肥胖SD大鼠运动性减肥与白色脂肪细胞棕色化的研究

肥胖SD大鼠运动性减肥与白色脂肪细胞棕色化的研究
谭丽清;鲁春霞;曹翠玲;许之屏;金育强
【摘要】观察有氧运动对肥胖SD大鼠白色脂肪棕色化相关细胞因子差异表达的影响,并探讨白色脂肪棕色化的分子机制.方法:将建模成功的肥胖SD大鼠分为运动组和肥胖组.运动组大鼠进行8周的跑台运动,肥胖组和对照组不给予运动.取各组大鼠皮下白色脂肪和肩胛下棕色脂肪,采用肉眼观察和镜下观察;用Real time-PCR检测各组脂肪组织中UCP-1、PGC-1α、Irisin和PRDM16 mRNA表达水平;用Western blot检测各组脂肪组织中UCP-1蛋白表达.结果:1)通过肉眼观察到运动组SD大鼠腹股沟皮下白色脂肪组织中夹杂着数块黄豆大浅棕色的脂肪组织,光镜下类似棕色脂肪细胞;Real time-PCR检测显示UCP-1、PGC-1α和irisin mRNA 的表达水平明显高于肥胖组和对照组皮下白色脂肪细胞,Western blot显示UCP-1蛋白表达水平明显高于对照组和肥胖组皮下白色脂肪细胞.2)运动组SD大鼠肩胛间的棕色脂肪组织肉眼观察平均体积变大,弹性好,镜下血管丰富,检测UCP-1、PGC-1α、irisin mRNA表达量明显高于肥胖组和对照组的棕色脂肪组织.3)运动组SD 大鼠的腹腔及肾周的白色脂肪经仔细检查和取材均未发现浅棕色改变.结论:1)有氧运动可促进肥胖SD大鼠白色脂肪细胞棕色化;2)有氧运动提高了SD大鼠肩胛间棕色脂肪的功能,促进了细胞分化;3)有氧运动对SD大鼠的腹腔及腹膜后的白色脂肪棕色化的作用微弱,不同部位的白色脂肪可能来源不同,导致细胞构成和细胞功能也不同.
【期刊名称】《沈阳体育学院学报》
【年(卷),期】2017(036)003
【总页数】6页(P76-81)
【关键词】肥胖SD大鼠;有氧运动;白色脂肪;棕色脂肪;白色脂肪细胞棕色化
【作者】谭丽清;鲁春霞;曹翠玲;许之屏;金育强
【作者单位】长沙民政职业技术学院体育部,湖南长沙410004;湖南师范大学体适能与运动康复湖南省重点实验室,湖南长沙410012;湖南师范大学体适能与运动康复湖南省重点实验室,湖南长沙410012;湖南师范大学体适能与运动康复湖南省重点实验室,湖南长沙410012;湖南师范大学体适能与运动康复湖南省重点实验室,湖南长沙410012
【正文语种】中文
【中图分类】G804.55
Key words：Obese SD rats；aerobic exercise；white adipose；brown adipose；browning of white adipocytes
肥胖已经成为威胁人类健康的世界性公共卫生问题。

肥胖者的特征之一是体内过量堆积的白色脂肪组织。

白色脂肪组织主要存在于皮下和腹腔内。

棕色脂肪组织主要存在于成人肩胛下、锁骨上和脊柱两侧，尽管含量极少，但产热效率极高，对增加能量消耗和促进脂代谢起到重要作用。

由于成人体内棕色脂肪含量较低，因此限制了它的临床应用。

最新研究显示，人体除以上两种脂肪组织外，还有第三种脂肪存在，即“米色脂肪（Beige adipose）”［1］。

米色脂肪细胞是一种静息细胞，分布于白色脂肪组织中，它在一定条件下被激活后，表现出类似棕色脂肪细胞的特点（又称作“棕色脂肪样细胞”），即UCP-1的表达显著增高，产热和能量消耗增强［1］。

米色脂肪细胞被激活表现出棕色脂肪细胞特点的这一过程，被称为“白色脂肪细胞棕色化（browning of white adipocytes）”［2］。

近年来“白色脂肪细胞棕色化”的提出大大拓展了棕色脂肪的功能，并为探讨减肥机理提供了
新的视角。

由此推测，促使白色脂肪细胞向“棕色脂肪样细胞”转化，增加能量消耗，可能是一个治疗肥胖的有效办法。

通过观察有氧运动对肥胖SD大鼠PGC-1α、PRDM16、Irisin、UCP-1的mRNA表达水平以及 UCP-1蛋白表达水平的影响，探讨有氧运动对“白色脂肪细胞棕色化”的作用机理。

1.1 肥胖模型的构建与验证
实验采用雄性 4周龄 SD大鼠，动物等级 SPF，体重（60±5）g，购自长沙天秦
生物公司（许可证号：湘SCXK 2009-0012）。

SD大鼠食用的高脂饲料配方（改良型）详见参考文献［3］，由湖南斯莱克实验动物公司提供（许可证号：湘SCXK 2009-0009）。

将4周龄的46只SD大鼠置于室温（22±3）℃通风良好的环境。

每笼5～6只，照明时间10 h。

适应性普通饲料喂养3d后，将其随机分为对照组与肥胖组。

对
照组12只，普通饲料足量喂养，自由饮食饮水。

肥胖组34只，改良的高脂饲料
足量喂养，自由饮食饮水。

两组大鼠经上述喂养8周（即第12周龄）后称重和测量血脂。

肥胖SD大鼠建模成功的标准，是按照空腹条件下体重超过对照组平均体重20%，同时参照血脂指标。

34只肥胖组 SD大鼠经8周改良高脂饲料喂养后，其中30
只大鼠平均体重明显高于对照组，具有显著性差异（P＜0.05）。

TC、TG和LDL-C均明显高于对照组，具有显著性差异（P＜0.01；P＜0.05）。

30只 SD大鼠显
示建模成功，另外 4只不符合建模标准剔除。

1.2 实验动物与分组
动物分组：将建模成功的30只肥胖SD大鼠进行分组，随机分成肥胖组与运动组，原来的对照组仍作为对照组。

分组、喂养和运动干预情况见表1。

1.3 运动方案
运动组的运动方案选择中低强度的运动跑台训练。

参照 Bedford方法，负荷设定
为 17 m／min，45 min／d，坡度为0°，大约相当于大鼠66%最大摄氧量。

第1周为适应性训练，第1天12 m／min，15 min，坡度为0°，以后每天按1 m／min、时间按5 min／d递增至设定负荷。

从第2周开始正式运动。

每周训练6 d，休息1 d，共计训练8周。

1.4 动物取材与处理
大鼠过夜禁食10 h以上，称体重。

给戊巴比妥钠（40 mg／kg体重）麻醉。

眼
球取血，提取血清检测总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）。

试剂盒购自北京北化康泰生物有限公司。

固定大鼠，取出腹股沟皮下白色脂肪、肩胛间棕色脂肪、腹腔腹膜后肾周白色脂肪，用 PBS水洗净迅速置液氮中，再移入 -80℃冰箱冻存。

部分组织置于10%多聚甲醛溶液固定。

1.5 Real time-PCR法检测UCP-1、PGC-1α、Irisin和PRDM16 mRNA水平的
表达
使用Trizol（美国Invitrogen公司）提取大鼠组织总 RNA。

按照 RevertAid
First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒（Fermentas公司）的标准进行逆转录。

逆转录产物存放-20℃冰箱内。

Real time-PCR仪器：ABI 7900HT（美国PE Biosystems公司），试剂：SYBRⓇPremix Ex TaqTM（Takara公司）。

总反应体系为30μL。

取0.2 mL薄壁PCR管，分别编号。

向各管中加入SYBR R Premix ExTaq（2X）15μL，各基因正向引物1.2μL，反向引物1.2μL，对应的模板
cDNA各3μL，Rox Dye 0.6μL，ddH2O 9μL。

混匀，分三重复孔，每孔10μL，置于荧光定量PCR仪中。

PCR反应程序为：95℃30 sec，95℃5 sec，60℃30 sec，40个循环。

使用 Prime 5.0软件设计引物序列，由上海英杰生物公司（Invitrogen）合成，见表2。

1.6 Western blot检测 UCP-1蛋白水平
取100 mg腹股沟皮下白色脂肪和100 mg肩胛间棕色脂肪分别做以下实验：剪
碎并于玻璃匀浆器充分匀浆，加入500μL的组织裂解液于冰盒中30 min，4℃下离心10 min，取上清液。

BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。

取30μg总蛋白加上样缓冲液煮沸5 min后行聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转移至硝酸纤维素膜。

再
将该膜放入50 g／l脱脂奶粉液中，室温封闭1 h。

再将稀释好的一抗加入塑料袋中，加膜，去气泡，室温反应 4 h。

HRP标记的二抗室温反应1 h。

化学发光后显影、定影。

扫描显影条带，记录灰度值。

以β-actin为内源参照，计算 UCP-1蛋
白相对表达量，并进行统计分析。

1.7 统计学处理
所有数据均采用 SPSS 19.0统计软件处理，结果用平均数、标准差表示。

采用方
差分析进行组间差异比较，采用双侧T检验进行组内差异比较。

显著水平取α＝0.05。

2.1 运动8周后各组 SD大鼠体重与血脂
如表 3所示，运动8周后，肥胖组与对照组比较，肥胖组平均体重、TC和 TG明显偏高，具有极显著差异（P＜0.01），LDL-C偏高，具有显著性差异（P＜
0.05）。

运动组与肥胖组比较，运动组平均体重明显低于肥胖组，具有极显著差异（P＜0.01），运动组TC、TG和 LDL-C明显低于肥胖组，具有显著性差异（P＜0.05）；提示有氧运动一定程度上有减肥和降低血脂的作用。

2.2 运动8周后各组大鼠 HE切片观察
运动组SD大鼠的腹股沟处皮下白色脂肪组织中，肉眼见有两处黄豆大浅棕色区域。

在此区域取材并做HE切片镜下观察，发现细胞呈簇状分布，细胞较小，核居中，胞浆内有较多的脂肪小滴，类似棕色脂肪，也称作“棕色脂肪样细胞”（图C1）。

这些簇状分布的细胞与旁边的较大的空泡状白色脂肪细胞有明显形态学对比。

在皮下白色脂肪区有局灶性棕色脂肪样细胞，提示有氧运动有诱导皮下白色脂肪棕色化
的趋势。

仔细检查对照组和肥胖组SD大鼠的皮下白色脂肪未见明显改变（图A1、图B1）。

运动组 SD大鼠肩胛间的棕色脂肪组织肉眼观察体积变大，弹性好，切面黄色颗粒状物明显，光镜下 HE切片血管丰富，细胞数目增多呈片状，细胞较小，核居中，胞浆内有大量的脂肪小滴（图 C2）。

这种密集呈片状分布的棕色脂肪细胞与对照组 SD大鼠呈簇状分布的棕色脂肪细胞有明显不同，提示有氧运动促进了 SD大鼠的肩胛间的棕色脂肪的细胞的增殖和分化。

仔细检查对照组和肥胖组 SD大鼠的肩胛间棕色脂肪，未见明显改变（图A2、图B2）。

运动组 SD大鼠腹腔和腹膜后肾周的白色脂肪经仔细检查和取材，肉眼和光镜下均未发现“棕色脂肪样细胞”，说明有氧运动对腹腔和腹膜后肾周的白色脂肪棕色化的作用微弱。

仔细检查对照组和肥胖组 SD大鼠的腹腔和腹膜后，肾周白色脂肪未见明显改变。

2.3 各组大鼠腹股沟皮下白色脂肪 UCP-1、PGC-1α、Irisin、PRDM16 mRNA的表达
表4和图 2显示，运动组 UCP-1、PGC-1α、irisin mRNA表达水平明显高于肥
胖组，具有极显著差异（P＜0.01）。

运动组与对照组比较，UCP-1、PGC-1α、irisin mRNA高于对照组，有显著性差异（P＜0.05）。

运动组 PRDM16的表达
水平低于对照组高于肥胖组，均无显著性差异（P＞0.05）。

2.4 各组大鼠肩胛间棕色脂肪 UCP-1、PGC-1α、Irisin、PRDM16 mRNA的表达表5和图3显示，运动组UCP-1、PGC-1α、irisin、PRDM16的表达水平均明显高于肥胖组，具有极显著差异（P＜0.01）。

运动组与对照组比较，运动组UCP-1、PGC-1α、irisin、PRDM16明显高于对照组，有显著性差异（P＜0.01、P＜
0.05）。

2.5 Western blot检测各组大鼠腹股沟皮下白色脂肪和肩胛间棕色脂肪 UCP-1蛋
白的表达水平
如图 4所示，运动组腹股沟皮下白色脂肪和肩胛间棕色脂肪组织中 UCP-1蛋白表达水平明显高于对照组和肥胖组，具有显著性差异（P＜0.05）；对照组皮下白色脂肪和肩胛间棕色脂肪组织中 UCP-1蛋白表达水平明显高于肥胖组，具有显著性差异（P＜0.05）。

研究发现运动组 SD大鼠的腹股沟皮下白色脂肪组织中肉眼见散在分布的黄豆大不规则浅棕色区域，光镜下形态类似棕色脂肪样细胞，同时检测UCP-1、PGC-1α、irisin mRNA表达量明显高于肥胖组和对照组（P＜0.01 P＜0.05），Western blot检测腹股沟皮下白色脂肪UCP-1蛋白水平高于肥胖组和对照组（P＜0.05），提示有氧运动可使白色脂肪转化成具有棕色脂肪特征的“棕色脂肪样细胞”。

以上结果与相关的研究结果一致［1，2，4］。

其信号传导通路以PGC-1α／Irisin／UCP-1的通路为主：首先运动诱导骨骼肌细胞表达 PGC-1α（Peroxisome proliferator activated receptorγcoactivator-1α），PGC-1α在细胞内发挥基因转录激活的作用，诱导线粒体生成基因的表达。

研究发现，一旦白色脂肪中有PGC-1α表达，便促进了线粒体 UCP-1的大量表达［4］。

UCP-1（uncoupling protein 1）的功能是通过线粒体内膜输送质子，破坏氧化磷酸化，造成用于合成ATP的能量以热能的形式散失。

由于 UCP-1迫使机体消耗更多的能量来合成 ATP，所以 UCP-1表达越多能量消耗越多、产热越多。

PGC-1α的表达也促进了
FNDC5的表达，FNDC5能够将UCP-1的表达水平增加数十倍或数百倍［1］。

随后 FNDC5在体内被剪切后转变为新的糖蛋白 Irisin。

由于Irisin是通过骨骼肌
运动产生的，因此被称作“肌肉因子”［5］。

Irisin分泌入血后，使皮下白色脂
肪中静息的米色脂肪细胞发生棕色化，触发脂肪分解代谢，并以热的形式散发［1］。

因此“白色脂肪细胞棕色化”其实是静息的米色脂肪细胞被激活，变成了具有棕色脂肪功能的“棕色脂肪样细胞”的过程。

Irisin是 2012年由
Spiegelman实验室在“自然”杂志上首次报道，认为它最重要的生物学功能是促进了“白色脂肪细胞棕色化”［1，5］。

研究发现运动组 SD大鼠肩胛间的棕色脂肪组织肉眼观察平均体积变大，弹性好，光镜下血管丰富，棕色脂肪细胞排列密集融合为大片状，与肥胖组和对照组SD大鼠的肩胛间棕色脂肪细胞呈簇状分布有明显对比，提示有氧运动促进了棕色脂肪细胞的增殖和分化。

同时检测运动组 SD大鼠肩胛间的棕色脂肪UCP-1、PGC-1α、irisin、PRDM16的mRNA和 UCP-1蛋白表达水平明显高于肥胖组和对照组（P
＜0.01，P＜0.05），提示有氧运动增强了棕色脂肪细胞的功能。

以上结果与BostrÖm P［4］等人的研究结果一致。

有研究证实 PRDM16（PR domain-containing 16）在棕色脂肪细胞的分化和发育中扮演重要角色，认为PGC-1α、PGC-1β和PRDM16 3者结合后促进棕色脂肪相关基因的表达［6］。

本文发现
运动组 SD大鼠肩胛间的棕色脂肪组织 PRDM16的表达明显高于肥胖组和对照组（P＜0.01，P＜0.05），本文结果支持以上研究。

本文发现运动组 SD大鼠腹腔及腹膜后肾周的白色脂肪经仔细检查和取材均未发现浅棕色改变，说明有氧运动对 SD大鼠的腹腔及腹膜后肾周的白色脂肪棕色化的作用微弱，本文及相关的研究［7-8］也证明了这一点。

该结果提示不同部位的白色脂肪可能来源不同，导致细胞构成和细胞功能也不同。

通过有氧运动使人体的“白色脂肪发生棕色化”，这些遍布全身的数量可观的“棕色脂肪样细胞”促进了机体的能量消耗，从而达到减肥的目的。

由于运动减肥的信号传导通路较多，机理极复杂，PGC-1α／Irisin／UCP-1信号传导通路是运动减
肥诸多机理中最令人关注的。

Irisin被认为是近年来最具影响力的科学发现之一，就像胰岛素的人工合成引起糖尿病治疗革命一样，irisin将会给肥胖的治疗带来新
的希望。

还有 FNDC5与 Irisin在大脑和心脏等组织中有大量表达［7］，认为FNDC5mRNA和FNDC5／irisin反射弧存在于下丘脑的固定区域［9-11］，
通过刺激下丘脑反射弧可以控制 Irisin的分泌。

目前 Irisin的表达调控和生物学功能等都不清楚，血浆中 Irisin的半衰期、存在形式及受体等均未见报道，各种细胞因子的研究多为动物实验，人体应用仍需要更多的基础研究。

1）有氧运动可促进肥胖 SD大鼠白色脂肪细胞棕色化。

2）有氧运动提高了 SD大鼠肩胛间的棕色脂肪的功能，促进了细胞分化。

3）有氧运动对 SD大鼠的腹腔及腹膜后的白色脂肪棕色化的作用微弱，不同部位的白色脂肪可能来源不同，导致细胞构成和细胞功能也不同。

【相关文献】
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