柱前衍生化-高效液相色谱法分析木糖结晶母液的单糖组成
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柱前衍生化-高效液相色谱法分析木糖结晶母液的单糖组成
孟海波;高绍丰;张海燕;孟汉卿
【摘要】The reversed - phase high performance liquid chromatographic ( HPLC) method of pre-column - derivatization with l-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone (PMP) was developed to separate the traditional eight monosaccharides and detect the monosac-charide composition of crystallization solution of xylose. The results showed that crystallization solution of xylose consisted of mannose, rharanose, cellobiose, glucose, galactose, xylose, arabinose, fucose, and the dominant component monosaccharides were glucose, ga-lactose, xylose and arabinose. Peak height was used to quantify. The concentration of eight kinds of monosaccharide was liner with correspond peak area with correlation coefficients (r2) of 0.9897 -0.9994. The detection limit was 0.002 1 -0.003 1 mg/mL. The recovery was 98.4% - 101.0% , and relative standard deviation of detection results was 0.66% -0.21 % (n = 6). The HPLC method is simple, rapid, sensitive, convenient and can be applied to the quality control of crytallization solution of xylose.%采用1-苯基-甲基-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化-反相高效液相色谱(HPLC)法建立了8种常见单糖的分离模式,并用于木糖结晶母液单糖组成的定量分析.结果表明:木糖结晶母液至少由甘露糖、鼠李糖、纤维二糖、
葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖及岩藻糖8种单糖组成,其中以葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖为主.以峰高定量,8种单糖的浓度与相应的峰高呈良好的线性关系,相关系数r2在0.9897 -0.9994范围内,方法检出限为0.0021-0.0031 mg/mL,回
收率为98.4% -101.0%,测定结果的相对标准偏差为0.66%-1.21%(n=6).该方法简单、快速、灵敏,可用于木糖结晶母液的质量控制.
【期刊名称】《化学分析计量》
【年(卷),期】2011(020)005
【总页数】3页(P47-49)
【关键词】木糖结晶母液;单糖组成;衍生化;高效液相色谱
【作者】孟海波;高绍丰;张海燕;孟汉卿
【作者单位】济南圣泉唐和唐生物科技有限公司,济南,250204;济南圣泉唐和唐生物科技有限公司,济南,250204;济南圣泉唐和唐生物科技有限公司,济南,250204;济南圣泉唐和唐生物科技有限公司,济南,250204
【正文语种】中文
木糖、阿拉伯糖作为一种良好的食品添加剂已被广泛应用于食品生产中。
它通常采用玉米芯等原料进行酸水解后,再经过结晶等工艺生产而成。
木糖母液则是木糖结晶后留下的深色粘稠液体,里面含有木糖、L-阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖等杂糖。
木糖母液由于里面的杂糖含量高,导致其中木糖的溶解度大而无法采用传统的方法结晶出来[1],所以木糖母液基本上是废液,只能低价卖给酱色厂做为原料生产焦糖色素[2]。
然而目前已开发出通过生物发酵、色谱分离等技术从木糖母液中提取木糖、L-阿拉伯糖的生产工艺,这需要检测木糖结晶母液中各种单糖的含量。
对木糖母液的检测不仅有助于木糖生产工艺的提高,也为木糖结晶液进行二次开发提供依据。
目前对木糖的分析有比色法[3]、纸层析法[4]和高效液相色谱法[5-7],并且已有报道采用SCR-101N糖柱初步分析木糖结晶液的单糖组成[7]。
然而这些方法只能检测糖液中的木糖、L-阿拉伯糖、葡萄糖这3种单糖的含量,对糖液中的其它糖类如半乳糖、甘露糖、鼠李糖、纤维二糖、岩藻糖等均无法检测,影响到对木糖结晶母液发酵过程的进一步研究。
为此,笔者采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)柱前衍生化-高效液相色谱仪法[8],用常规的紫外检测器和C18烷基键合柱,同时检测木糖结晶母液中的多种单糖,该法具有准确、快速、灵敏的特点。
1 实验部分
1.1 主要仪器与试剂
液相色谱仪:Ulti Mate 3000型,美国戴安公司;
乙腈:色谱纯,美国TEDIA公司;
PMP:化学纯,上海国药试剂有限公司;
葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、木糖、岩藻糖、纤维二糖:美国Sigma公司;
木糖结晶母液:焦作华康化工有限公司;
实验所用其它试剂均为分析纯。
1.2 溶液配制
(1)标准混合储备液
按照物质的量为0.8 mmol计算的单糖质量,精确称取8种单糖的标准品置于100 mL容量瓶中,用高纯水溶解并定容至刻度,配制成标准混合储备液,使用时稀释成所需浓度。
(2)样品试液
将木糖结晶母液离心,准确称取上清液0.5 g于100 mL容量瓶中,以高纯水稀释至刻度,混匀,供色谱分析用。
1.3 PMP柱前衍生物的制备
衍生化方法参考文献[8],并进行适当的改进:取配制好的单糖标准混合液或者5
g/L木糖结晶母液样品各50 μL,置于不同的1.5 mL离心管中,依次加入50 μL 0.5 mol/L的PMP甲醇溶液和50 μL 0.3 mol/L NaOH溶液,混匀,置于70℃
恒温水浴中反应30 min,取出,冷却10 min,用50 μL 0.3 mol/L HCl中和,加入1 mL氯仿萃取,充分震荡,用细针头吸弃下层,重复3次。
上层为水相,加入100 μL水稀释,混匀,然后用0.45 μm水性滤膜过滤,10 μL进样。
1.4 色谱条件
色谱柱:Symmetry C18柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),美国Waters公司;Dionex Ulti Mate 3000色谱系统;检测波长:250 nm;柱温:25℃;进样体积:10 μL;流动相:溶剂A为15%(体积分数)乙腈-0.05 mol/L磷酸缓冲液
(KH2PO4-NaOH,pH 6.9),溶剂B为40%(体积分数)乙腈-0.05 mol/L磷酸缓
冲液(KH2PO4-NaOH,pH 6.9),梯度模式列于表1,流速为1.0 mL/min。
表1 梯度模式时间/min溶剂A体积分数/%溶剂B体积分数
/%0100010928208515308515
2 结果与讨论
2.1 单糖标准品PMP衍生物的HPLC分离
为实现木糖结晶母液中各组成单糖的高效分离,本实验对木糖母液可能包含的8
种标准单糖PMP衍生物的高效液相色谱分离条件进行了优化。
结果表明:磷酸缓冲液(K2HPO4-NaOH)的pH值为 6.9,时间梯度为0→10→20→30 min和相应浓
度梯度为0→8%→15%→15%时溶剂B的梯度洗脱模式是分离此8种单糖衍生物的较理想色谱分离条件,单糖标准品的色谱分离图和木糖结晶母液的色谱分离图分别如图1所示。
(a)单糖标准品的色谱分离图
(b)木糖结晶母液的色谱分离图1—甘露糖; 2—鼠李糖; 3—纤维二糖;4—葡萄糖; 5—半乳糖; 6—木糖;7—阿拉伯糖; 8—岩藻糖图1 色谱分离图
2.2 标准曲线绘制
用高纯水将8种单糖标准混合储备液稀释为5个不同浓度的系列标准混合样,进
样10 μL,分别测定峰高。
以各标样峰高(Y)为纵坐标,浓度(X,μg/mL)为横坐标进行线性回归。
各组分的线性回归方程、相关系数、线性范围、检出限列于表2。
表2 8种单糖的线性回归方程、相关系数和检出限色谱峰编号单糖线性方程线性范围/μg·mL-1r2检出限/mg·mL-11甘露糖Y=905.6X+5.16.8~23.80.99810.00212鼠李糖Y=527.3X+4.48.0~28.10.99690.00263纤维二糖Y=216.3X+5.614.1~49.60.99910.00314葡萄糖Y=432.9X+9.912.3~43.10.99450.00295半乳糖Y=749.8X+14.39.5~33.30.99940.00246木糖Y=491.4X+16.725.0~87.00.98970.00277阿拉伯糖Y=565.7X+6.212.0~42.00.99310.00268岩藻糖Y=230.7X+2.16.1~21.30.99520.0031
2.3 精密度试验
取单糖标准混合储备液在1.4色谱条件下测定6次,测定色谱峰的峰高。
根据线性回归方程计算单糖含量,测得甘露糖、鼠李糖、纤维二糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖的相对标准偏差(RSD)分别为0.79%、0.84%、0.66%、0.86%、
1.04%、1.21%、0.92%、0.81%,表明方法的精密度良好。
2.4 回收试验
将木糖结晶母液样品离心,准确称取上清液0.5 g 5份于100 mL容量瓶中,各加入1.2(1)制备的标准混合储备液适量,以高纯水稀释至刻度,混匀,进样分析。
根据分析结果计算回收率并列于表3。
从表3可以看出,8个组分的平均回收率为98.4%~101.0%。
表3 8种单糖组分的回收率(n=5)单糖本底值/mg·mL-1加入量/mg·mL-1平均测得量/mg·mL-1平均回收率/%RSD/%甘露糖0.0360.340.376100.11.2鼠李糖0.0200.400.41899.51.4纤维二糖0.0160.710.71898.90.7葡萄糖0.4350.360.799101.01.2半乳糖0.2780.330.60799.61.2木糖1.3690.321.690100.41.3阿拉伯糖0.6170.320.93298.40.5岩藻糖0.0000.310.312100.60.8 2.5 样品测定
取3个不同厂家样品按1.3方法操作,制备PMP衍生物溶液各3份,在1.4色谱条件下测定,外标法计算各单糖组分的含量,测定结果见表4。
由表4可以看出,目前木糖厂结晶母液中主要单糖为木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖,另外还有少量的纤维二糖、岩藻糖、鼠李糖和甘露糖。
表4 样品中单糖含量测定结果(n=3)单糖单糖含量/%样品1#样品2#样品3#甘露糖0.720.630.79鼠李糖0.400.370.48纤维二糖0.330.410.52葡萄糖8.777.959.16半乳糖5.606.046.27木糖27.5930.1229.88阿拉伯糖12.4413.5213.17岩藻糖0.130.110.09
3 结论
通过PMP柱前衍生化-HPLC法,实现了利用紫外检测器和C18柱同时检测木糖结晶母液中的8种单糖,克服了以往使用糖分析柱只能检测到葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的缺陷,对进一步研究木糖结晶母液的发酵及分离过程提供了依据。
该法分离效果好,分析速度快,测定结果准确可靠,适合检测木糖结晶母液的糖组分。
参考文献
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