[终稿]铵态氮（靛酚蓝比色法）

铵态氮（靛酚蓝比色法）
方法与原理：
土壤浸出液中的NH4+在强碱性介质中与次氯酸盐和苯酚作用，生成水溶性染料靛酚蓝,溶液的蓝色很稳定，在NH4+-N浓度为0.05—0.5mg.L-1范围内，其深浅与NH4+-N含量呈正比.
试剂：
1.酚溶液：10g苯酚和100mg(0.1g)硝普钠（剧毒）【Na2Fe(CN)5·2H2O】→1L
水暗瓶存于4℃冰箱
2.次氯酸钠碱性溶液：10gNaOH,7.06gNa2HPO4·7H2O,31.8g Na3PO4·12H2O
和10 ml次氯酸钠【w(NaOCl)=5.25%】→1L水中暗瓶存于4℃冰箱
3.掩蔽剂:①酒石酸钾钠溶液【ρ（KNaC4H4O6·4H2O）】=400 g.l-1与EDTA二
钠盐溶液【C10H14O8N2Na2】100 g.l-1等体积混合.每100 ml混合液加入0.5 mlNaOH溶液（10mol/L）,即得清亮的掩蔽剂②酒石酸钾钠
【KNaC4H4O6·4H2O】400g↓EDTA二钠盐【C10H14O8N2Na2·2H2O】110.7 g稀释至2L. 每100 ml混合液加入0.5 mlNaOH溶液（10mol/L）,即得清亮的掩蔽剂
4.【ρ（NaOH）】=10 mol.l-1 ：400g NaOH用蒸馏水定容至1L
5.NH4+-N标准液：0.4717g烘干的（NH4）2SO4→1L水中(定容) 此为NH4+-N
贮备标准液。

测定当天将此液用蒸馏水水准确稀释20倍（如5ml稀释至100ml）即为NH4+-N标准液【ρ（NH4+-N）=5 mg.l-1】
操作步骤：
1．土壤30g 置于150ml三角瓶中加入100 ml 2M KCl浸提，振荡(140rpm)30min 过滤（约30ml以上滤液）
2．10 ml样液于50ml容量瓶+约20 ml水+5 ml酚+5 ml NaOCl
摇匀，在20℃左右置1小时↓1ml掩蔽剂以溶解沉淀物定容50 ml λ=625nm 比色
3．0/0.5/1/2/3/4/5ml NH4+-N标准液于50ml容量瓶+10 ml KCl+约20 ml水+5 ml 酚+5 ml NaOCl
摇匀，在20℃左右置1小时后加入1ml掩蔽剂以溶解沉淀物定容50 ml λ
=625nm比色
注意事项:掩蔽剂应在显色后加入，加入过早，会使显色很慢。

加入过晚，易生成氢氧化物沉淀可能老化而不易分解，20℃左右置1小时即可加入掩蔽剂
0 ml 0.5 ml 1 ml 2 ml 3ml 4 ml 5ml
↓
0 mg.L-10.05 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5计算结果：ρ*V*ts*10-3
W（N）=———m———*1000
W（N）----土壤中铵态氮（NH4+-N）的质量分数，mg.kg-1
ρ-----从工作曲线中查的显色液中氮的浓度，mg.l-1
V-----显色液体积，ml（50 ml容量瓶）
ts----分取倍数（100/10）
10-3----将ml换算成L的系数
m-----土壤质量，g
1000----换算成每kg土含量
实验内容四：土壤微生物DNA的提取及鉴定（8学时）
1．称土样约0.3g于2ml离心管中，加入1.5ml溶菌酶液（解冻2小时，夏天），混合均匀，并在37℃水浴锅中放置1h，每10min轻轻的摇匀一次，上下颠倒30下左右（拿出pro-k解冻）
2．接着在液氮中放置4min（或高速振荡器6000rpm，45s）和65℃水浴锅中放
置3min，循环3次
3．冷却至室温后，加入15ul pro-k（分装20ul，应先在振荡器振荡一下，再short 一下）和75ul 10% SDS，55-60℃下培养1h，6000rp m离心5min
4．切掉枪头的tip尖端，提取上清液于10ml的离心管中，沉淀再用0.5ml溶菌酶液和0.5ml 0.5% SDS洗涤一次，6000rpm离心5min，提取上清液（0.5ml 0.5% SDS=25ul 10% SDS+475ul纯水）
5．然后往离心管中加入等体积（约2.5ml）tris-饱和酚抽提一次，12000rpm离心10min，提上清液
6．加入等体积tris-饱和酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）抽提一次，12000rpm离心10min，提上清液
7．加入等体积氯仿：异戊醇（24:1）抽提两次，12000rpm离心10min，提上清液
8．将上清液分装于2-3管2ml离心管中，分别加入0.25倍体积的3M乙酸钠，2倍体积的无水乙醇，于-20℃过夜沉淀
9．然后在室温下12000rpm离心10min，去上液
10. 沉淀用1ml 70%乙醇洗涤两次，12000rp m离心10min，去上液
11. 无水乙醇洗涤一次，12000rpm离心10min，去上液，倒置于吸水纸上，在超净工作台下吹干5min
12. 重悬于50ul TE中，样品在-20℃冰箱中保存。

13.DNA的检测：5ulDNA样品+1ul loading buffer，1%琼脂糖凝胶电泳
120V,40min，最左边点Marker（样品DNA长度约为20kb），电泳结束后照胶仪下观察。