小。 3、同轴光照明：光线通过透镜组，由物镜口光线垂直射出，再反射回物镜里进行光线成像 。金相显微镜，荧光显微镜就是同轴光照明。 特点：观察物体非透明，放大倍率要求较大（40倍以上）。观察物体表面反光很强或透明
显微镜目镜长度与放大倍数呈负相关，物镜长度与放大倍数呈正相关。即目镜长度
越长，放大倍数越低；物镜长度越长，放大倍数越高。
光学显微镜的成像原理
物体通过物镜成倒立、放大的实像，该实像又通过目镜成正立、放大的虚像。
显微镜常用的照明方式
1、透射光照明：光线穿透被观察物体，射入物镜进行光学成像。生物显微镜照明都是透
◆照明部分 装在镜台下方，包括反光镜和集光器。 （1）反光镜：装在镜座上面，可向任意方向转动，它有平、凹两面，其作用是将光源光 线反射到聚光器上 ，再经通光孔照明标本，凹面镜聚光作用强，适于光线较弱的时 候使用，平面镜聚光作用弱，适于光线较强时使用。 （2）集光器(聚光器)：位于镜台下方的集光器架上，由聚光镜和光圈组成，其作用是把 光线集中到所要观察的标本上。 ①聚光镜：由一片或数片透镜组成，起汇聚光线的作用，加强对标本的照明，并使光 线射入物镜内，镜柱旁有一调节螺旋，转动它可升降聚光器，以调节视野中光亮度的 强弱。 ②光圈(虹彩光圈)：在聚光镜下方，由十几张金属薄片组成，其外侧伸出一柄，推动 它可调节其开孔的大小，以调节光量。
各类显微镜的特点
光学显微镜通常皆由光学部分、照明部分和机械部分组成。无疑光学部分是最为关键 的，它由目镜和物镜组成。光学显微镜以紫外和可见光为光源，现在的光学显微镜可 把物体放大2000倍，分辨的最小极限达0.2微米。 电子显微镜与光学显微镜的成像原理基本一样，所不同的是电子显微镜用电子束作光 源，用电磁场作透镜。电子显微镜由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、
◆光学部分
（1）目镜：装在镜筒的上端，通常备有2－3个，上面刻有5×、10×或15×符号以表
示其放大倍数，一般装的是10×的目镜。 （2）物镜：装在镜筒下端的旋转器上，一般有3－4个物镜，其中最短的刻有“10×”符 号的为低倍镜，较长的刻有“40×”符号的为高倍镜，最长的刻有“100×”符号的 为油镜，此外，在高倍镜和油镜上还常加有一圈不同颜色的线，以示区别。 显微镜的放大倍数是物镜的放大倍数与目镜的放大倍数的乘积，如物镜为10×，目 镜为10×，其放大倍数就为10×10=100。
记录系统、电源系统等5部分构成。 20世纪70年代，透射式电子显微镜的分辨率约为
0.3纳米(人眼的分辨本领约为0.1毫米)，现在电子显微镜最大放大倍率超过300万倍， 而光学显微镜的最大放大倍率约为2000倍，所以通过电子显微镜就能直接观察到某些 重金属的原子和晶体中排列整齐的原子点阵。 扫描探针显微镜不用任何电子光学系统，仅用一个微小的针尖在样品附近进行扫描， 测定其隧道电流或相互作用力等就可得到显微图像，扫描探针显微镜在结构上比电镜 简单得多但能得到原子级空间分辨率（横向分辨率0.1nm，纵向分辨率优于0.01nm），
1930年，Lebedeff(莱比戴卫)：设计并搭配第一架干涉显微镜。另外由Zernike(卓尼柯)在 1932年发明出相位差显微镜，两人将传统光学显微镜延伸发展出来的相位差观察使生物学 家得以观察染色活细胞上的种种细节。
1933年，德国电子工程师恩斯特 ·魯斯卡制作出全球第一部「 电子显微镜（ electronic microscope）」并于 1986 年获得诺贝尔物理奖。对科学界迈进原子层面有著不可或缺的 地位。 1938年，德国工程师Max Knoll和Ernst Ruska制造出了世界上第一台透射电子显微镜 （TEM）。这种显微镜是通过发射电子穿过极薄的标本切片来成像的。对于观察细胞的内 部结构非常有用，TEM能把标本放大50万倍。
（6）镜台(载物台)：在镜筒下方，形状有方、圆两种，用以放置玻片标本，中央有一通光孔。 （7）调节器：是装在镜柱上的大小两种螺旋，调节时使镜台作上下方向的移动。 ①粗调节器(粗准焦螺旋)：大螺旋称粗调节 器，移动时可使镜台作快速和较大幅度的升
降，所以能迅速调节物镜和标本之间的距离
使物象呈现于视野中，通常在使用低倍镜时， 先用粗调节器迅速找到物象。 ②细调节器(细准焦螺旋)：小螺旋称细调节 器，移动时可使镜台缓慢地升降，多在运用 高倍镜时使用，从而得到更清晰的物象，并 借以观察标本的不同层次和不同深度的结构。