IL-33调控NF-κB

doi：10.3969/j.issn.1000-484X.2023.09.005
IL-33调控NF-κB/Twist信号通路促进肺泡上皮细胞上皮-间质转分化的机制研究①
高云星②付裕③陈晓李泽朋何晓伟李先伟
（皖南医学院药学院药理学教研室，芜湖 241002）
中图分类号R392.12 文献标志码 A 文章编号1000-484X（2023）09-1814-08
［摘要］目的：探究IL-33是否通过激活NF-κB/Twist信号通路，进而诱导Ⅱ型肺泡上皮细胞发生上皮-间质转分化（EMT）而促进肺纤维化（PF）的进程。

方法：C57BL/6小鼠48只，随机分成对照（CON）组、博莱霉素（BLM）组、BLM+IL-33 （30 μg/kg）组和BLM+抗IL-33抗体（Anti-IL-33 Ab）（100 μg/kg）组，每组12只。

气管注射BLM（5 000 U/kg）诱导PF小鼠模型。

造模后每隔1 d腹腔注射1次重组IL-33和抗IL-33抗体，连续注射3周。

HE和Masson染色观察肺组织病理变化及胶原沉积情况。

ELISA检测血浆IL-33的水平。

免疫组化检测肺组织IL-33跨膜受体ST2L的表达。

体外培养小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞，实验设Control组、IL-33（100 ng/ml）组、IL-33+二甲基亚砜（DMSO）组及IL-33+吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（PDTC， 100 μmol/L）组，每组设复孔6个。

细胞先用PDTC或DMSO预处理1 h，再用IL-33处理48 h。

RT-PCR检测肺组织或肺泡上皮细胞中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、E钙黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）mRNA的表达。

Western blot检测肺组织和（或）肺泡上皮细胞IL-33、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ、E-cadherin、Vimentin、α-SMA、p-IκBα、p-NF-κB p65蛋白表达及细胞核内NF-κB p65和Twist的蛋白水平。

结果：体内实验，与CON组相比，BLM组IL-33、ST2L的表达明显升高，p-IκBα、p-NF-κB p65及核内NF-κB p65和Twist的蛋白水平显著升高，肺组织E-cadherin的表达明显下调而Vimentin、α-SMA、CollagenⅠ和Collagen Ⅲ的表达明显上调（P<0.05）。

与BLM组相比，IL-33组IL-33、ST2L的表达进一步升高，p-IκBα、p-NF-κB p65及核内NF-κB p65和Twist的蛋白水平进一步增加，肺组织E-cadherin的表达进一步下调而Vimentin、α-SMA、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的表达进一步上调（P<0.05），肺纤维化程度进一步加重；而Anti-IL-33 Ab的作用正好和IL-33的作用相反。

体外实验，IL-33能够明显增加细胞内IκBα、NF-κB p65磷酸化水平，显著增加细胞核内NF-κB p65和Twist蛋白水平，明显下调E-cadherin的表达而显著上调Vimentin、α-SMA、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的表达（P<0.05）。

而IL-33的这些作用能够被NF-κB抑制剂PDTC所逆转。

结论：IL-33可能通过激活NF-κB信号通路而促使转录因子Twist的表达，进而诱导Ⅱ型肺泡上皮细胞发生EMT而导致PF发生。

［关键词］白细胞介素-33；核转录因子-κB；Twist；上皮-间质转分化；肺纤维化
IL-33 promotes epithelial-mesenchymal transition of alveolar epithelial cell by modulating NF-κB/Twist axis
GAO Yunxing， FU Yu， CHEN Xiao， LI Zepeng， HE Xiaowei， LI Xianwei. Department of Pharmacology， School of Pharmacy of Wannan Medical College， Wuhu 241002， China
［Abstract］Objective：To explore whether IL-33 induces epithelial-mesenchymal transition （EMT） of type Ⅱ alveolar epithe‐lial cell and promotes the process of pulmonary fibrosis （PF） by activating NF-κB/Twist axis. Methods：Forty-eight C57BL/6 mice were randomly divided into control （CON） group， bleomycin （BLM） group， BLM+IL-33 （30 μg/kg） group and BLM+Anti-IL-33 anti‐body （Ab）（100 μg/kg） group， twelve mice in each group. The PF model was induced by intratracheal injection of BLM （5 000 U/kg）. IL-33 and BLM+Anti-IL-33 Ab were administered by intraperitoneal injection every other day after BLM treatment for three weeks. HE staining and Masson staining were used to observe the pathological changes and collagen deposition of lung tissue. The level of plasma IL-33 was detected by ELISA. The expression of IL-33 transmembrane receptor ST2L in lung tissue was detected by immunohistochem‐istry. The type Ⅱ alveolar epithelial cells were divided into Control group， IL-33 （100 ng/ml） group， IL-33+DMSO group and IL-33+①本文受安徽省卫生健康委科研重点项目（2021zy033）；安徽省高校自然科学研究重点项目（KJ2019A0419）；2019年国家级大学生创新创业训
练计划项目（201910368002）资助。

②皖南医学院基础医学院医学微生物学与免疫学教研室，芜湖 241002。

③皖南医学院临床医学院临床医学系，芜湖 241002。

作者简介：高云星，男，硕士，副教授，主要从事细胞免疫方面的研究，E-mail：277291435@。

通信作者及指导教师：李先伟，男，博士，教授，主要从事肺纤维化和肺动脉高压的发病机制和防治研究，E-mail：wnmclixianwei69@。

pyrrolidinedithiocarbamate （PDTC， 100 μmol/L） group. The cells were pre-treated with DMSO or PDTC for 1 h， and then subjected to IL-33 for 48 h. The mRNA and （or） proteins levels of IL-33， Collagen Ⅰ， Collagen Ⅲ， E-cadherin， Vimentin， α-SMA， p-IκBα （total lysate）， p-NF-κB p65 （total lysate）， NF-κB p65（nucleus） and Twist （nucleus） were detected by RT-qPCR and （or） Western blot in lung tissues and cells. Results：In vivo， compared with CON group， the expressions of IL-33， ST2L， p-IκBα （total lysate），p-NF-κB p65 （total lysate）， NF-κB p65 （nucleus）， Twist （nucleus）， Vimentin， α-SMA， Collagen Ⅰ and Collagen Ⅲ were signifi‐cantly increased but the expressions of E-cadherin was obviously decreased. Compared with BLM group，the expressions of IL-33，ST2L， p-IκBα （total lysate）， p-NF-κB p65（total lysate）， NF-κB p65 （nucleus）， Twist （nucleus）， Vimentin， α-SMA， Collagen Ⅰ and Collagen Ⅲ were further increased and the E-cadherin expressions was further decreased and the degree of PF was further aggra‐vated. But the effect of Anti-IL-33 Ab was just opposite to that of IL-33. In vitro， IL-33 could significantly up-regulate the expression of p-IκBα （total lysate）， p-NF-κB p65 （total lysate）， NF-κB p65 （nucleus）， Twist （nucleus）， Vimentin， α-SMA， Collagen Ⅰ and Collagen Ⅲ and obviously down-regulate the expression of E-cadherin. But all these effects of IL-33 were reversed by PDTC. Conclu⁃sion：IL-33 may induce EMT of type Ⅱ alveolar epithelial cell and lead to the process of PF by activating NF-κB signaling pathway and promote the expression of transcription factor twist.
［Key words］Interleukin-33；NF-κB；Twist；Epithelial-mesenchymal transition；Pulmonary fibrosis
肺纤维化是由多种原因引起并由多种细胞或细胞成分参与的免疫炎症相关疾病。

其主要特征是肺泡上皮细胞损伤和肌成纤维细胞增殖、活化，以及细胞外基质（extracellular matrix，ECM）过度沉积［1］。

肺泡上皮细胞有Ⅰ型和Ⅱ型，正常生理情况下，Ⅱ型肺泡上皮细胞可以增殖分化为Ⅰ型肺泡上皮细胞并分泌大量的富含磷脂的肺表面活性剂，降低肺泡表面张力，防止肺泡塌陷，以维持肺泡壁结构的完整性［2］。

但当慢性肺损伤因素持续存在时，
Ⅱ型肺泡上皮细胞增殖和分化为Ⅰ型肺泡上皮细胞的能力明显降低，在促纤维化因子如TGF-β、IL等的作用下肺泡上皮细胞逐渐向间质细胞转化，导致上皮-间质转分化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）的产生［3］。

虽然PF的发病机制目前还不是很清楚，但大量研究表明，Ⅱ型肺泡上皮细胞发生EMT在PF的发病过程中起着重要作用［4］。

因此深入肺泡上皮细胞EMT可以为了解肺纤维化的发病机制和生物学治疗提供依据。

IL-33作为IL-1超家族的细胞因子，通过激活其受体ST2（suppression of tumorigenicity 2）而参与了心、肝、肾、肺等组织纤维化［5］。

IL-33/ST2轴不仅通过促进伤口愈合和组织修复在免疫和细胞内环境稳定中发挥关键作用，还参与了炎症和组织再生之间的失衡，导致组织纤维化的发生发展［6-7］。

前期研究发现，IL-33/ST2轴还参与了博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化，IL-33能够诱导肺泡上皮A549细胞增殖活化，导致ECM的过度沉积而促进肺纤维化的发生［8-9］。

最新的研究发现，乙肝病毒感染诱导的IL-33通过激活NF-κB信号通路而促进肝脏炎症和纤维化的发生［10］。

而Twist是一种进化上高度保守的碱性螺旋-环-螺旋转录因子超家族成员之一，具有
调控胚胎发育、诱导细胞发生EMT等功能［11］。

前期研究表明，活化的NF-κB通过激活Twist的表达不仅参与了肾小管上皮细胞EMT进程，还参与了射线诱导的肺泡上皮细胞EMT进程［12-13］。

基于以上研究背景，本研究通过体内外实验观察IL-33是否通过激活NF-κB/Twist信号通路促进Ⅱ型肺泡上皮细胞
EMT，从而进一步探讨IL-33在肺纤维化中的作用及机制，并为肺纤维化的发病机制提供依据。

1 材料与方法
1.1　材料　
1.1.1　动物与细胞　C57BL/6小鼠，体质量15~ 16 g，斯贝福（北京）生物技术有限公司，动物许可证号：SCXK（京）2019-0010。

小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞（Cat NO：CP-M003），武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.1.2　药品与试剂　注射用盐酸博莱霉素（瀚晖制药有限公司）；重组小鼠IL-33、抗小鼠IL-33抗体（美国R&D Systems公司）；SABC-AP免疫组化染色试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司）；小鼠IL-33 ELISA试剂盒、抗小鼠ST2L抗体（美国Abcam 公司）；核蛋白提取试剂盒（北京Solarbio科技有限公司）；吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（PDTC，美国Sigma 公司）；PrimeScript TM RT reagent Kit和TB Green® Pre‐mix Ex Taq TM Ⅱ（北京宝日医生物技术有限公司）；改良Masson染色试剂盒、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ及GAPDH抗体（北京Bioss公司）；E-钙黏蛋白（E-cad‐herin）、波形蛋白（Vimentin）、α-平滑肌肌动蛋白（alpha smooth muscle actin，α-SMA）、IκBα、p-IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65、Twist及Histone H3抗体（美国Santa Cruz公司）；PVDF膜和LTC化学发光液（美国Merck Millipore公司）。

1.2　方法　
1.2.1　动物实验分组与给药　C57BL/6小鼠48只，随机分为正常（Control，CON）组、博莱霉素（Bleomy‐
cin，BLM）组、BLM+IL-33（30 μg/kg）组及BLM+ Anti IL-33 Ab（100 μg/kg）组，每组各12只。

BLM （5 000 U/kg）气管注射（药物总量分2次注射，每次间隔30 min）制备肺纤维化模型。

造模后，重组IL-33和抗IL-33抗体每隔1 d腹腔注射1次，连续给药3周。

1.2.2　肺组织病理检测与胶原沉积分析　每组取小鼠4只，三溴乙醇（400 mg/kg）腹腔注射麻醉后，肺组织用10%甲醛灌流，然后取右肺，根据本课题组前期实验方法进行HE及Masson染色［14］，光镜下观察肺组织病理学变化及胶原沉积情况。

根据文献［14］以Ashcroft评分体系评价纤维化程度。

此外，根据本课题组前期研究方法［15］，Masson染色结果以
Image Pro Plus6.0软件测量并计算小鼠肺组织胶原容积分数（collagen volume fraction，CVF）：CVF（%）=蓝色胶原纤维面积/视野总面积×100%。

1.2.3　肺组织ST2L免疫组化染色　肺组织用10%甲醛灌流后，取右肺，根据SABC-AP（链霉亲和素-碱性磷酸酶）免疫组化法检测肺组织ST2L蛋白表达，ST2L一抗浓度为1∶500。

相应二抗浓度为1∶2 000。

肺组织ST2L蛋白阳性表达呈黄至棕黄色颗粒。

1.2.4　细胞实验分组　实验设Control组、IL-33（100 ng/ml）组、IL-33+二甲基亚砜（DMSO）组和IL-33+PDTC（100 μmol/L）组。

小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞计数后接种于6孔板或12孔板。

细胞先用PDTC （NF-κB抑制剂）或DMSO预处理1 h，再用IL-33处理48 h。

每组设复孔6个。

1.2.5　基因表达分析　无酶环境下提取左肺上叶和Ⅱ型肺泡上皮细胞总RNA，测定浓度后将其逆转录成cDNA。

以2 μl cDNA为模板，20 μl反应体系，用StepOnePlus TM Real-Time PCR System进行RT-qPCR 扩增。

PCR反应条件参照本课题组前期的研究结果［16］。

以GAPDH为内参，统计各组ΔΔCt值，计算相应RQ值并进行分析。

引物见表1。

1.2.6　Western blot法检测相关蛋白表达　低温条件下左肺下叶和细胞总蛋白或核蛋白，BCA法测定蛋白浓度。

参照本课题组前期的研究方法进行Western blot检测［16］。

相关蛋白一抗浓度分别为Collagen Ⅰ（1∶1 000）、Collagen Ⅲ（1∶1 000）、IL-33（1∶1 000）、ST2（1∶500）、Vimentin（1∶1 000）、E-cad‐herin（1∶500）、α-SMA（1∶2 000）、p-IκBα（1∶2 000）、IκBα（1∶2 000）、p-NF-κB p65（1∶1 000）、NF-κB p65（1∶1 000）、NF-κB p65（nucleus）（1∶1 000）、Twist（1∶1 000）及GAPDH（1∶2 000），相应二抗浓度（1∶2 000~1∶5 000）。

采用Image J 1.43软件进行灰度值测量并分析蛋白表达情况。

1.3　统计学方法　使用SPSS24.0对数据进行统计学分析。

数据以xˉ±s表示。

采用One-way ANOVA及SNK-q检验进行统计学分析。

P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果
2.1　IL-33对肺纤维化小鼠肺组织病理变化的影响　HE染色显示，CON组小鼠肺泡结构正常，未见明显的炎症细胞浸润和成纤维细胞增生。

而BLM 组肺泡萎缩、塌陷并发生融合，肺泡壁增宽增厚明显，可见炎症细胞浸润和成纤维细胞增生，Ashcroft 评分纤维化程度明显升高。

但给予外源性IL-33后，能明显加重博莱霉素诱导的肺组织病理损伤，纤维化评分进一步升高；而给予抗IL-33中和抗体后，能明显减轻博莱霉素诱导的病理损伤，纤维化评分明显降低。

见图1、表2。

2.2　IL-33对肺纤维化小鼠肺组织胶原表达的影响　Masson染色发现BLM组小鼠肺组织大量蓝色胶原纤维沉积，给予外源性IL-33后，胶原纤维沉积进一步加重，CVF进一步升高，而给予抗IL-33中和抗体后，胶原纤维沉积明显减少，CVF明显降低，见图2、表2。

RT-PCR和Western blot检测发现，BLM 组Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA和蛋白表达明显升高。

表1　RT-qPCR引物序列
Tab.1　Nucleotide sequence of primers for real-time PCR amplification
Gene
Collagen Ⅰ
CollagenⅢ
Vimentin
E-cadherin
α-SMA
GAPDH
Gen Bank No.
NM_007742.4
NM_009930.2
NM_011701.4
NM_009864.3
NM_007392.3
NM_001289726.1
Primer sequence （5′-3′）
F：TGAACGTGACCAAAAACCAA
R：GCAGAAAAGGCAGCATTAGG
F：GCACAGCAGTCCAACGTAGA
R：TCTCCAAATGGGATCTCTGG
F：ATGCTTCTCTGGCACGTCTT
R：AGCCACGCTTTCATACTGCT
F：CAAGGACAGCCTTCTTTTCG
R：TGGACTTCAGCGTCACTTTG
F：CTGACAGAGGCACCACTGAA
R：CATCTCCAGAGTCCAGCACA
F：ACCCAGAAGACTGTGGATGG
R：CACATTGGGGGTAGGAACAC
Size/
bp
176
185
206
165
160
71
与BLM组相比，外源性IL-33能够进一步上调Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA和蛋白表达，而IL-33中和抗体能够下调肺组织Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA和蛋白表达。

见图3、表3。

2.3　IL-33及ST2L蛋白表达情况　ELISA、Western blot和免疫组化结果显示，博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠血浆和肺组织IL-33及肺组织ST2L蛋白表达明显升高（P<0.05）。

给予外源性IL-33后，血浆和肺组织IL-33及肺组织ST2L蛋白表达进一步升高，而给予抗IL-33中和抗体后血浆和肺组织IL-33及肺组织ST2L蛋白表达明显降低（P<0.05）。

见图4、表4和图5。

2.4　IL-33对肺纤维化小鼠肺组织E-cadherin、Vi‐mentin 和α-SMA表达的影响　与CON组相比，BLM 能够使肺组织上皮细胞标志物E-cadherin mRNA及
蛋白表达水平明显降低而使间质细胞标志物Vi‐mentin 和α-SMA mRNA及蛋白表达水平明显升高（P<0.05）。

但与BLM组相比，外源性IL-33使得E-cadherin mRNA及蛋白表达进一步降低而使间质细胞标志物Vimentin 和α-SMA mRNA
及蛋白表达进
图3　Western blot 检测肺组织Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白表达
Fig.3　Western blot for analysis of Collagen Ⅰ and Colla⁃
gen Ⅲ
protein expressions in lung tissues
图2　小鼠肺组织Masson染色（×200）
Fig.2　Lung tissues Masson staining in mice （×200）
表2　肺组织纤维化评分及胶原容积分数（xˉ±s，n=8）
Tab.2　Fibrosis score and collagen volume fraction
（CVF） in lung tissues （xˉ±s，n=8）
Groups
CON
BLM
BLM+IL-33
BLM+Anti IL-33 Ab
Ashcroft fibrosis score
0.50±0.53
6.13±0.831）
7.38±0.742）
4.38±1.062）
CVF/%
11.59±1.49
40.44±3.681）
50.57±4.832）
30.07±2.322）
Note：Compared with CON group，1）P<0.05；compared with BLM
group， 2）P<0.
05.
图1　小鼠肺组织HE染色（×200）
Fig.1　Lung tissues HE staining in mice （×200）
表4　血浆和肺组织IL-33和ST2蛋白表达情况（xˉ±s，n=8）
Tab.4　Protein expressions of IL-33 and ST2 in plasma
and lung tissues （xˉ±s，n=8）
Groups
CON
BLM
BLM+IL-33
BLM+Anti
IL-33 Ab
IL-33 protein level
in plasma/（pg·ml−1）
301.961±72.996
659.297±110.8581）
844.039±161.1832）
503.664±43.1842）
IL-33 protein
level/GAPDH
0.235±0.062
0.666±0.1561）
0.882±0.1842）
0.435±0.1172）
ST2L protein
level/GAPDH
0.268±0.070
0.809±0.1901）
1.072±0.2242）
0.529±0.1422）
Note：Compared with CON group，1）P<0.05；compared with BLM
group， 2）P<0.
05.
图4　Western blot 检测肺组织IL-33和ST2L蛋白表达
Fig.4　Western blot for analysis of IL-33 and ST2L pro⁃
tein expression in lung tissues
表3　肺组织Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA和蛋白表达情况（xˉ±s，
n=8）
Tab.3　mRNA and protein expression of Collagen Ⅰ and
Collagen Ⅲ in lung tissues （xˉ±s，n=8）
Groups
CON
BLM
BLM+IL-33
BLM+Anti
IL-33 Ab
Collagen Ⅰ
mRNA level
1.019±0.171
3.659±0.8661）
4.663±0.9092）
2.567±0.6942）
Collagen Ⅲ
mRNA level
0.984±0.138
4.266±0.7471）
5.571±0.8182）
3.224±0.8442）
Collagen Ⅰ
protein level/
GAPDH
0.174±0.046
0.586±0.1121）
0.716±0.0832）
0.406±0.1092）
Collagen Ⅲ
protein level/
GAPDH
0.122±0.032
0.435±0.1021）
0.576±0.1202）
0.284±0.0762）
Note：Compared with CON group，1）P<0.05；compared with BLM
group， 2）P<0.
05.
图5　免疫组化检测肺组织ST2L蛋白表达
Fig.5　Immunohistochemical staining for analysis of ST2L
protein expression in lung tissues
一步升高，而抗IL -33中和抗体使得E -cadherin
mRNA 及蛋白表达明显升高而使间质细胞标志物Vimentin 和α-SMA mRNA 及蛋白表达明显降低（P <0.05）。

见表5、图6和表6。

2.5　IL -33对肺纤维化小鼠肺组织NF -κB/Twist 信号通路蛋白表达的影响　与CON 组相比，BLM 组肺组织IκBα和NF -κB p65蛋白磷酸化明显升高、细胞核内NF -κB p65和Twist 蛋白水平显著增加（P <0.05）。

与BLM 组相比，外源性IL -33使得肺组织IκBα和NF -κB p65蛋白磷酸化进一步升高、细胞核内NF -κB p65和Twist 蛋白水平进一步增加，而抗
IL -33中和抗体使得肺组织IκBα和NF -κB p65蛋白磷酸化进一步降低、细胞核内NF -κB p65和Twist 蛋白水平进一步减少（P <0.05）。

见图7和表7。

2.6　IL -33对Ⅱ型肺泡上皮细胞NF -κB/Twist 信号通路蛋白表达的影响　与Control 组相比，IL -33能够明显上调Ⅱ型肺泡上皮细胞IκBα及NF -κB p65磷酸化、增加细胞核内NF -κB p65和Twist 蛋白水平
（P <0.05）。

而NF -κB 抑制剂PDTC 能够明显抑制IL -33诱导的Ⅱ型肺泡上皮细胞IκBα、NF -κB p65磷酸化、减少NF -κB p65的核转移并降低Twist 蛋白表
达（P <0.05）。

见图8和表8。

图7　Western blot 检测肺组织I κB α、NF -κB p65蛋白磷酸化
及核内NF -κB p65、Twist 表达情况
Fig.7　Western blot for analysis of I κB α and NF -κB p65
phosphorylation in lung tissues and NF -κB p65， Twist protein levels in nuclear extracts
表6　肺组织E -cadherin 、Vimentin 和α-SMA 蛋白表达情况
（x ˉ±s ， n =8）
Tab.6　Protein expression of E -cadherin ， Vimentin and
α-SMA in lung tissues （x ˉ±s ， n =8）
Groups CON BLM
BLM+IL -33BLM+Anti IL -33 Ab E -cadherin
protein level/GAPDH 0.952±0.1320.346±0.0761）0.162±0.0322）0.533±0.1202）Vimentin
protein level/GAPDH 0.285±0.0340.598±0.1021）0.739±0.1272）0.447±0.0882）α-SMA protein level/GAPDH 0.183±0.032
1.063±0.0891）1.192±0.1452）0.558±0.0632）
Note ：Compared with CON group ， 1）P <0.05； compared with BLM
group ， 2）P <0.
05.
图6　Western blot 检测肺组织E -cadherin 、Vimentin 和
α-SMA 蛋白表达
Fig.6　Western blot for analysis of E -cadherin ， Vimentin
and α-SMA protein expressions in lung tissues
表5　肺组织E -cadherin 、Vimentin 和α-SMA mRNA 表达
情况（x ˉ±s ， n =8）
Tab.5　mRNA expressions of E -cadherin ， Vimentin and
α-SMA in lung tissues （x ˉ±s ， n =8）
Groups
CON
BLM BLM+IL -33BLM+Anti IL -33 Ab
E -cadherin
mRNA level 1.019±0.2090.501±0.1011）0.265±0.1132）0.695±0.0772）Vimentin
mRNA level 1.008±0.3183.659±0.8661）
5.163±0.7922）2.317±0.5732）α-SMA
mRNA level 1.033±0.184
7.165±0.8181）5.068±0.6222）4.104±0.4692）
Note ：Compared with CON group ，1） P <0.05； compared with BLM
group ，2） P <0.05.
表7　肺组织I κB α、NF -κB p65蛋白磷酸化及细胞核NF -κB
p65、Twist 表达情况（x ˉ±s ， n =8）
Tab.7　Protein levels of I κB α and NF -κB p65 phosphory⁃
lation in lung tissues and NF -κB p65， Twist pro⁃tein levels in nuclear extracts （x ˉ±s ， n =8）
Groups CON BLM
BLM+IL -33
BLM+Anti IL -33 Ab
p -IκBα level
in total lysate/
IκBα
0.146±0.026
0.850±0.0521）1.272±0.1452）0.447±0.0612）p -NF -κB p65 level in total
lysate/NF -κB
p65
0.192±0.032
0.762±0.0971）1.333±0.3012）0.533±0.0822）NF -κB p65 level in
nucleus/Histone H3
0.114±0.013
0.665±0.1081）0.957±0.1632）0.365±0.0622）Twist level in nucleus/
Histone H3
0.405±0.071
1.097±0.0671）1.396±0.1912）0.715±0.0872）
Note ：Compared with CON group ， 1）P <0.05； compared with BLM
group ， 2）P <0.05.
2.7　IL -33对Ⅱ型肺泡上皮细胞E -cadherin 、Vimen‐
tin 和α-SMA 表达的影响　与Control 组相比，IL -33能够明显下调Ⅱ型肺泡上皮细胞E -cadherin mRNA 及蛋白表达、显著上调Vimentin 和α-SMA mRNA 及蛋白表达（P <0.05）。

与IL -33组相比，PDTC 能够明显上调E -cadherin mRNA 及蛋白表达、显著下调Vi‐mentin 和α-SMA mRNA 及蛋白表达（P <0.05）。

见表9、图9和表10。

2.8　IL -33对Ⅱ型肺泡上皮细胞Collagen Ⅰ和Col‐lagen Ⅲ表达的影响　与Control 组相比，IL -33能够
显著上调Ⅱ型肺泡上皮细胞Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ mRNA 及蛋白表达（P <0.05）。

而与IL -33组相比，PDTC 能够明显下调Ⅱ型肺泡上皮细胞Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ mRNA 及蛋白的表达（P <0.05）。

见图10和表11。

图9　Western blot 检测Ⅱ型肺泡上皮细胞E -cadherin 、
Vimentin 和α-SMA 蛋白表达
Fig.9　Western blot for analysis of E -cadherin ， Vimentin
and α-SMA protein expression in type Ⅱ alveolar epithelial cell
表9　Ⅱ型肺泡上皮细胞E -cadherin 、Vimentin 和α-SMA
mRNA 表达情况（x ˉ±s ， n =6）
Tab.9　mRNA expressions of E -cadherin ， Vimentin and
α-SMA in type Ⅱ alveolar epithelial cell （x ˉ±s ， n =6）
Groups Control IL -33
（100 ng/ml ）IL -33+DMSO
IL -33+PDTC （100 μmol/L ）
E -cadherin
mRNA level 1.087±0.2580.349±0.1161）0.321±0.149
0.647±0.1622）Vimentin
mRNA level 1.058±0.324
6.025±0.6841）6.364±0.782
3.373±0.5332）α-SMA mRNA level
1.024±0.381
7.194±0.9481）6.838±0.999
4.454±0.9012）
Note ：Compared with Control group ，1）P <0.05； compared with IL -33
group ， 2）P <0.05.
表8　Ⅱ型肺泡上皮细胞I κB α、NF -κB p65蛋白磷酸化及细
胞核NF -κB p65、Twist 表达情况（x ˉ±s ， n =6）
Tab.8　Protein levels of I κB α and NF -κB p65 phosphory⁃
lation in type Ⅱ alveolar epithelial cell and NF -κB p65， Twist protein levels in nuclear extracts （x ˉ±s ，
n =6）
Groups Control IL -33
（100 ng/ml ）
IL -33+DMSO IL -33+PDTC
（100 μmol/L ）
p -IκBα level in total lysate/IκBα
0.110±0.018
0.975±0.0731）0.957±0.086
0.340±0.0692）p -NF -κB
p65 level in total lysate/NF -κB p650.253±0.034
0.823±0.1091）0.776±0.101
0.460±0.0722）NF -κB p65 level in
nucleus/Histone H3
0.107±0.011
0.728±0.1221）0.741±0.069
0.397±0.0232）Twist level in nucleus/
Histone H3
0.152±0.025
0.783±0.0361）
0.808±0.069
0.484±0.0452）
Note ：Compared with Control group ，1）P <0.05； compared with IL -33
group ， 2）P <0.05.
表10　Ⅱ型肺泡上皮细胞E -cadherin 、Vimentin 和α-SMA
蛋白表达情况（x ˉ±s ， n =6）
Tab.10　Protein expression of E -cadherin ， Vimentin and
α-SMA in type Ⅱ alveolar epithelial cell （x ˉ±s ， n =6）
Groups Control IL -33
（100 ng/ml ）IL -33+DMSO
IL -33+PDTC （100 μmol/L ）
E -cadherin
protein level/GAPDH 0.868±0.1040.147±0.0501）0.131±0.032
0.527±0.0712）Vimentin
protein level/GAPDH 0.304±0.0280.802±0.0811）0.788±0.062
0.441±0.0532）α-SMA
protein level/GAPDH 0.212±0.0280.712±0.0921）0.685±0.078
0.365±0.0392）
Note ：Compared with Control group ， 1）P <0.05； compared with IL -33
group ， 2）P <0.
05.
图8　Western blot 检测Ⅱ型肺泡上皮细胞I κB α、NF -κB
p65蛋白磷酸化情况及细胞核NF -κB p65、Twist 表达情况
Fig.8　Western blot for analysis of I κB α and NF -κB p65
phosphorylation in type Ⅱ alveolar epithelial cell and NF -κB p65， Twist protein levels in nuclear ex⁃tracts
3 讨论
肺纤维化是一种进行性、慢性、不可逆和致命的肺部疾病。

病理过程主要包括下呼吸道初始炎症细胞浸润、肺泡上皮细胞和血管内皮细胞损伤、持续的免疫炎症反应产生大量的细胞因子、趋化因子和生长因子，导致成纤维细胞和肌成纤维细胞数量的增加、ECM 和胶原蛋白沉积，最终导致肺结构的破坏和纤维病灶的形成
［17］。

上皮细胞在某些因
素的刺激下可失去其原有的极性，导致细胞连接和极性的丧失和上皮标志物逐渐丢失，进而分化为间充质样（成纤维细胞样）细胞并获取迁移和游走能力，其在生理特性和形态学的变化称为EMT ［18］。

近年来的研究发现，肺泡上皮细胞EMT 与肺纤维化发生发展密切相关［18］。

EMT 由多种细胞外配体调节，如TGF -β、成纤维细胞生长因子、结缔组织生长因子、白细胞介素等，这些配体与受体结合后激活细胞内信号通路，进而激活一个或多个EMT 驱动转录因子，如SNAIL1、SNAIL2、TWIST 、ZEB1和ZEB2，这些转录因子可直接或间接下调E -cadherin 表达、上调Vimentin 和α-SMA 的表达，导致EMT 的发生［19］。

IL -33在炎症性疾病中起着重要作用，在过敏性
疾病如哮喘、心血管疾病、自身免疫性疾病如类风湿关节炎和神经退行性疾病中都观察到IL -33水平升高［20］。

近些年还发现，IL -33在心、肝、肾、肺等纤维化组织中也高表达［5］。

前期研究发现，在博莱霉
素诱导的小鼠肺纤维化肺组织中，IL -33的表达明显
升高［8，21］；另外IL -33能够诱导肺泡上皮A549细胞增
殖活化，导致ECM 的过度沉积而促进肺纤维化的发生［9］。

本研究还发现，在BLM 诱导的小鼠肺纤维化模组中，血浆和肺组织IL -33的表达明显增高，肺组织胶原沉积显著增加，而外源性IL -33能够加重BLM 诱导的肺损伤、进一步增加肺组织胶原的沉积；但IL -33中和抗体却能够明显减轻BLM 诱导的肺损伤和肺组织胶原的沉积。

体外实验也发现， IL -33能够显著上调Ⅱ型肺泡上皮细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原的表达。

这些结果进一步证明了IL -33参与了肺纤维化的发生与发展，但具体机制有待进一步探究。

已知IL -33的作用是通过其受体ST2而介导的。

ST2受体包括跨膜受体ST2L 、分泌受体sST2和剪接
受体ST2V 。

其中ST2L 和sST2起主要作用。

IL -33与ST2L 结合并发挥生物学作用；然而，sST2受体激活后抑制IL -33的作用。

当IL -33与ST2L 结合时，下游信号分子如TRAF -6、NF -κB 和MAPK 被激活，诱导Th2细胞因子的产生从而在炎症过程中起重要作用［22-23］。

IL -33/ST2轴通过激活NF -κB 信号通路促进胶质母细胞瘤细胞的侵袭［24］。

乙肝病毒感染诱导的IL -33通过激活NF -κB 信号通路而促进肝脏炎症和纤维化的发生［10］。

本研究发现，在BLM 诱导的肺纤维化小鼠肺组织中ST2L 表达及IκBα、NF -κB p65蛋白磷酸化水平明显升高、NF -κB p65核转移显著增加。

外源性IL -33使得肺纤维化小鼠肺组织中ST2L 表达及IκBα、NF -κB p65蛋白磷酸化水平进一步升高、NF -κB p65核转移进一步增加，而IL -33中和抗体使得肺纤维化小鼠肺组织中ST2L 表达及IκBα、NF -κB p65蛋白磷酸化水平显著降低、NF -κB
p65核转移明显减少。

体外实验发现，IL -33能够明显上调Ⅱ型肺泡上皮细胞IκBα、NF -κB p65蛋白磷酸化水平、显著增加NF -κB p65核转移，而IL -33的这些作用能够明显被NF -κB 抑制剂PDTC 所抑制。

这些结果进一步表明了IL -33/ST2L 轴通过激活 NF -κB 信号通路而促进肺纤维化的发生。

而Twist 是一种进化上高度保守的碱性螺旋-环-螺旋转录因子超家族成员之一，具有调控胚胎发育、诱导细胞发生EMT 等功能［11］。

前期研究表明，活化的NF -
κB
图10　Western blot 检测Ⅱ型肺泡上皮细胞Collagen Ⅰ和
Collagen Ⅲ蛋白表达
Fig.10　Western blot for analysis of Collagen Ⅰ and Col⁃
lagen Ⅲ protein expressions in lung tissues
表11　Ⅱ型肺泡上皮细胞Ⅰ型和Ⅲ型胶原mRNA 和蛋白表
达的影响 （x ˉ±s ， n =6）
Tab.11　mRNA and protein expression of Collagen Ⅰand
Collagen Ⅲ in type Ⅱ alveolar epithelial cell （x ˉ±s ，
n =6）
Groups
Control IL -33
（100 ng/ml ）IL -33+DMSO IL -33+PDTC
（100 μmol/L ）
Collagen I
mRNA level
1.002±0.279
3.847±0.7141）
4.033±0.841
2.517±0.4282）Collagen Ⅲ
mRNA level
1.013±0.294
4.487±0.9501）4.343±0.875
3.210±0.7212）Collagen I protein level/GAPDH
0.166±0.027
0.615±0.0911）0.641±0.073
0.438±0.0692）Collagen Ⅲ protein level/
GAPDH
0.205±0.035
0.706±0.1141）
0.683±0.106
0.362±0.0992）
Note ：Compared with Control group ， 1）P <0.05； compared with IL -33
group ， 2）P <0.05.
通过激活Twist的表达不仅参与了肾小管上皮细胞EMT进程，还参与了射线诱导的肺泡上皮细胞EMT 进程［12-13］。

而本研究发现，在BLM诱导的肺纤维化小鼠肺组织中，伴随着Twist的高表达，肺组织上皮细胞标志物E-cadherin的表达明显降低而使间质细胞标志物Vimentin和α-SMA的表达明显升高。

外源性IL-33使得Twist的表达进一步升高、E-cadherin 的表达进一步降低而Vimentin和α-SMA的表达进一步升高，而IL-33中和抗体的作用与IL-33正好相反。

体外实验发现，IL-33能够明显上调Twist的表达，显著下调E-cadherin的表达及明显增加Vimentin和α-SMA 的表达，而NF-κB信号通路的抑制剂PDTC能够显著降低IL-33诱导的Twist的表达、明显抑制IL-33诱导的肺泡上皮细胞EMT的发生（E-cadherin表达明显上调而Vimentin和α-SMA表达显著下调）。

这些结果进一步表明了IL-33通过激活NF-κB信号通路，进而诱导Twist转录因子的表达，导致肺泡上皮细胞EMT的产生而促进肺纤维化的发生。

综上所述，IL-33通过与其ST2L受体结合后，通过激活NF-κB信号通路而上调Twist转录因子的表达，进而诱导Ⅱ型肺泡上皮细胞发生EMT而导致肺纤维化的发生发展。

因此，干预IL-33/ST2轴及其下游信号通路可以为肺纤维化的治疗提供思路，并可作为肺纤维化的潜在治疗靶点。

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［收稿 2021‐10‐12 修回 2021‐12‐14］
（编辑张晓舟）。