大肠杆菌脂多糖诱导人乳牙牙周膜干细胞炎症模型的建立
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本研究采用大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ，Ｅ．ｃｏｌｉ） ＬＰＳ刺 激 体 外 培 养 人 乳 牙 牙 周 膜 干 细 胞 （ｈｕｍａｎ ｄｅｃｉｄｕｏｕｓｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｃｅｌｌｓ，ｈｄＰＤＬＳＣｓ），通 过检测细胞活性及炎症因子表达，选择合适的 Ｅ． ｃｏｌｉＬＰＳ浓度，以建立符合实验设计需要的人乳牙根 尖周炎细胞模型。
拔牙前使用碘伏消毒牙冠及牙龈 ２－３次，患牙 拔除后转移至超净台，取根中 １／３的牙周膜，Ⅰ型胶 原酶及中性酶 ３７℃消化 ４０ｍｉｎ，加入含 ２０％胎牛 血清的 αＭＥＭ培养基终止消化。原代细胞长出后
进行首次换液，之后 ２－３ｄ换液一次。当细胞增殖 至培养瓶底壁约 ７０％时进行传代。取第 ３代细胞 采用连续梯度稀释法进行纯化。 １３ 细胞表面标记物检测
取第 ４代 ｈｄＰＤＬＳＣｓ以 ２０００／孔的浓度接种 ９６ 孔板，２４ｈ后替换含不同终浓度的 Ｅ．ｃｏｌｉＬＰＳ（０， ０１，００７５，００５，００２５，００１μｇ／ｍｌ）培 养 基，其 中 ０μｇ／ｍｌ为对照组。分别培养 ２４，４８，７２ｈ后以 １∶１０ 的 Ｃห้องสมุดไป่ตู้Ｋ８溶液替换原液。３７℃孵育 ２ｈ后酶标仪 检测 ４５０ｎｍ 波 长 处 吸 光 度 （ｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙ，ＯＤ 值）。空白对照组为不含 ＬＰＳ的同种培养基，每组 设 ５个复孔，绘制细胞生长曲线图。 １６ 实时定量 ＰＣＲ（ｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ，ＲＴＰＣＲ）检测 炎性因子 ＩＬ１β、ＩＬ６、ＴＮＦα的 ｍＲＮＡ表达
将第 ４代对数期细胞采用成骨诱导液（含 １０％ 胎牛 血 清 的 αＭＥＭ 培 养 基、地 塞 米 松 １０ｍｏｌ／Ｌ、 Ｌ－抗坏血酸 ５０μｇ／ｍｌ、β－甘油磷酸钠 １０ｍｍｏｌ／Ｌ） 培养 ２８ｄ后，进行茜素红染色；采用成脂诱导液（含 １０％ 胎 牛 血 清 的 αＭＥＭ 培 养 基、地 塞 米 松 ０２５ μｍｏｌ／Ｌ、吲哚美辛 １０μｍｏｌ／Ｌ、３－异丁基 －１－甲基 黄嘌呤 ０５ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｌ－抗坏血酸 ２－磷酸盐 １００ μｍｏｌ／Ｌ）培养 ２８ｄ后，进行油红 Ｏ染色。 １５ ＣＣＫ８检测 Ｅ．ｃｏｌｉＬＰＳ处理后 ｈｄＰＤＬＳＣｓ增 殖活性
山西医科大学学报，２０２１年 ６月，第 ５２卷 第 ６期
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大肠杆菌脂多糖诱导人乳牙牙周膜干细胞炎症模型的建立
刘 飞１，２，池 韵１，３＃，李锦沂１，２，王盼曦１，２，杨克宇１，２，郭青玉１，２ （１西安交通大学口腔医院，陕西省颅颌面精准医学
研究重点实验室，西安 ７１０００４；２西安交通大学口腔医院儿童口腔科；３浙江大学医学院附属邵逸夫医院口腔科；＃共同第一作 者；通讯作者，Ｅｍａｉｌ：ｇｕｏｑｉｎｙｕ＠ｍａｉｌ．ｘｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ）
中图分类号： Ｒ７８１ 文献标志码： Ａ 文章编号： １００７－６６１１（２０２１）０６－０７４１－０７ ＤＯＩ：１０．１３７５３／ｊ．ｉｓｓｎ．１００７－６６１１．２０２１．０６．０１４
Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｍｏｄｅｌｏｆｈｕｍａｎｄｅｃｉｄｕｏｕｓｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｌｉｐｏｐｏ ｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ＬＩＵＦｅｉ１，２，ＣＨＩＹｕｎ１，３＃，ＬＩＪｉｎｙｉ１，２，ＷＡＮＧ Ｐａｎｘｉ１，２，ＹＡＮＧ Ｋｅｙｕ１，２，ＧＵＯ Ｑｉｎｇｙｕ１，２ （１ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＳｈａａｎｘｉＰｒｏｖｉｎｃｅｆｏｒ ＣｒａｎｉｏｆａｃｉａｌＰｒｅｃｉｓｉｏｎＭｅｄｉｃｉｎｅＲｅｓｅａｒｃｈ，ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＳｔｏｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｘｉ’ａｎＪｉａｏｔｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ’ａｎ７１０００４，Ｃｈｉｎａ；２ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｅ ｄｉａｔｒｉｃＤｅｎｔｉｓｔｒｙ，ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＳｔｏｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｘｉ’ａｎＪｉａｏｔｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；３ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＤｅｎｔｉｓｔｒｙ，ＳｉｒＲｕｎＲｕｎＳｈａｗＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｃｈｏｏｌｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＺｈｅｊｉａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；＃Ｃｏｆｉｒｓｔａｕｔｈｏｒ；Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，Ｅｍａｉｌ：ｇｕｏｑｉｎｙｕ＠ｍａｉｌ．ｘｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ） Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｍｏｄｅｌｏｆｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｏｆｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎｄｅｃｉｄｕｏｕｓｔｅｅｔｈ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓｉｎｄｅｃｉｄｕｏｕｓｔｅｅｔｈｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｂｙｅｎｚｙｍｅｔｉｓｓｕｅｂｌｏｃｋｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅｎｔｈｅｃｅｌｌｓｕｒｆａｃｅｍａｒｋｅｒｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ａｎｄｔｈｅｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃａｎｄａｄｉｐｏｇｅｎｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｉｅｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄ．Ｔｈｅｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓｏｆｈｕｍａｎｄｅｃｉｄｕｏｕｓｔｅｅｔｈｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａ ｔｉｏｎｓｏｆＥ．ｃｏｌｉＬＰＳ（０１，００７５，００５，００２５，００１μｇ／ｍｌ），ａｎｄｔｈｅｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｆａｃｔｏｒｓｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄｔｏｓｃｒｅｅｎｔｈｅｓｕｉｔａｂｌｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＥ．ｃｏｌｉＬＰＳｆｏｒｔｈｅｍｏｄｅｌｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｍｅｎｔ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎ ｄｅｃｉｄｕｏｕｓｔｅｅｔｈｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｕｓｉｎｇｅｎｚｙｍｅｔｉｓｓｕｅｂｌｏｃｋｍｅｔｈｏｄ．Ｃｅｌｌｓｈｉｇｈｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｕｒｆａｃｅｍａｒｋｅｒｓｉｎｃｌｕ ｄｉｎｇＣＤ１４６，ＳＴＲＯ１，ＣＤ１０５，ＣＤ９０，ＣＤ２９，ａｎｄｌｏｗｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｕｒｆａｃｅｍａｒｋｅｒｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇＣＤ４５ａｎｄ ＣＤ３４．Ａｆｔｅｒｍｕｌｔｉｐｌｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅ，ｔｈｅｃｅｌｌｓｗｅｒｅｐｏｓｉｔｉｖｅｆｏｒａｌｉｚａｒｉｎｒｅｄｓｔａｉｎｉｎｇａｎｄｏｉｌｒｅｄｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｔｈｅ００５μｇ／ｍｌＥ．ｃｏｌｉ ＬＰＳｄｉｄｎｏｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙａｆｆｅｃｔｔｈｅｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ（Ｐ＞００５），ｂｕｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｍＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆ ＩＬ１β，ＩＬ６ａｎｄＴＮＦα（Ｐ＜００５）． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ００５μｇ／ｍｌＥ．ｃｏｌｉＬＰＳｉｓａｓｕｉｔａｂｌｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｔｏｉｎｄｕｃｅｔｈｅｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌｏｆｈｕｍａｎｄｅｃｉｄｕｏｕｓｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ： ｈｕｍａｎｄｅｃｉｄｕｏｕｓｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ； ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｍｏｄｅｌ； ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ
池韵，女，１９９４－０８生，硕士，住院医师，Ｅｍａｉｌ：ｃｈｉｙｕｎａｃａｄｅｍｉａ＠１２６．ｃｏｍ
收稿日期：２０２１－０１－１７
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ＪＳｈａｎｘｉＭｅｄＵｎｉｖ，Ｊｕｎ．２０２１，Ｖｏｌ５２Ｎｏ６
的刺激下更容易发生吸收［４，５］。有研究发现乳牙牙 周膜含有成熟的干细胞，这些细胞的增殖速率、成脂 分化能力、成骨分化能力等比恒牙牙周膜组织中的 干细胞更强［６］。
摘要： 目的 体外培养人乳牙牙周膜干细胞，建立符合实验设计需要的人乳牙根尖周炎细胞模型。 方法 采用酶解组织 块法培养人乳牙牙周膜干细胞，连续梯度稀释法进行纯化，流式法鉴定细胞表面标记物，检测其多向诱导分化能力。在培养 基中加入不同终浓度（０１，００７５，００５，００２５，００１μｇ／ｍｌ）的大肠杆菌脂多糖，通过检测细胞活性及炎症因子表达，选择合适 的大肠杆菌脂多糖浓度。 结果 酶解组织块法可获得成集落状生长的人乳牙牙周膜干细胞，流式鉴定高表达 ＣＤ１４６、 ＳＴＲＯ１、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ２９，低表达 ＣＤ４５、ＣＤ３４，细胞成骨、成脂诱导后分别对茜素红、油红 Ｏ染色阳性。００５μｇ／ｍｌ的大肠 杆菌脂多糖不影响细胞增殖活性（Ｐ＞００５），能显著提高炎症因子 ＩＬ１β、ＴＮＦα、ＩＬ６的 ｍＲＮＡ和蛋白表达水平（Ｐ＜００５）。 结论 ００５μｇ／ｍｌ的大肠杆菌脂多糖可作为诱导人乳牙牙周膜干细胞炎症模型的适宜浓度。 关键词： 人乳牙牙周膜干细胞； 炎症模型； 脂多糖
牙周膜是位于牙根周围的一种特殊的纤维结缔 组织，它维系着牙齿在牙槽骨中的位置，支持其发挥 咀嚼功能［１］。 牙 周 膜 中 未 分 化 的 间 充 质 细 胞 可 根 据机体需要分化为特定的细胞类型，例如成骨细胞、 成牙骨质细胞、脂肪细胞等，在牙周组织的修复中起
到了重要 作 用［２］。 关 于 牙 周 膜 干 细 胞 的 研 究 已 成 为口腔基础研究中最热门的方向之一［３］。
取第 ４代对数期细胞制备细胞悬液加入 １５ｍｌ ＥＰ管（１×１０６个细胞 ／管），分别加入直接荧光标记 的小 鼠 抗 人 ＣＤ１４６、ＳＴＲＯ１、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ２９、 ＣＤ４５、ＣＤ３４抗体 ２０μｌ。避光 ４℃孵育 ３０ｍｉｎ，加 入 ３００μｌ无菌 ＰＢＳ重悬，流式细胞仪上机检测细胞 表面分子表达水平。 １４ 细胞多向分化能力检测
乳牙根尖周炎是儿童口腔科的常见疾病，常伴 有根分叉、根尖周区域明显的骨质破坏。目前认为， 根尖周炎是宿主防御机制与根管腔内细菌相互作用 的结果。脂 多 糖 （ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ＬＰＳ）广 泛 分 布于革兰氏阴性菌的细胞壁中，可引起局部发热及 白细胞反 应［７］。 因 其 致 病 作 用 常 用 于 体 外 炎 症 模 型的建立，例如 ＲＡＷ２６４７小鼠巨噬细胞、牙龈上 皮成纤维细胞及 乳 腺 上 皮 细 胞 等［７－９］。同 时，ＬＰＳ 也在牙髓感染、根尖周炎、牙周炎的发生发展中起了 重要作 用 。 ［１０］ 作 为 细 菌 内 毒 素，其 对 牙 槽 骨 的 吸 收、牙周膜的降解都有一定的影响，在诱导体外牙周 膜细胞炎性状态中也有大量应用［１１］。
经医 院 伦 理 委 员 会 批 准 （伦 理 批 号：［２０１６］ ０４５），征得 患 儿 家 长 的 知 情 同 意，采 集 于 西 安 交 通 大学口腔医院儿童口腔科因乳牙滞留、外伤或咬合 诱导而拔除的乳牙。患者筛选标准：无心脏病等全 身系统性疾病，无乙肝、结核等传染性疾病；患牙无 龋坏、牙髓炎、根尖周炎等牙体及牙周相关疾病。
１ 材料与方法
１１ 主要试剂及设备 αＭＥＭ 培养基 （Ｈｙｃｌｏｎｅ公司，美国），胎牛血
清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ，美 国 ），ＣＤ１４６、ＳＴＲＯ１、ＣＤ１０５、 ＣＤ９０、ＣＤ２９、ＣＤ４５、ＣＤ３４抗 体 鼠 来 源 单 克 隆 抗 体 （Ａｂｃａｍ，美 国 ），Ｅ．ｃｏｌｉＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ，美 国 ），反 转 录 试剂盒（ＴＡＫＡＲＡ，日 本 ），ＥＬＩＳＡ试 剂 盒 （ＩＬ１β、ＩＬ ６、ＴＮＦα）（联科生物，中国）。实验在西安交通大学 口腔医院实验中心完成。 １２ 细胞原代培养及纯化
乳牙和恒牙具有不同的发育进程，两者的形态、 组织结构、生命周期也各不相同。当恒牙序列萌出 时，乳牙的牙根吸收最终发生脱落，乳牙牙根在外界
基金项目：国家自然科学基金资助项目（８１８０１３１０）；陕西省自然科学基础研究计划项目（２０２０ＪＱ－５６１） 作者简介：刘飞，男，１９８９－０７生，博士，主治医师，助理研究员，Ｅｍａｉｌ：ｌｉｕｆｅｉ０７１０＠１２６．ｃｏｍ
拔牙前使用碘伏消毒牙冠及牙龈 ２－３次，患牙 拔除后转移至超净台，取根中 １／３的牙周膜，Ⅰ型胶 原酶及中性酶 ３７℃消化 ４０ｍｉｎ，加入含 ２０％胎牛 血清的 αＭＥＭ培养基终止消化。原代细胞长出后
进行首次换液，之后 ２－３ｄ换液一次。当细胞增殖 至培养瓶底壁约 ７０％时进行传代。取第 ３代细胞 采用连续梯度稀释法进行纯化。 １３ 细胞表面标记物检测
取第 ４代 ｈｄＰＤＬＳＣｓ以 ２０００／孔的浓度接种 ９６ 孔板，２４ｈ后替换含不同终浓度的 Ｅ．ｃｏｌｉＬＰＳ（０， ０１，００７５，００５，００２５，００１μｇ／ｍｌ）培 养 基，其 中 ０μｇ／ｍｌ为对照组。分别培养 ２４，４８，７２ｈ后以 １∶１０ 的 Ｃห้องสมุดไป่ตู้Ｋ８溶液替换原液。３７℃孵育 ２ｈ后酶标仪 检测 ４５０ｎｍ 波 长 处 吸 光 度 （ｏｐｔｉｃａｌｄｅｎｓｉｔｙ，ＯＤ 值）。空白对照组为不含 ＬＰＳ的同种培养基，每组 设 ５个复孔，绘制细胞生长曲线图。 １６ 实时定量 ＰＣＲ（ｒｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ，ＲＴＰＣＲ）检测 炎性因子 ＩＬ１β、ＩＬ６、ＴＮＦα的 ｍＲＮＡ表达
将第 ４代对数期细胞采用成骨诱导液（含 １０％ 胎牛 血 清 的 αＭＥＭ 培 养 基、地 塞 米 松 １０ｍｏｌ／Ｌ、 Ｌ－抗坏血酸 ５０μｇ／ｍｌ、β－甘油磷酸钠 １０ｍｍｏｌ／Ｌ） 培养 ２８ｄ后，进行茜素红染色；采用成脂诱导液（含 １０％ 胎 牛 血 清 的 αＭＥＭ 培 养 基、地 塞 米 松 ０２５ μｍｏｌ／Ｌ、吲哚美辛 １０μｍｏｌ／Ｌ、３－异丁基 －１－甲基 黄嘌呤 ０５ｍｍｏｌ／Ｌ、Ｌ－抗坏血酸 ２－磷酸盐 １００ μｍｏｌ／Ｌ）培养 ２８ｄ后，进行油红 Ｏ染色。 １５ ＣＣＫ８检测 Ｅ．ｃｏｌｉＬＰＳ处理后 ｈｄＰＤＬＳＣｓ增 殖活性
山西医科大学学报，２０２１年 ６月，第 ５２卷 第 ６期
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大肠杆菌脂多糖诱导人乳牙牙周膜干细胞炎症模型的建立
刘 飞１，２，池 韵１，３＃，李锦沂１，２，王盼曦１，２，杨克宇１，２，郭青玉１，２ （１西安交通大学口腔医院，陕西省颅颌面精准医学
研究重点实验室，西安 ７１０００４；２西安交通大学口腔医院儿童口腔科；３浙江大学医学院附属邵逸夫医院口腔科；＃共同第一作 者；通讯作者，Ｅｍａｉｌ：ｇｕｏｑｉｎｙｕ＠ｍａｉｌ．ｘｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ）
中图分类号： Ｒ７８１ 文献标志码： Ａ 文章编号： １００７－６６１１（２０２１）０６－０７４１－０７ ＤＯＩ：１０．１３７５３／ｊ．ｉｓｓｎ．１００７－６６１１．２０２１．０６．０１４
Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔｏｆｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｍｏｄｅｌｏｆｈｕｍａｎｄｅｃｉｄｕｏｕｓｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｌｉｐｏｐｏ ｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ＬＩＵＦｅｉ１，２，ＣＨＩＹｕｎ１，３＃，ＬＩＪｉｎｙｉ１，２，ＷＡＮＧ Ｐａｎｘｉ１，２，ＹＡＮＧ Ｋｅｙｕ１，２，ＧＵＯ Ｑｉｎｇｙｕ１，２ （１ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＳｈａａｎｘｉＰｒｏｖｉｎｃｅｆｏｒ ＣｒａｎｉｏｆａｃｉａｌＰｒｅｃｉｓｉｏｎＭｅｄｉｃｉｎｅＲｅｓｅａｒｃｈ，ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＳｔｏｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｘｉ’ａｎＪｉａｏｔｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉ’ａｎ７１０００４，Ｃｈｉｎａ；２ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＰｅ ｄｉａｔｒｉｃＤｅｎｔｉｓｔｒｙ，ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＳｔｏｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｘｉ’ａｎＪｉａｏｔｏｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；３ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＤｅｎｔｉｓｔｒｙ，ＳｉｒＲｕｎＲｕｎＳｈａｗＨｏｓｐｉｔａｌ，Ｓｃｈｏｏｌｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ＺｈｅｊｉａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；＃Ｃｏｆｉｒｓｔａｕｔｈｏｒ；Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，Ｅｍａｉｌ：ｇｕｏｑｉｎｙｕ＠ｍａｉｌ．ｘｊｔｕ．ｅｄｕ．ｃｎ） Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｍｏｄｅｌｏｆｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｏｆｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎｄｅｃｉｄｕｏｕｓｔｅｅｔｈ． Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓｉｎｄｅｃｉｄｕｏｕｓｔｅｅｔｈｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｂｙｅｎｚｙｍｅｔｉｓｓｕｅｂｌｏｃｋｍｅｔｈｏｄ，ａｎｄｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅｎｔｈｅｃｅｌｌｓｕｒｆａｃｅｍａｒｋｅｒｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，ａｎｄｔｈｅｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃａｎｄａｄｉｐｏｇｅｎｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｂｉｌｉｔｉｅｓｗｅｒｅａｎａｌｙｚｅｄ．Ｔｈｅｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓｏｆｈｕｍａｎｄｅｃｉｄｕｏｕｓｔｅｅｔｈｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａ ｔｉｏｎｓｏｆＥ．ｃｏｌｉＬＰＳ（０１，００７５，００５，００２５，００１μｇ／ｍｌ），ａｎｄｔｈｅｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｆａｃｔｏｒｓｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄｔｏｓｃｒｅｅｎｔｈｅｓｕｉｔａｂｌｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＥ．ｃｏｌｉＬＰＳｆｏｒｔｈｅｍｏｄｅｌｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｍｅｎｔ． Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎ ｄｅｃｉｄｕｏｕｓｔｅｅｔｈｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｕｓｉｎｇｅｎｚｙｍｅｔｉｓｓｕｅｂｌｏｃｋｍｅｔｈｏｄ．Ｃｅｌｌｓｈｉｇｈｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｕｒｆａｃｅｍａｒｋｅｒｓｉｎｃｌｕ ｄｉｎｇＣＤ１４６，ＳＴＲＯ１，ＣＤ１０５，ＣＤ９０，ＣＤ２９，ａｎｄｌｏｗｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓｕｒｆａｃｅｍａｒｋｅｒｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇＣＤ４５ａｎｄ ＣＤ３４．Ａｆｔｅｒｍｕｌｔｉｐｌｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎｃｕｌｔｕｒｅ，ｔｈｅｃｅｌｌｓｗｅｒｅｐｏｓｉｔｉｖｅｆｏｒａｌｉｚａｒｉｎｒｅｄｓｔａｉｎｉｎｇａｎｄｏｉｌｒｅｄｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｔｈｅ００５μｇ／ｍｌＥ．ｃｏｌｉ ＬＰＳｄｉｄｎｏｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙａｆｆｅｃｔｔｈｅｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ（Ｐ＞００５），ｂｕｔｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｍＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆ ＩＬ１β，ＩＬ６ａｎｄＴＮＦα（Ｐ＜００５）． Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ００５μｇ／ｍｌＥ．ｃｏｌｉＬＰＳｉｓａｓｕｉｔａｂｌｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｔｏｉｎｄｕｃｅｔｈｅｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｍｏｄｅｌｏｆｈｕｍａｎｄｅｃｉｄｕｏｕｓｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ： ｈｕｍａｎｄｅｃｉｄｕｏｕｓｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌｌｉｇａｍｅｎｔｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ； ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｍｏｄｅｌ； ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ
池韵，女，１９９４－０８生，硕士，住院医师，Ｅｍａｉｌ：ｃｈｉｙｕｎａｃａｄｅｍｉａ＠１２６．ｃｏｍ
收稿日期：２０２１－０１－１７
·７４２·
ＪＳｈａｎｘｉＭｅｄＵｎｉｖ，Ｊｕｎ．２０２１，Ｖｏｌ５２Ｎｏ６
的刺激下更容易发生吸收［４，５］。有研究发现乳牙牙 周膜含有成熟的干细胞，这些细胞的增殖速率、成脂 分化能力、成骨分化能力等比恒牙牙周膜组织中的 干细胞更强［６］。
摘要： 目的 体外培养人乳牙牙周膜干细胞，建立符合实验设计需要的人乳牙根尖周炎细胞模型。 方法 采用酶解组织 块法培养人乳牙牙周膜干细胞，连续梯度稀释法进行纯化，流式法鉴定细胞表面标记物，检测其多向诱导分化能力。在培养 基中加入不同终浓度（０１，００７５，００５，００２５，００１μｇ／ｍｌ）的大肠杆菌脂多糖，通过检测细胞活性及炎症因子表达，选择合适 的大肠杆菌脂多糖浓度。 结果 酶解组织块法可获得成集落状生长的人乳牙牙周膜干细胞，流式鉴定高表达 ＣＤ１４６、 ＳＴＲＯ１、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ２９，低表达 ＣＤ４５、ＣＤ３４，细胞成骨、成脂诱导后分别对茜素红、油红 Ｏ染色阳性。００５μｇ／ｍｌ的大肠 杆菌脂多糖不影响细胞增殖活性（Ｐ＞００５），能显著提高炎症因子 ＩＬ１β、ＴＮＦα、ＩＬ６的 ｍＲＮＡ和蛋白表达水平（Ｐ＜００５）。 结论 ００５μｇ／ｍｌ的大肠杆菌脂多糖可作为诱导人乳牙牙周膜干细胞炎症模型的适宜浓度。 关键词： 人乳牙牙周膜干细胞； 炎症模型； 脂多糖
牙周膜是位于牙根周围的一种特殊的纤维结缔 组织，它维系着牙齿在牙槽骨中的位置，支持其发挥 咀嚼功能［１］。 牙 周 膜 中 未 分 化 的 间 充 质 细 胞 可 根 据机体需要分化为特定的细胞类型，例如成骨细胞、 成牙骨质细胞、脂肪细胞等，在牙周组织的修复中起
到了重要 作 用［２］。 关 于 牙 周 膜 干 细 胞 的 研 究 已 成 为口腔基础研究中最热门的方向之一［３］。
取第 ４代对数期细胞制备细胞悬液加入 １５ｍｌ ＥＰ管（１×１０６个细胞 ／管），分别加入直接荧光标记 的小 鼠 抗 人 ＣＤ１４６、ＳＴＲＯ１、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ２９、 ＣＤ４５、ＣＤ３４抗体 ２０μｌ。避光 ４℃孵育 ３０ｍｉｎ，加 入 ３００μｌ无菌 ＰＢＳ重悬，流式细胞仪上机检测细胞 表面分子表达水平。 １４ 细胞多向分化能力检测
乳牙根尖周炎是儿童口腔科的常见疾病，常伴 有根分叉、根尖周区域明显的骨质破坏。目前认为， 根尖周炎是宿主防御机制与根管腔内细菌相互作用 的结果。脂 多 糖 （ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ＬＰＳ）广 泛 分 布于革兰氏阴性菌的细胞壁中，可引起局部发热及 白细胞反 应［７］。 因 其 致 病 作 用 常 用 于 体 外 炎 症 模 型的建立，例如 ＲＡＷ２６４７小鼠巨噬细胞、牙龈上 皮成纤维细胞及 乳 腺 上 皮 细 胞 等［７－９］。同 时，ＬＰＳ 也在牙髓感染、根尖周炎、牙周炎的发生发展中起了 重要作 用 。 ［１０］ 作 为 细 菌 内 毒 素，其 对 牙 槽 骨 的 吸 收、牙周膜的降解都有一定的影响，在诱导体外牙周 膜细胞炎性状态中也有大量应用［１１］。
经医 院 伦 理 委 员 会 批 准 （伦 理 批 号：［２０１６］ ０４５），征得 患 儿 家 长 的 知 情 同 意，采 集 于 西 安 交 通 大学口腔医院儿童口腔科因乳牙滞留、外伤或咬合 诱导而拔除的乳牙。患者筛选标准：无心脏病等全 身系统性疾病，无乙肝、结核等传染性疾病；患牙无 龋坏、牙髓炎、根尖周炎等牙体及牙周相关疾病。
１ 材料与方法
１１ 主要试剂及设备 αＭＥＭ 培养基 （Ｈｙｃｌｏｎｅ公司，美国），胎牛血
清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ，美 国 ），ＣＤ１４６、ＳＴＲＯ１、ＣＤ１０５、 ＣＤ９０、ＣＤ２９、ＣＤ４５、ＣＤ３４抗 体 鼠 来 源 单 克 隆 抗 体 （Ａｂｃａｍ，美 国 ），Ｅ．ｃｏｌｉＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ，美 国 ），反 转 录 试剂盒（ＴＡＫＡＲＡ，日 本 ），ＥＬＩＳＡ试 剂 盒 （ＩＬ１β、ＩＬ ６、ＴＮＦα）（联科生物，中国）。实验在西安交通大学 口腔医院实验中心完成。 １２ 细胞原代培养及纯化
乳牙和恒牙具有不同的发育进程，两者的形态、 组织结构、生命周期也各不相同。当恒牙序列萌出 时，乳牙的牙根吸收最终发生脱落，乳牙牙根在外界
基金项目：国家自然科学基金资助项目（８１８０１３１０）；陕西省自然科学基础研究计划项目（２０２０ＪＱ－５６１） 作者简介：刘飞，男，１９８９－０７生，博士，主治医师，助理研究员，Ｅｍａｉｌ：ｌｉｕｆｅｉ０７１０＠１２６．ｃｏｍ