上海市腹泻病监测技术方案2

上海市腹泻病监测的实验室检测标准操作程序
第一部细菌学检测的技术方案
一）霍乱弧菌检测操作程序
1.标本检测流程图：
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2. 操作步骤：
2.1 增菌：用无菌拭子采集少量粪便（约0.5g），放入碱性蛋白胨水（APW）培养基中36±1℃增菌6-8h。

2.2分离及二次增菌：增菌后从菌液生长最茂盛的菌膜下表层，取一接种环，划线接种于双洗平板，TCBS或弧菌显色平板。

37℃培养18～24h后，选择单菌落做血清凝集实验。

标本含菌量少时，为提高检出率，实行2次增菌，取第1次碱胨水增菌6h～8h的培养物的表层液0.1mL～0.2mL，接种于8mL～10mL的碱胨水中，37℃培养6h～8h再做分离。

2.3血清学鉴定：从平板上挑取可疑菌落5-10个。

双洗平板上为湿润、黑芯、光滑菌落。

TCBS上为黄色发亮、表面光滑、稍凸起的菌落。

弧菌显色平板上为蓝
色，菌落中心略有凹陷的菌落（注意该平板上可疑菌落易发生自凝）。

取少许培养物（TCBS和弧菌显色平板上的疑似菌落需转种到营养琼脂小斜面或非选择性平板后进行血清学鉴定）与O1群+O139群霍乱多价诊断血作玻片凝集试验，如很快出现肉眼可见的明显凝集即为阳性反应，阳性者必须用生理盐水按同样方法作对照试验，以排除因自身凝集而导致的假阳性反应。

并继续用小川和稻叶单价血清分型。

对O1群不凝集的可疑菌落，再用O139群诊断血清作玻片凝集。

2.4生化鉴定：在双洗平板、TCBS琼脂或弧菌显色平板上的疑似菌落转种在普通琼脂平板上，选取单菌落做生化初筛，选择单菌落做KIA和MIU实验。

进一步生化鉴定选用梅里埃生化检测卡（API20E或API20NE），或全自动生化鉴定仪鉴定。

具体操作按产品操作说明。

2.5 PCR检测：可使用商品化的试剂盒或按照合成引物及探针后进行PCR检测。

2.5.1 O1和O139双重实时PCR验证检测，引物和探针序列见表1和表2：
表2 O1和O139双重实时荧光PCR检测的引物及探针
引物名称核苷酸序列（5’～3’）产物长度
（bp）
O1 F GGAATAACTCAAGGCGATGAAGTG 117
O1 R TAGAGACTCACCTTCGATTTCAGC
O1 P FAM-AAACGGGTAACGCACCACACTGGACT-BHQ1
O139 F CGATGGCGTGTTCATTAGAAGG 104
O139 R TCCCTTTCCACCTCGGTATTTC
O139 P HEX-CGGCAAACTGGCAGCAAACTCAGCA-BHQ1
反应体系和反应条件为：20μL反应体系，2×PCR buffer 10μL , O1 rfb基因上下游引物（10μmol/L）各0.4μL，探针（10μmol/L）0.4μL；O139 rfb基因上下游引物（10μmol/L）各0.4μL，探针（10μmol/L）0.4μL；去离子水5.6μL，DNA模板2μL。

循环条件为：95℃ 30s, 95℃ 5s和60℃ 20s 循环40次，在退火阶段检测荧光。

2.5.2霍乱弧菌毒素基因（ctx）检测，见表2：
表2 ctx毒素基因的荧光PCR检测的引物及探针
引物名称核苷酸序列（5’～3’）产物长
度（bp）CT1 F CTTCCCTCCAAGCTCTATGCTC 114
CT1 R TACATCGTAATAGGGGCTACAGAG
CT1 P FAM-ACCTGCCAATCCATAACCATCTGCTGCTG
-BHQ1
反应体系和反应条件为：20μL反应体系，2×PCR buffer 10μL ,上下游引物（10μmol/L）各0.4μL，探针（10μmol/L）0.4μL；去离子水6.8μL，DNA模板2μL。

循环条件为：95℃ 30s, 95℃ 5s和60℃ 20s 循环40次，在退火阶段检测荧光。

3.报告结果及上送菌种：报告粪便标本中检出霍乱弧菌，保存并上送菌种。

二）沙门菌检测操作程序
1．标本检测流程图：
2. 操作步骤：
2.1 增菌：用无菌拭子采集少量粪便（约0.5g），放入SBG增菌培养基中36±1℃增菌18-24h。

2.2分离：取增菌培养液一环接种沙门菌显色培养基上36±1℃培养过夜；
2.3挑取可疑菌落：挑取可疑菌落（如科玛嘉沙门菌显色平板上，目标菌落紫色、淡紫色菌落；SS平板上周边无色透明、中心黑色菌落）转种双管糖或其他生化筛选培养基（如KIA、MIU），36±1℃培养过夜；
2.4生化初筛：挑取双糖管结果为发酵葡萄糖产酸、产气，甘露醇+，尿素－，H2S+/－，动力+，靛基质－，蔗糖－的反应管菌株，或KIA、MIU的生化结果为K/A,产气+，H2S+/－，动力+，靛基质－，尿素－的反应管菌株转种于哥伦比亚琼脂平板及营养琼脂小斜面，分别进行血清学鉴定及生化鉴定。

2.5血清学鉴定：凡生化初筛结果符合沙门菌属的可疑菌株以沙门菌属诊断血清内作玻片凝集试验。

(1)用O多价诊断血清作玻片凝集试验，同时用生理盐水作对照。

多价凝集者用O单价诊断血清分别进行凝集。

完成O抗原的鉴定后，先用H多价作凝集试验，
如有一种或两种多价诊断血清凝集，再用这种多价血清的各种H因子诊断血清检查以确定第1相和第2相的H抗原（必要时需要进行H相的诱导）。

(2)查阅沙门菌血清分型表，报告血清式。

推荐使用规范格式的沙门菌血清型的中英文报告方式。

2.6生化试验：选取API 20 E或微生物自动鉴定系统进行鉴定。

具体操作按产品操作说明。

3.报告结果及上送菌种：综合生化及血清学鉴定结果，报告粪便标本中检出沙门菌名称，保存并上送菌种。

三）志贺菌检测操作程序
1．标本检测流程图：
2.操作步骤：
2.1分离：用无菌拭子采集少量粪便（约0.5g），直接在XLD一区涂抹后进行划线分离，于36±1℃培养过夜。

2.2挑取可疑菌落：从37℃培养18 h～24 h的分离培养基上，观察挑选可疑菌落3-5个，在XLD或MAC平板上其形态为无色，透明或半透明，圆形，湿润、光滑、突起，接种双管糖或其他生化筛选培养基（KIA、MIU），36±1℃培养过夜。

2.3生化初筛：志贺菌属在双管糖的生化反应为：发酵葡萄糖产酸，不产气，甘露醇+/－，尿素－，H2S－，动力－，靛基质+/－，蔗糖－。

或在KIA、MIU的生化结果为K/A，产气－，H2S－，动力－，靛基质+/－，尿素－的反应管菌株。

福氏志贺菌6型在上两种培养基上有时可产生少量气体。

2.4血清学鉴定：凡生化初筛结果符合-志贺菌属的可疑菌株以志贺菌属诊断血清内作玻片凝集试验。

查阅其血清分型表，报告最终血清型。

2.5生化试验：选取API 20 E或微生物自动鉴定系统进行鉴定，具体操作按产品操作说明。

在必要时需进行其他补充生化反应。

应符合表3所列的生化特性。

3.报告结果及上送菌种：综合生化及血清学鉴定结果，报告粪便标本中检出志贺菌。

保存并上送菌种。

表3 志贺菌属的生化特性
四）副溶血弧菌检测操作程序
1.标本检测流程图：
2.操作步骤
2.1分离：用无菌拭子采集少量粪便（约0.5g），直接在TCBS一区涂抹后进行划线分离，于36±1℃培养过夜。

2.2增菌：用无菌拭子采集少量粪便后转种至8mL～10mL氯化钠结晶紫培养液或碱性蛋白胨水（APW）中。

37℃培养6h-8h后，取一接种环，划线接种于TCBS 平板，于37℃培养18h-24h后观察有无可疑菌落。

2.3挑选可疑菌落及生化初筛：挑取TCBS上绿色、中等大小的可疑菌落，或弧菌显色平板上紫色、中等大小菌落做生化初筛实验。

如KIA和MIU实验，可疑菌落在KIA、MIU的生化结果为K/A,产气-，H2S －，动力+，靛基质+，尿素－。

并可进行氧化酶实验，若为阳性，继续做系统生化实验。

3．生化鉴定：选用梅里埃生化检测卡（API20E或API20NE），或全自动生化鉴定仪鉴定。

具体操作按产品操作说明。

4.报告结果及上送菌种：综合生化鉴定结果，报告粪便标本中检出副溶血弧菌。

五）致泻性大肠埃希菌检测操作程序
1.标本检测流程图：
2.操作步骤
2.1分离：用无菌拭子采集少量粪便（约0.5g），直接在MAC平板上一区涂抹后进行划线分离，于36±1℃培养过夜。

2.2增菌：对于EHEC O157:H7的检测需先进行增菌，用无菌拭子采集少量粪便（约0.5g）后转种至8mL～10mLmEC肉汤增菌液37℃增菌6h后，取1mL用O157免疫磁珠进行富集后，接种于O157显色平板或山梨醇麦康凯平板进行划线分离，于37℃培养18h-24h后观察有无可疑菌落。

2.3挑取可疑菌落：挑取麦康凯平板（MAC）上发酵乳糖的桃红色、不透明的可疑菌落，或O157显色平板上紫红色或淡紫色、中等大小菌落，或山梨醇麦康凯平板上不发酵山梨醇的乳白色菌落进行生化初筛实验。

2.4生化初筛：可疑菌落的双糖管结果为发酵葡萄糖产酸、产气，甘露醇+，尿素－，H2S －，动力+/－，靛基质+，蔗糖－/+的反应管菌株，或KIA、MIU的生
化结果为A/A,产气+，H2S－，动力+/－，靛基质+，尿素－。

2.5PCR毒力检测：致泻性大肠杆菌（EPEC、ETEC、EIEC、EHEC、EAggEC）的毒力基因及EHEC O157的菌体、鞭毛抗原的基因检测，可使用商品化的试剂盒或参考《感染性腹泻诊断标准》WS 271-2007中的引物序列及反应条件。

2.6血清学鉴定：凡生化初筛结果符合的可疑菌株以大肠埃希菌属诊断血清（包括O多价及单价，H抗原）作玻片凝集试验。

报告最终血清型。

2.7系统生化鉴定：选用梅里埃生化检测卡（API20E），或全自动生化鉴定仪鉴定。

具体操作按产品操作说明。

3.报告结果及上送菌种：综合血清学，生化鉴定及PCR检测结果，报告粪便标本中检出致泻性大肠埃希菌的类型及血清型。

保存并上送菌种。

六）小肠结肠炎耶尔森菌检测操作程序1.标本检测流程图：
2. 操作步骤：
2.1直接分离：用无菌拭子采集少量粪便（约0.5g），直接划线接种于耶尔森菌选择性平板，25℃培养48h。

2.2增菌培养：取1g粪便标本接种于10ml改良PBS增菌培养液中，置于4℃冷增菌。

在冷增菌的第7、14、21天划线接种于耶尔森选择性平板，25℃培养48h。

2.3挑取可疑菌落：在耶尔森菌选择性培养基上25℃培养48小时，可疑菌落为较小的湿润菌落，直径约1～2mm。

中心呈深玫瑰红色，凸起较尖锐，周围有明显透明环，称“公牛眼”。

从选择性培养基上挑取5个可疑菌落进行生化初筛。

2.4生化鉴定：
2.4.1糖分解试验挑取可疑菌落接种改良克氏双糖斜面（用甘露醇取代乳糖），25℃培养24h-48h。

挑选斜边/底层均变为黄色（A/A），不产H2S，不产气（可能有微量气体，小泡，但不会将培养基顶裂或顶起）的菌株进一步鉴定。

注意：在斜面上划线不要过稀，菌量太少不利于下一步接种Rustigian尿素培养基。

2.4.2尿素分解试验刮取斜面上大量菌苔，浓厚接种于Rustigian尿素培养基，震荡均匀，25℃培养2h-4h，变红色者为尿素酶阳性，进一步检测动力。

菌量少及其他未变色的菌株观察至24h。

2.4.3动力试验将尿素酶阳性菌株接种于2管半固体，分别置于25℃与37℃培养24h。

选取25℃动力（+）且37℃动力（-）的菌株，进行系统生化鉴定。

2.4.4系统生化鉴定挑取上述可疑的菌落直接用Api20E鉴定板条进行系统生化鉴定，确定菌株种属。

典型的生化反应见图1。

图1小肠结肠炎耶尔森菌Api20E板条的典型生化反应
2.5血清学鉴定使用致病性菌株常见血清型（我国一般为O:3、O:8、O:9型）的特异性单克隆抗体进行玻片凝集，从而进行进一步鉴定和血清分型。

3.报告结果：综合血清学及生化鉴定结果，报告粪便标本中检出小肠结肠炎耶尔森菌。

保存并上送菌种。

六）空肠弯曲菌检测操作程序
1. 标本检测流程图：
2．操作步骤
2.1分离培养：用无菌拭子采集少量粪便（0.5g-1g）混悬于1ml生理盐水,取约200微升滴加到放置在血平板上的0.45微米孔径的滤膜上，室温或37℃放置30min-45min后，去滤膜。

将平板倒置后42℃微需氧（85% N2，10% CO2，5% O2混合气体培养箱或者使用密闭容器如强塑厌氧盒，放入适量的微需氧产气袋）培养，2-3天后开始观察菌落形态，连续培养7～10天仍无疑似菌落才可丢弃初次分离平皿。

2.2鉴定
2.2.1形态鉴定：菌落形态鉴定：初次分离培养2-3天，血平板上的菌落不溶血，扁平、湿润、有光泽，看上去像水滴，直径为1～2mm，边缘完整、发亮，5-6天后菌落增大，颜色变灰白，扁平，菌落不溶血。

革兰氏染色镜检：空肠弯曲菌为革兰氏染色阴性菌，镜下呈弧形，S形或螺旋状弯曲杆菌。

2.2.2生化鉴定对于空肠弯曲菌的生化鉴定首先进行氧化酶和触酶检测，氧化酶和触酶阳性者进行马尿酸盐水解试验检测空肠弯曲菌特异的马尿酸水解酶基因的活性。

空肠/结肠弯曲菌的生物化学鉴定结果解读见表4：
表4空肠弯曲菌/大肠弯曲菌生化鉴别特征
生化反应项目空肠弯曲菌结肠弯曲菌
氧化酶试验+ +
过氧化氢酶试验+ +
马尿酸盐水解试验+ -
2.2.3 PCR鉴定：可选用商品化的PCR试剂盒或合成引物进行PCR检测。

利用多重PCR方法扩增空肠弯曲菌、结肠弯曲菌特异基因，PCR引物序列和产物大小见表5，PCR扩增图片见图2。

PCR鉴定既可以进行多重PCR鉴定，同时可以分为两组：空肠（16S rRNA+MapA基因），结肠（16S rRNA+CeuE基因）分别进行PCR，根据产物片段大小鉴定。

3.报告结果：综合血清学，生化鉴定及PCR结果，报告粪便标本中检出空肠弯曲菌。

保存并上送菌种。