§9-6 吸光光度法的应用
吸光光度法的应用
bc x
△Cx
（Cx > Cs）
△C
c x c x cs
适宜 高 浓度的测定
Analytical Chemistry 分析化学
示差法的误差
方法 常规法
示差法
∵ I0 > Is
Ax bc x lg Tx d dT c Ix cx Tx ln Tx Tx I0 d cx dT Ac bc x lg Tr cx Tr ln Tx Ix Tr d c x dcx Is 有 cx cx ∴ Tr > Tx
Analytical Chemistry 分析化学
在上述实验的基础上作数据处理 对特定 pH
pH < pKa-1
Ai HR [ HR] R [R ]
b = 1 cm
C = [HR]
AHR HR C
pH > pKa+1 C = [R-] 代入，得 整理，得
AR RC
四、弱酸弱碱离解常数的测定
HR HR = H+ + RR
A
HR
R
用光度法可以测定其离解常数
HR
R
[H ][R ] Ka [HR]
[HR] pK a pH lg [R ]
[ HR] [ HR] 用吸光值表征 lg ，相对于pH作图，可求得pKa 或 [R ] [R ]
A
曲线 1 2
3 4 5 6
pH 1.10, 1.38 2.65
3.06 3.48 3.98 5.53,6.80
1
2 3 4 5 6
Aa(HL)
Ab 6
5 4 3 2 1
吸光光度
B
4 3 2 1
纯电子 跃迁
A
双原子分子能级跃迁
△E = hv = hc/λ hc/λ
吸收曲线： 吸收曲线：
将不同波长的光透过某一固定浓度和厚度有色溶 测量每一波长下有色溶液对光的吸收程度（ 液，测量每一波长下有色溶液对光的吸收程度（吸光 ），然后以波长为横坐标 然后以波长为横坐标， 度A），然后以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标作图 得一曲线
吸光光度法
9-1吸光光度法的基本原理 9-2光度计及其基本部件 9-3显色反应及显色条件的选择 9-4吸光度测量条件的选择 9-5吸光度法的应用 9-6紫外吸收光谱法简介
9-1吸光光度法的基本原理
简介： 简介： 吸光光度法： 吸光光度法： 基于物质对光的选择吸收而建立的分析方法
吸光光度法包括： 吸光光度法包括： 比色法、可见分光光度法、 比色法、可见分光光度法、紫外分光光度法
显色反应条件的选择
1.显色剂用量 1.显色剂用量
2.溶液的酸度 2.溶液的酸度 ⑴ 影响配合物的组成 ； ⑵ 影响影响显色剂的平衡浓度和颜色 ； ⑶ 影响被测离子的存在状态 ； 3.显色温度 3.显色温度 4.显色时间 4.显色时间 5.溶剂 5.溶剂
6.测定中的干扰及其消除方法 6.测定中的干扰及其消除方法
照射物质的光经单色器分光后 并非真正单色光 其波长宽度由入射狭缝的宽度 和棱镜或光栅的分辨率决定 为了保证透过光对检测器的响 应，必须保证一定的狭缝宽度 这就使分离出来的光具一定的 谱带宽度
化学因素引起的偏离 Beer定律适用的另一个前提 稀溶液浓度过高会使C 定律适用的另一个前提： Beer定律适用的另一个前提：稀溶液浓度过高会使C 与A关系偏离定律
如果样品溶液、试剂、显色剂均无色时，选溶剂作参比， ⑴ 如果样品溶液、试剂、显色剂均无色时，选溶剂作参比，称 溶剂空白” 为“溶剂空白”； 如果样品溶液有色，而试剂、显色剂无色时， ⑵ 如果样品溶液有色，而试剂、显色剂无色时，选不加显色剂 的样品溶液作参比，称为“样品空白” 的样品溶液作参比，称为“样品空白”； 如果试剂、显色剂有色，而样品溶液无色时， ⑶ 如果试剂、显色剂有色，而样品溶液无色时，选不加样品的 试剂、显色剂溶液作参比，称为“试剂空白” 试剂、显色剂溶液作参比，称为“试剂空白”。
第九章吸光光度法(简)
解 已知T=0.501，则A=－lgT=0.300，b=2.0cm,
c
25.0 10 6 g 50.0 10 3 L
5.00 10 （4 g L1)
则根据朗伯—比尔定律 A=abc，
a
A bc
0.300 2.0cm 5.00 10 4 g
L1
3.00
10 2 L.g -1.cm1
III
III 0.0006mg/mL
0.3
0.2
II
I
0.1
0.0
400
500
600
/nm
１，１０－邻二氮杂菲亚 铁溶液的吸收曲线
吸收光谱或吸收曲线
max
KMnO4溶液的吸收曲线
(cKMnO4:a<b<c<d)
KMnO4溶液
对波长525nm附近的绿 色光吸收最强，而对紫 色光吸收最弱。光吸收 程度最大处的波长叫做
实验确定 4.溶剂 5.干扰的消除
三 显色剂
1 无机显色剂：硫氰酸盐、钼酸铵等。 2 有机显色剂：种类繁多 （1）偶氮类显色剂：性质稳定、显色灵敏度高、选择 性好、对比度大，应用最广泛。偶氮胂III、PAR等。 （2）三苯甲烷类：铬天青S、二甲酚橙等
§9－4 吸光度测量条件的选择
一 选择适当的入射波长
2.由于溶液本身的原因所引起的偏离
朗伯—比尔定律是建立在 均匀、非散射的溶液这个基础 上的。如果介质不均匀，呈胶 体、乳浊、悬浮状态，则入射 光除了被吸收外，还会有反射 、散射的损失，因而实际测得 的吸光度增大，导致对朗伯— 比尔定律的偏离。
3. 溶质的离解、缔合、互变异构及化学变化
其中有色化合物的离解是偏离朗伯—比尔定律的主
吸光光度法讲解
吸光光度法讲解吸光光度法是一种广泛应用于化学分析和生物科学研究中的定量分析方法。
它通过测量样品溶液对特定波长的光的吸收程度来定量分析物质的浓度。
吸光光度法基于光的著名的“比尔-朗伯定律”，该定律描述了物质溶液对光的吸收与其浓度之间的关系。
通过测量光的吸收度，我们可以推算出浓度。
吸光光度法的基本原理是根据物质溶液对特定波长的光的吸收程度与溶液中物质的浓度之间的线性关系。
具体来说，当光通过物质溶液时，物质分子或离子会吸收光的能量，使光强度降低。
根据比尔-朗伯定律，光的吸光度（A）与物质的浓度（c）之间存在如下关系：A=εlc，其中ε是吸光度的摩尔吸光系数，l是光程长。
通过测量光的吸光度和已知的吸光度摩尔吸光系数，我们可以计算出溶液中物质的浓度。
在实践中，吸光光度法通常使用分光光度计来进行测量。
分光光度计可以发射一束特定波长的光，并测量光通过样品溶液前后的光强度差异。
这种差异可以转化为吸光度，并用于计算物质的浓度。
吸光光度法有许多应用领域。
在化学分析中，吸光光度法可以用于分析金属离子、化学物质的浓度、酸碱度等。
它可以通过配备合适的试剂和仪器来满足不同的分析需求。
在生物科学研究中，吸光光度法被广泛应用于测量DNA、蛋白质和酶的浓度。
通过测量DNA和蛋白质在特定波长下的吸光度，可以确定它们的浓度，进而研究其相互作用、结构和功能。
吸光光度法还可以用于测量酶的活性，通过测量酶和底物之间的反应，可以确定酶的催化能力。
吸光光度法有许多优点。
首先，它是一种快速、简单和经济的分析方法。
与其他方法相比，吸光光度法仪器简单、成本低，且操作方便。
其次，吸光光度法具有较高的选择性和灵敏度。
通过选择合适的波长和试剂，可以实现对特定物质的高度选择性测量。
此外，吸光光度法对微量物质的测量也非常敏感，可以达到微克或纳克级别的浓度测量。
然而，吸光光度法也存在一些限制。
首先，该方法对于有色的物质比较适用。
对于无色物质，需要经历一系列的试剂反应使其形成有色产物，才能进行吸光度测量。
吸光光度法
吸光光度法
吸光光度法是一种常用的测定物质浓度的方法，可以用于测定大多数类型的分子和复杂组
分的浓度，包括有机化合物、离子、多肽、蛋白质、糖类和脂类等等在内的任何物质。
由
于其简便快捷、测量精度高等特点，吸光光度法被广泛应用于医学、食品、农业等不同的领域。
吸光光度法的原理是：采用光谱分析仪在不同的波长处测量样品的吸收率（A），使用比
较法，对流速等因素进行校正，将样品浓度A通过比较与标准稀释溶液的浓度A0进行比较，经过校正之后，反应 concentrations of the sample （c）可求得
实验条件是，吸光光度仪在波长λ上，相同时间内，测量吸收率A，求取样品浓度c。
因此，我们可以看到，吸光光度法的测定物质浓度有许多因素影响，如流速的改变，以及
温度、pH等对测量精度的影响，都需要在实验前进行严格的控制。
只有精确掌握实验流程，能够取得更加准确的测量结果。
吸光光度法的研究取得了重要的进展，在不同领域得到广泛应用，不仅可以用于定量分析，而且可以用来分离和识别不同物质等，为科学研究和医学实验等提供了重要的支持。
吸光光度分析法范文
吸光光度分析法范文吸光光度分析法的基本原理是利用溶液对特定波长的电磁辐射的吸收特性进行分析测定。
当溶液中存在有吸收物质时，溶液对特定波长的光会发生吸收。
如果以这种吸收程度作为分析的依据，就可以通过测量光的强度来定量分析溶液中吸收物质的浓度。
吸光光度分析法的主要仪器是分光光度计。
分光光度计能够产生具有各种特定波长的光，并能测量通过溶液的光的强度。
在吸光光度分析中，通常选择目标物质在特定波长下具有最大吸光度的波长。
这个波长被称为最大吸光度波长，也是分析中的工作波长。
在进行吸光光度分析时，首先需要将样品或溶液制备成适当的浓度。
溶液的制备可以通过称取或定容的方法进行，确保所得的溶液浓度准确可靠。
然后，将样品或溶液装入分光光度计的比色皿中，调节分光光度计工作波长并进行零点校正。
接下来，测量样品或溶液的吸光度，并根据测得的吸光度值和标准曲线来确定目标物质的浓度。
在构建标准曲线时，首先需要准备一系列浓度已知的标准溶液。
这些标准溶液的浓度应覆盖待测物质的浓度范围，并按照一定比例递增。
然后，测量这些标准溶液的吸光度值，并绘制出吸光度与浓度之间的线性关系曲线。
通过测量待测溶液的吸光度值，可以通过插值或外推方法，利用标准曲线来确定其浓度。
吸光光度分析法在实际应用中有多种变体和衍生方法。
例如，可以利用多通道光电池阵列进行多波长同时测定，提高分析效率；还可以利用衍射光度法进行微量元素的定量分析；同时，还可以与其他分析方法结合，如液相色谱和气相色谱等，实现对复杂溶液中多种成分的分析。
总之，吸光光度分析法是一种简单、快速、可靠的定量分析方法，广泛应用于化学分析领域。
随着技术的不断发展，吸光光度分析法将在更多领域展现其优越性，并为科学研究和工业应用提供更多可能。
第八章 吸光光度法共42页文档
第一节 吸光光度法的基本原理
吸光光度法基于物质对光的选择性吸收而建立起来 的分析方法。
一、物质对光的选择性吸收 光是一种电磁波，具有波粒二像性。
λ= c /ν ，E =h =hc / λ
光的波长越短（频率越高），其能量越大。
波长在400~750nm范围内的光是可见光
红、橙、黄、绿、青、蓝、紫
2020/6/22
的含义
是吸光物质的浓度为1mol/L，液层厚度为1cm时的
吸光度。
可在化学手册上查到
与物质的性质、入射光波长和温度等有关
最大吸收波长λmax处的 用max表示
2020/6/22
思考？
一个未知浓度的KMnO4溶液，它的浓度可以怎 么得到？
cx Ax
εb
仪器测得
ε
AS
bcS
仪器测得 标准溶液
手册查得 手册与
变化将影响。
克 例服如办：法 用： 分光光度法测定Cr2O72-的浓度 202控0/6/2制2 合适的条件。
第二节 光度计及其基本部件
一、目视比色法 历史上最早不用仪器测量，直接用眼睛比较溶液的 颜色确定物质的含量。
测定方法： 标准系列法。
标准系列
未知样品
优点：
设备简单，不需要光学电子学仪器，不需要单色光。
二、光吸收的基本定律（朗伯-比尔定律）
1、透光率和吸光度
透光率
T 取值为0.0 % ~ 100.0 % 全部吸收 T = 0.0 % 全部透射 T = 100.0 %
吸光度 AlgT
A 取值为0 ~ +∞ 全部吸收 A = + ∞
全部透射 2020/6/22 A = 0
2、朗伯-比尔定律
吸光光度法讲解
吸光光度法讲解吸光光度法是化学分析中常用的一种分析方法，用于测定物质溶液中某种物质的浓度。
其原理是利用物质对特定波长的光吸收的特性，通过测量光的透射或反射来推算出物质的浓度。
吸光光度法的基本原理是比尔定律，即物质溶液对光的吸收与其浓度成正比。
根据比尔定律，当光通过物质溶液时，其强度将减弱，而减弱的程度与物质的浓度成正比。
比尔定律的数学表达式为：A=εlc，其中A表示吸光度，ε表示摩尔吸光系数，l表示光程长度，c表示溶液浓度。
在使用吸光光度法进行分析之前，首先需要选择适当的波长。
每种物质对光的吸收有其特定的波长范围，称为吸收峰。
选择适当的波长可以提高分析的准确性和灵敏度。
吸光光度法的实验步骤通常包括以下几个步骤：1. 准备样品：根据需要测定的物质选择相应的样品，并将其溶解在适当的溶剂中，以得到一个浓度在可测范围内的溶液。
2. 校准仪器：使用一系列已知浓度的标准溶液，通过测量它们的吸光度与浓度之间的关系，建立起一条标准曲线。
这条曲线可以用来根据样品的吸光度推算出其对应的浓度。
3. 测量样品：将校准好的仪器置于样品测量位，并使样品溶液通过光路。
根据仪器的操作方法，控制光源的强度，选择波长，并记录下通过样品溶液的光的吸收强度。
4. 计算浓度：根据标准曲线上对应的吸光度值，利用比尔定律的数学关系，计算出样品的浓度。
需要注意的是，在进行吸光光度法测量时，还需要注意以下几个因素：1. 光程长度：光程长度会直接影响到吸光度的数值。
因此，在进行测量时，要保持光程长度一致，以避免测量结果的误差。
2. 溶剂选择：溶剂选择要适合样品的性质，并且要尽量选择透明度高的溶剂，以减少光的吸收。
同时，还要注意溶剂对标准溶液的影响，以保证测量结果的准确性。
3. 波长选择：选择合适的波长可以提高分析的准确性和灵敏度。
通常情况下，选择物质的吸收峰为测量波长是一个比较好的选择。
4. 仪器校准：在进行样品测量之前，需要对仪器进行校准。
校准的目的是建立起样品吸光度与浓度之间的关系，以便后续计算浓度。
第九章 吸光光度法 (工)
12
Cr2O72-、MnO4-的吸收光谱
1.0 0.8 Absorbance 0.6
第九章 吸光光度法
9.1 9.2 9.3 9.4 9.5
吸光光度法的基本原理 光度计及其基本部件 显色反应及显色条件的选择 吸光度测量条件的选择 吸光光度法的应用
1
9.1 吸光光度法的基本原理
吸光光度法是基于被测物质的分子对光具 有选择性吸收的特性而建立起来的分析方法。
一、概述： 比色法：比较溶液颜色的深浅确定组分含量的一种 方法。
38
722型分光光度计结构方框图
光 源
分光 系统 吸收池 检测系统
39
分光光度计的主要部件
光源：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够
的光强度,稳定。
可见光区：钨灯，碘钨灯(320～2500nm) 紫外区：氢灯，氘灯(180～375nm)
单色器：将光源发出的连续光谱分解为单色光的
装置。
棱镜:玻璃350～3200nm, 石英185～4000nm 半宽度 5～10nm 光栅:波长范围宽, 色散均匀,分辨性能好, 使
6
与物质作用
电场向量 Y
Z 磁场向量 传播方向
7
微粒性 光量子，具有能量。
E h
h－普朗克(Planck)常数 6.626×10-34J· s －频率 E－光量子具有的能量
单位：J(焦耳)，eV(电子伏特)
8
波粒二象性
项目五——吸光光度法
03
吸光光度法的仪器和试剂
分光光度计
01
定义
分光光度计是分光光度法中使用的核心仪器，用于测量溶液对特定波长
的光的吸光度。
02 03
工作原理
分光光度计通过光源发出连续光谱的光，经过单色器分光后，得到特定 波长的单色光，照射到样品上，然后通过检测器检测透过样品的光强， 从而计算出样品的吸光度。
类型
常见的分光光度计有紫外-可见分光光度计、红外分光光度计等。
酶活性测定
某些酶催化的反应会产生或消耗具有 特定吸光特性的物质，利用吸光光度 法可以测定这些物质的浓度变化，从 而推算出酶的活性。
工业生产中的吸光光度法
产品质量控制
在某些工业生产过程中，产品的吸光特性与其质量密切相关。通过吸光光度法测 量产品的吸光度，可以实时监控产品质量，确保生产过程的稳定性和产品的一致 性。
通过合成具有更高选择性和灵敏度的试剂和探针，提高吸光光度法 对目标分析物的检测灵敏度。
引入多元校正技术
利用多元校正算法，消除干扰因素，提高吸光光度法在复杂样品中 的测量精度和灵敏度。
拓展应用领域和范围
环境监测领域
将吸光光度法应用于大气、水体 等环境样品的检测，实现对环境
污染物的快速、准确测定。
生物医学领域
引入人工智能、物联网等技术， 实现吸光光度法仪器的远程操控 、数据自动处理和分析等功能， 提高仪器的易用性和分析效率。
多功能集成
将多种分析方法集成到一台仪器 中，实现一台仪器同时具备多种 分析功能，提高仪器的综合性能
和应用范围。
谢谢您的聆听
THANKS
常见试剂
常见的吸光光度法试剂有显色剂、还原剂、氧化剂等。
使用注意事项
第09章吸光光度法ppt课件
2019/12/6
因实际上只能测总吸光度A总，故
A总 = lg（Ｉ0总/Ｉt总 ) = lg(I01 +Ｉ02)/(Ｉt1 +Ｉt2 ） = lg(I01 +Ｉo2)/(Ｉ01 10 -κ1bc +Ｉ02 10 -κ2bc ）
令： κ1 - κ2 = κ ； 设： Ｉ01 =Ｉ02
A总 = lg(2I01)/Ｉt1(1 +10 - κbc ）
（动画）
光源
单色器
样品室
检测器
显示
2019/12/6
9.2.2 主要部件
1. 光源
在整个紫外光区或可见光谱可以发射连续光谱， 具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿 命。
可见光区：钨灯作为 光源，其辐射波长范围在 320～2500 nm。
紫外区：氢、氘灯。 发射185～400 nm的连续 光谱。
其他
2019/12/6
特点：
(1) 具有较高的灵敏度，适用于微量组分的测定。 (2) 通常所测试液的浓度下限达10-5~10-6 mol·L-1。 (3) 吸光光度法测定的相对误差约为2%~5%。 (4) 测定迅速，仪器操作简单，价格便宜，应用广泛 (5) 几乎所有的无机物质和许多有机物质的微量成分都 能用此法进行测定。 (6) 还常用于化学平衡等的研究。
吸光光度法的应用
国家标准（GB）采用二苯碳酰二 肼分光光度法测定六价铬。
例2 维生素B6注射液的测定
维生素B6在290 ± 1 nm处有最大吸收，药典采用 紫外可见分光光度法测定维生素B6注射液。测量 在0.1 mol· -1HCl介质中进行，按 E (290 1nm) 427计 L 算维生素B6的含量。
配制三种分析浓度(c =[HB]+[B-])相等而pH不同 的溶液。
第一种溶液
pH在pKa附近，此时溶液中HB与B-共存，用1cm
的吸收池在某一定的波长下，测量其吸光度：
A AHB AB HB [ HB ] B [ B ]
A HB
K ac [ H ]c B [H ] Ka [H ] Ka
原因：示差光度法需要一个发射强度较大的光源，才能将
高浓度参比溶液的 A 调至零。
例题
1. 用一般光度法测 0.0010mol.L-1 锌标液和含锌的试 液，分别测得 As = 0.700 和 Ax =1.00，两溶液的透
光度相差多少？若用 0.0010mol.L-1锌标液作参比，
试液的A为多少？示差光度法与一般光度法相比， 读数标尺放大了多少倍？
B
AB c
推
导
将上各式整理得：
AHB A [H ] A AB A AB AHB A
Ka
pK a pH lg
上式即为用光度法测定一元弱酸解离常数的基本公式。 A为式中所示的pH时溶液的吸光度。
六、双波长分光光度法
A A1 A 2 y y x x ( A1 A1 ) A 2 A 2） （ y y ∵ A1 A 2
吸光光度法 原理及应用
第9章 吸光光度法【知识要点】1、光吸收的基本定律（1） 理论上将具有同一波长的光称为单色光，由不同波长组成的光称为复合光。
白光是可见光，它的波长范围为400～750nm ，它是由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫各种色光按一定比例混合而成。
其中各种色光的波长范围不同(称为波段)。
实际上只要将两种颜色适当的色光按一定的强度比例混合，就可形成白光，这两种色光就称为互补色光。
（2）光吸收的基本定律——郎伯-比尔定律实验证明，当一束平行单色光垂直照射某一均匀的非散射吸光物质溶液时，溶液的吸光度A 与溶液浓度C 和液层厚度b 成正比，这就是郎伯-比尔定律，其数学表达式：Kbc I I T A t==-=0lg lg 式中：I 0为入射光强度；I t 为透射光强度；T(=I t /I 0)为透射比或透光度；A 为吸光度，反应吸光物质对光的吸收程度；K 为比例常数。
注：一般来说，郎伯-比尔定律只适用于稀溶液。
（3）摩尔吸光系数和桑德尔灵敏度a 摩尔吸光系数若溶液浓度以1-⋅L mol 为单位、液层厚度以cm 为单位，则郎伯-比尔定律中的比例常数K 称为摩尔吸光系数，用符号ε表示。
郎伯-比尔定律可写成：bc A ε=式中：ε的单位为11--⋅⋅cm mol L 。
摩尔吸光系数ε是吸光物质在给定波长和溶剂下的特征常数，ε越大，表示该物质对某波长光的吸收能力越强，测定方法的灵敏度也就越高b 桑德尔灵敏度（用S 表示）它是指在一定的波长下，测得的吸光度A=0.001时，1cm 2截面积内所含的吸光物质的质量，其单位为.2-⋅cm g μ经推导可得εMS =（.2-⋅cm g μ） 2、分光光度计及吸收光谱（1）分光光度计的基本结构由五部分组成：光源、单色器、吸收池、检测器及数据处理装置各部分的作用及性能如下：光源的作用是提供所需波长范围内的连续光，光源要有足够的光强度和稳定性。
可见分光光度计的光源多属热光源，如钨灯。
单色器的作用是将光源发出的连续光谱分解为单色光。
§9-6 吸光光度法的应用
§9-6 吸光光度法的应用
吸光度差与这两种溶液的浓度差成正比。以把空 白溶液作为参比的稀溶液的标准曲线作为ΔA和Δc的标 准曲线，根据测得的ΔA求出相应的Δc值，从cx=co+c可 求出待测试液的浓度，这就是示差吸光光度法定量的 基本原理。
Hale Waihona Puke Ax cxbA0 c0b
A相对 A Ax A0 b(cx c0 ) bc bc相对
§9-6 吸光光度法的应用
1 示差吸光光度法（differential）
（1）示差吸光光度法的原理 吸光光度法一般仅适用于微量组分的测定，当待 测定组分浓度过高或过低，会引起很大的测量误差， 导致准确度降低。示差吸光光度法可克服这一缺点。 目前，主要有高浓度示差吸光光度法、低浓度示差吸 光光度法和使用两个参比溶液的精密示差吸光光度法。 它们的基本原理相同，且以高浓度示差吸光光度法应 用最多，仅介绍高浓度示差吸光光度法。
§9-6 吸光光度法的应用
4 络合物组成的测定
（2）连续变化法(又称等摩尔系列法)
cM+cR=c，改变 cM和cR的相对量，
配制一系列溶液，在有色络合 物的最大吸收波长处测量这一 系列溶液的吸光度。当溶液中 络合物MRn 浓度最大时， cR/cM 比值为n。 当 cM/c为0.5时，络 合比为1:1；当 cM/c 为0.33， 络合比为1:2；当 cM/c=0.25时， 络合比为1:3。
连续变化法
§9-6 吸光光度法的应用
3 弱酸和弱碱解离常数的测定
HB==H++B-
( AHB A) pKa lg pH ( A AB )
作图法求pKa
§9-6 吸光光度法的应用
4 络合物组成的测定
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* 混浊试液中组分测定 ：一般选择待测组分的最大 吸收波长为测量波长(λl)，选择与其相近而两波长相 差在40~60 nm范围内且有较大的ΔA值的波长为参比波 长。 * 单组分的测定 ：进行单组分的测定，以配合物吸 收峰作测量波长，参比波长的选择有：以等吸收点为 参比波长; 以有色络合物吸收曲线下端的某一波长作 为参比波长；以显色剂的吸收峰为参比波长。
§9-6 吸光光度法的应用
1 示差吸光光度法（differential）
（1）示差吸光光度法的原理 吸光光度法一般仅适用于微量组分的测定，当待 测定组分浓度过高或过低，会引起很大的测量误差， 导致准确度降低。示差吸光光度法可克服这一缺点。 目前，主要有高浓度示差吸光光度法、低浓度示差吸 光光度法和使用两个参比溶液的精密示差吸光光度法。 它们的基本原理相同，且以高浓度示差吸光光度法应 用最多，仅介绍高浓度示差吸光光度法。
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2 双波长吸光光度法（dual-wavelength）
（1）双波长吸光光度法的原理 使两束不同波长的单色光以一定的时间间 隔交替地照射同一吸收池，测量并记录两者吸 光度的差值。这样就可以从分析波长的信号中 扣除来自参比波长的信号，消除各种干扰，得 待测组分的含量。分析方法的灵敏度、选择性 及测量的精密度高。被广泛用于环境试样及生 物试样的分析。
连续变化法
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苯酚的测定
测定苯酚(X)与2，4， 6-三氯苯酚(Y)混合物中的 苯酚时就可用这种方法。 当选择λ2为测量波长，三 氯苯酚在此波长处也有较 大吸收，产生干扰。选择 波长λ1或λ1‘（等吸收点） 作为参比波长，则可以消 除三氯苯酚对苯酚测定的 干扰。
用等吸收法选择波长组合 X. 苯酚 Y. 2,4,6-三氯苯酚
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吸光度差与这两种溶液的浓度差成正比。以把空 白溶液作为参比的稀溶液的标准曲线作为ΔA和Δc的标 准曲线，根据测得的ΔA求出相应的Δc值，从cx=co+c可 求出待测试液的浓度，这就是示差吸光光度法定量的 基本原理。
Ax cxb
A0 c0b
A相对 A Ax A0 b(cx c0 ) bc bc相对
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3 弱酸和弱碱解离常数的测定
HB==H++B-
( AHB A) pKa lg pH ( A AB )
作图法求pKa
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4 络合物组成的测定
饱和法
（1）饱和法(又称摩尔比法)固定一种组分(通常 是金属离子M)的浓度，改变络合剂(R)的浓度，得 到一系列[R]/[M]比值不同的溶液，并配制相应的 试剂空白作参比液，分别测定其吸光度。以吸光 度A为纵坐标，[R]/[M]为横坐标作图。
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（2）示差吸光光度法的误差
Δc(即cx－co)，测量误差为x%，结果为cx±(cx-co)· x%； 普通光度法的结果为cx±cx· x%。因cx只是稍大于co，故 cx 总是远大于Δc，故示差吸光光度法的准确度高。参 比溶液的浓度越接近待测试液的浓度，测量误差越小， 最小误差可达0.3%。
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4 络合物组成的测定
（2）连续变化法(又称等摩尔系列法)
cM+cR=c，改变 cM和cR的相对量，
配制一系列溶液，在有色络合 物的最大吸大时， cR/cM 比值为n。 当 cM/c为0.5时，络 合比为1:1；当 cM/c 为0.33， 络合比为1:2；当 cM/c=0.25时， 络合比为1:3。
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* 两组分共存时的分别测定：当两种组分的吸收光 谱有重叠时，要测定其中一个组分就必须消除另一 组分的光吸收。对于相互干扰的双组分体系，它们 的吸收光谱重叠，选择参比波长和测定波长的条件 是:待测组分在两波长处的吸光度之差ΔA要足够大， 干扰组分在两波长处的吸光度应相等，这样用双波 长法测得的吸光度差只与待测组分的浓度成线性关 系，与干扰组分无关，从而消除了干扰。
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ΔA 与吸光物质浓度成正比。这是定量的理论依 据。只用一个吸收池，以试液本身对某一波长的光的 吸光度为参比，消除了因试液与参比液及两个吸收池 之间的差异引起的测量误差，提高测量的准确度。
A A1 A2 ( 1 2 )bc
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