大肠杆菌生产CoQ_10_的代谢工程研究进展

2009年第28卷第5期 CHEMICAL INDUSTRY AND ENGINEERING PROGRESS ·855·
化工进
展
大肠杆菌生产CoQ10的代谢工程研究进展
王智文，马向辉，陈洵，赵学明，陈涛
（天津大学化工学院，天津 300072）
摘要：随着对CoQ生物合成途径及其调控机制的深入研究，利用代谢工程的方法定向地改良菌种，优化CoQ10的代谢途径，成为提高CoQ10发酵水平的新思路。

本文总结了重组大肠杆菌生产CoQ10过程中其代谢途径及其途径修饰的研究进展，分析了生产CoQ10的代谢工程限制因素，提出了利用重组大肠杆菌生产CoQ10的代谢工程策略。

关键词：辅酶Q10；十异戊二烯焦磷酸合成酶；代谢通量；代谢工程
中图分类号：Q 819 文献标识码：A 文章编号：1000–6613（2009）05–0855–09
Progress of metabolic engineering for production of CoQ10 by
Escherichia coli
WANG Zhiwen，MA Xianghui，CHEN Xun，ZHAO Xueming，CHEN Tao
(School of Chemical Engineering & Technology，Tianjin University，Tianjin 300072，China）Abstract：As the knowledge of the biosynthetic enzymes and of regulatory mechanisms modulating CoQ production increases，many novel strategies arise for the production of CoQ10.Most strategies are focused on metabolic engineering of CoQ10 production and optimization of its metabolic pathways in hosts. The progress of metabolic pathways and modification of cellular pathways are summarized and the critical factors are analyzed for the CoQ10 production in recombinant Escherichia coli by metabolic engineering. The metabolic engineering strategies to improve and/or engineer CoQ10 production in recombinant Escherichia coli are presented in light of the current knowledge of the biosynthesis of this molecule.
Key words：CoQ10; decaprenyl diphosphate synthase (DPS); metabolic flux; metabolic engineering
CoQ10（2,3-二甲氧基-5-甲基-6-癸异戊二烯基苯醌，Coenzyme Q10，CoQ10），是一种脂溶性的醌类化合物，Q表示一族醌类化合物，10表示侧链异戊二烯的数目。

CoQ10是生物线粒体或细胞膜上重要的电子传递体，1978年Peter用化学渗透理论解释了生物能量转移包括能量转换系统中CoQ10起着重要的质子转移作用等，并因此获得诺贝尔奖[1]。

CoQ10不仅存在于线粒体和细胞膜上，还存在于溶酶体、微粒体和过氧化酶体等，因此其生理功能应不单单局限在电子传递过程中。

随着研究的深入，CoQ10的许多生理功能备受人们关注，如抗氧化、抗衰老作用[2]，作为信号分子调控细菌需氧呼吸双组分的信号传递，调控基因的表达，催化硫酯键的形成等[3]。

CoQ10已经成功地用于某些疾病的预防与治疗，临床上对各类癌症、心脏病、急慢性肝炎、糖尿病和帕金森等疾病表现了很好的功效[4－7]。

目前，CoQ10的生产或制备方法主要有化学全合成法、半合成法、微生物发酵法[4]。

化学全合成和半合成法的产物为顺反异构体混合物，生物活性低。

微生物发酵法合成的CoQ10无光学异构体，生物活性高，临床应用效果好[8]。

然而，微生物发酵
收稿日期；2008–10–17；修改稿日期：2008–11–12。

基金项目：国家重点基础研究973计划（2007CB707802）及国家自然基金（NSFC–20536040）项目。

第一作者简介：王智文（1981—），男，博士研究生。

E–mail zhiwenw335_@。

联系人：陈涛，副教授。

电话 022–27892083；E–mail chentao@。

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菌种的效价低，造成CoQ10产品成本高，是当前限制CoQ10工业化生产的瓶颈。

近几年，随着对CoQ 生物合成途径及其调控机制的深入研究，利用代谢工程的方法定向改良菌种，优化CoQ10的代谢途径，是提高CoQ10发酵工业化水平的新思路，应用代谢工程的方法改造大肠杆菌生产CoQ10成为了研究的热点。

1 产生CoQ10的微生物
表1列举了产生CoQ10微生物野生菌株及几株突变菌株的CoQ10生产情况。

由表1可以看出，产生CoQ10的微生物囊括了细菌、真菌和酵母。

野生菌株CoQ10的产量相对较低，经过物理或化学诱变后产量可以得到一定的提高。

化学诱变菌株中，Rhodopseudomonas spheroids KY8595 CoQ10产量高达770 mg/L，是目前报道的CoQ10产量最高菌株，达到了工业化生产的要求[9]。

除传统的诱变育种外，基因工程法改良微生物生产CoQ10是当前的研究热点，Zahiri等[10]构建的重组大肠杆菌E. coli DH5α胞内CoQ10累积高达2.4 mg/g DCW（DCW即dry cell weight，干菌重），说明大肠杆菌对CoQ10具有很好的耐受性，可以进一步通过代谢工程手段提高其产量。

E.coli是基因背景研究比较清楚的模式菌株，适合于基因改造和大批量的发酵生产。

2 CoQ的合成途径
有关CoQ的合成途径主要是通过对大肠杆菌和酵母的CoQ合成途径研究而得以阐明的。

CoQ 的合成可以分为四部分：①CoQ芳香环前体对羟基苯甲酸（PHBA）的合成；②聚异戊二烯侧链的前体聚异戊二烯焦磷酸（PPP）的合成；③甲基的供体S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的合成；④醌环的修饰。

研究表明，不同的生物其合成途径存在一定的差异（图1）。

Meganathan和Choi等 [4,20]对CoQ的生物合成途径进行了很好的总结和论述，不同种类的微生物合成CoQ的途径略有不同。

CoQ芳香环合成的前体对羟基苯甲酸，在细菌中主要由莽草酸途径产生，大肠杆菌和其它革兰氏阴性菌等原核微生物通过莽草酸途经由分支酸生成对羟基苯甲酸；酿酒酵母合
表1CoQ10的产生菌及其产量
菌株（Strains） CoQ10浓度/mg·L－1 CoQ10含量/mg·(gDCW)－1参考文献
野生型（Wild type）
根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）ATCC 4452 87.6 1.9
[4]
脱氮副球菌（Paracoccus dentitrificans）ATCC 19367 27.6 0.86
[4]
类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）FERM-P4675 97.2 2.7
[4]
豌豆根瘤菌（Rhizobium radiobacter）—
29 1.33 mg/g（湿菌体）2.4 [11]
[4]
球红假单胞菌（Rhodopseudomonas sphaeroides） 1.5（有氧无光）
1.7（无氧无光）0.7（有氧无光）
3.0（无氧无光）
[12]
放射型根瘤菌（Rhizobus radiobacterium）WSH2601 26.4 2.38
[13]
烟曲霉（Aspergillus fumigatus）37.8 —
[14]
深红酵母（Rhodotorula rubra）55.5 —
[14]
粉红掷胞酵母（Sporobolom ycesroseus）186.6 —
[14]
黄色隐球酵母（Cryptococcus luteotus）18.2 1.42
[15]
粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces promb）24.56 —
[16]
锁掷酵母（Sporidiobolus ruineniae）16.56 0.92
[17] 突变株（Mutants）
类球红细菌（R.sphaeroides）Co-22-11 350.0 8.7
[18]
根癌农杆菌（A.tumefaciens）AU-55
根癌农杆菌（A.tumefaciens）KCCM104 180.0
626.5
—
9.25
[18]
[19]
球红假单胞菌（Rhodopseudomonas spheroids）KY8595 770.0 8.7
[9]
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成对羟基苯甲酸有两条途径，第一条途径和大肠杆
菌中合成对羟基苯甲酸的途径相似，其次可以通过
莽草酸途经合成的酪氨酸经一系列生化反应生成羟
基苯甲酸。

芳香环修饰过程一共经过8步反应，包
括一次异戊二烯化、一次脱羧化、三次羟基化及三
次甲基化反应，大肠杆菌与酿酒酵母在芳香环修饰
反应的先后顺序上存在部分差异[20]。

-
2
图1 微生物中的CoQ合成途径[20]
1—分支酸；2—酪氨酸；3—对羟基苯甲酸；4—CoQ；SAM—S-腺苷甲
硫氨酸；IPP—异戊二烯焦磷酸；DMAPP—二甲基烯丙基焦磷酸；
MEP—甲羟戊酸；G3P—甘油醛-3-磷酸；Acetate—乙酸；
MVA—甲羟戊酸；Pyr—丙酮酸
聚异戊二烯侧链的前体是聚异戊二烯焦磷酸
（PPP），按其合成的先后可分为两大阶段：异戊二
烯焦磷酸（IPP）的合成和PPP的合成。

目前报道合
成IPP有两条不同的途径，真细菌、绿藻和植物的叶
绿体通过2-甲基-4-磷酸-D-赤藓糖醇
（2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate，MEP）途径合
成；酵母，古细菌和人类是通过甲羟戊酸途径（MVP）
合成[21]。

合成的终产物聚异戊二烯链的长度因不同生
物而异，这由生物体所含的聚异戊二烯焦磷酸合成酶
决定，从而导致CoQ侧链长度出现生物特征性差异，
如人、玉米、大肠杆菌和酵母侧链的异戊二烯数目分
别是10、9、8、6[3]。

S-腺苷甲硫氨酸（SAM）是CoQ
芳香环甲（氧）基化的甲基供体，在微生物体内，SAM
是由甲硫氨酸合成途径中的甲硫氨酸转化。

3 大肠杆菌代谢工程生产CoQ10
E.coli胞内合成的CoQ主要是CoQ8，常含有微
量的CoQ1-CoQ7和CoQ9。

图2是
E.coli中CoQ8的
合成途径，利用代谢工程的方法改良
E.coli合成
CoQ10
和提高其产量，需要对其几条生化步骤进行
改造或修饰。

首先，E.coli需要表达外源十异戊二
烯焦磷酸合成酶（DPS），催化异戊二烯焦磷酸（IPP）
和法尼基焦磷酸（FPP）合成十异戊二烯焦磷酸。

其次，提高合成CoQ10前体物质的浓度，进一步提
高CoQ10的产量。

Try
Trp
Phe
MK
DMK
MK
tRNA prenylation
bactoprenol
OH
H
COO
8
2
O2
UbiB
UbiG
2
图2 E.coli中CoQ8的合成途径[22]
E4P—四磷酸赤藓糖；PEP—磷酸烯醇式丙酮酸；Chorismate—分支酸；
PHBA—对羟基苯甲酸；GAP—3-磷酸甘油醛；Pyr—丙酮酸；DXP—5-磷
酸-1-脱氧-木酮糖；IPP—异戊二烯焦磷酸；DMAPP—二甲基烯丙基焦磷
酸；FPP—法尼基焦磷酸；SAM—S-腺苷甲硫氨酸；UbiA—对羟基苯甲酸
聚异戊烯基转移酶；UbiB—2-八异戊烯苯酚羟化酶；UbiC—分支酸丙酮
酸裂解酶；UbiD/UbiX—3-异戊烯基-4羟基苯甲酸脱羧酶；UbiG—2-八异
戊烯基-6-羟基苯酚甲基化酶/2-八异戊烯基-3-甲基-5-羟基-6-甲氧基-1,4-苯
醌甲基化转移酶；UbiH—2-八异戊烯基-6-甲氧基苯酚羟基化酶
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3.1十异戊二烯焦磷酸合成酶（DPS）在大肠杆菌中的表达
CoQ类异戊二烯侧链的长度是由宿主菌中聚异戊二烯基焦磷酸合成酶基因所决定的。

此酶催化IPP和二甲基稀丙基焦磷酸（DMAPP）生成具有一定长度的聚异戊二烯焦磷酸。

大肠杆菌中，催化此反应的酶为八异戊二烯焦磷酸合成酶（IspB），催化合成八异戊二烯焦磷酸（OPP）和少量短异戊二烯焦磷酸。

利用大肠杆菌生产CoQ10的策略是将产生CoQ10微生物的DPS基因导入到大肠杆菌中，表达外源DPS而产生CoQ10。

目前，Agrobacterium tumefaciens[23]、Gluconobacter suboxydans （ddsA）[24]、Paracoccus denitrificans[25]和Rhodobacter sphaeroides[26]等微生物的DPS基因已经在大肠杆菌中得到了成功的表达。

代谢工程方法改良大肠杆菌生产CoQ10时，存在的问题之一是产生的CoQ是一个混合物，除产生CoQ10外，还产生少量的CoQ8和CoQ9，这增加了CoQ10分离纯化难度，提高了下游处理成本。

为了专一性地产生CoQ10，在大肠杆菌中导入了DPS后须将ispB基因敲除。

前期研究表明CoQ10可以替代CoQ8而完成胞内的各种功能，保持细胞正常生长。

不同菌株中，DPS酶产生CoQ10表现出不同的产物专一性，Zahiri等分析了不同菌株的DPS酶在大肠杆菌中表达CoQ10的情况，结果表明克隆自Rhodobacter sphaeroides的DPS基因比Agrobacterium tumefaciens菌株的DPS基因表现出更好的产物专一性[26]。

因此，可以克隆不同菌株的十异戊二烯基焦磷酸合成酶基因，同时敲除 E.coli 的ispB基因，观察不同十异戊二烯基焦磷酸合成酶基因在E.coli中的表达情况，分离或选择产物专一性较好的十异戊二烯基焦磷酸合成酶基因。

其次，通过诱变或定点突变得到产物专一性强的DPS酶也是实现大肠杆菌代谢工程高产CoQ10的重要策略之一，产物专一性强的DPS不仅能够提高CoQ10的产量，同时能降低下游处理过程的成本。

分离或突变得到CoQ10产物专一性强的DPS基因应是实现大肠杆菌高产CoQ10的必要环节。

3.2CoQ10前体的供给
CoQ10的芳香环来自于莽草酸途径中的PHBA，在此途径中也产生了其它的代谢产物如芳香族氨基酸酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸以及叶酸、维生素K2（MK）、脱甲基维生素K2（DMK）和类胡萝卜素等物质。

疏水性聚异戊二烯侧链是通过MEP途径合成，此途径也提供MK、DMK、细菌萜醇等物质的前体。

莽草酸途径和MEP途径是CoQ10合成的限速途径[27]，因此，要提高CoQ10的产量必须提高这两个途径的通量。

在增加前体供给的代谢工程研究中，可以通过化学计量模型的构建与分析，以增加莽草酸途径和MEP途径的碳通量，通过上游途径的改造实现CoQ10的高产。

目前，有关CoQ10高产的途径操作主要集中在下游途径莽草酸途径和MEP途径，通过上游途径的改造实现代谢物的高产也是实现代谢工程的一个重要策略。

Gosset等[28]通过改造大肠杆菌上游途径（PTS-Glucose+，敲除pykA 和pykF，过表达tktA），使莽草酸途径中芳香族氨基酸的碳通量提高19.9倍。

因此，可以结合上游途径与下游途径的协同改造而实现重组大肠杆菌中CoQ10的高产。

3.2.1 莽草酸途径及其代谢工程策略
大肠杆菌中莽草酸途径的主要调控位点是aroH编码的2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶，这个酶催化4-磷酸赤藓糖和磷酸烯醇式丙酮酸生成3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸（DAHP）的反应，三个同工酶2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶AroG、AroF和AroH，分别被苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸所抑制[29－30]。

大肠杆菌的2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶同工酶系统对微生物是有利的，它保证了不会因为一种终端产物的过多而关闭（反馈抑制或阻遏）其它支路终端产物的合成[31]。

代谢工程方法改良大肠杆菌以提高CoQ10产量的工程策略上，一方面要提高从2-脱氢-3-脱氧磷酸庚糖酸醛缩酶向对羟基苯甲酸方向途径上各个酶基因的表达量和酶活力；另一面要减弱或阻断分支点向其它支路的通量，即通过定点改造选育芳香族氨基酸营养缺陷型突变体[31]。

大肠杆菌的CoQ合成过程中基因的过表达分析表明，分支酸丙酮酸裂合酶基因（ubiC）与其它CoQ合成途径中的基因同时过表达时，辅酶Q的产量提高3倍[32]。

叶江等[33]研究了大肠杆菌生物合成关键基因ubiCA强化表达对大肠杆菌CoQ产量的影响，结果表明分支酸丙酮酸裂合酶基因ubiC的超量表达可提高辅酶Q的产量。

在重组大肠杆菌中，Barker等[34]通过选择性地过表达莽草酸途径中的几个酶，同时限制芳香族氨基酸的通量，使对羟基苯甲酸的产量达到了12 g/L。

在酿酒酵母中，对羟基苯甲酸的合成可以由分支酸丙酮酸裂解酶催化生成，也可以通过酪氨酸经一系
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列生化反应生成。

因此，可以将酿酒酵母的中酪氨酸合成对羟基苯甲酸途径引入到大肠杆菌以提高对羟基苯甲酸的通量。

此外源途径的引入不仅可以使酪氨酸生成对羟基苯甲酸，同时消除了酪氨酸的累积对AroF的反馈抑制作用。

双途径合成对羟基苯甲酸是由Booth等提出来的，在酿酒酵母中也得到了证实，但具体的合成途径尚未完全阐明，因此外源途径的引入首先需要探明途径中的酶及其基因。

减少或阻断分支点往其它支路的通量方面，限制或阻断对羟基苯甲酸前体物竞争分子，如MK和DMK、芳香族氨基酸，可能对于重组大肠杆菌中CoQ10产量的增加有利。

在好氧生长条件下，CoQ 的合成比MK和DMK占优势，然而在无氧呼吸时不同的醌环会因为溶解氧的变化而发生迅速的变化[35]。

因此，限制或阻断MK和DMK等代谢物的产生，对重组大肠杆菌中CoQ10产量的提高是有利的。

3.2.2 异戊二烯焦磷酸（IPP）合成途径及其代谢工程策略
生物体内，IPP是CoQ侧链聚异戊二烯合成的原料，也是所有类异戊二烯化合物共同的代谢前体物。

研究表明，聚异戊二烯侧链的延伸合成是以DMAPP为引物与一个个IPP缩合而成，其中DMAPP也是由IPP通过IDI（异戊二烯焦磷酸-二甲基烯炳基焦磷酸异构酶）转化而来，所以侧链延伸原料实际上就是IPP。

生物体内，IPP的生物合成有两条途径。

两条途径的合成情况如图3所示，一条为存在于大多数原核细菌的MEP途径，另一条是真核微生物和动物所利用的MVP途径。

在MEP途径中，2-脱氧-5-磷酸-D-木酮糖合成酶（DXS）是限速步骤，在大肠杆菌中分别过表达来自Pseudomonas aeruginosa、Bacillus subtilis或Synechocystis sp. 6803的dxs，CoQ的产量分别有不同程度的增加[36]。

Lee等[37]在利用重组大肠杆菌生产单环类胡萝卜素过程中，单独或联合过表达dxs、dxr（编码MEP合成酶）、idi（编码异戊二烯焦磷酸-二甲基烯炳基焦磷酸异构酶）或ispA（编码法尼基焦磷酸合成酶）基因，可以使类胡萝卜素的产量提高到3.1～3.3倍。

单独表达dxr、ispA或idi基因，总类胡萝卜素的产量分别提高1.5～1.7倍。

过表达上述基因实质上是增加了类胡萝卜素的重要前体物质IPP，因此可以推断DXR和IDI也是IPP合成途径中的限速酶。

在重组大肠杆菌，尚未见到关于idi 基因的修饰提高CoQ10产量的报道，idi基因是IPP 合成过程中的重要变构酶，可对其进行基因修饰以提高CoQ10的产量。

提高IPP通量的另一种方法是将酵母等真核生物MVP途径引入到大肠杆菌中。

Zahiri等[10]在大肠杆菌中成功构建了外源MVP途径能够将乙酰-CoA 合成IPP以生产CoQ10，此途径成为了大肠杆菌中MEP途径的旁路，构建的重组大肠杆菌其CoQ10的产率达到了2428µg/g DCW，比十异戊二烯焦磷酸合成酶基因ddsA（克隆自Agrobacterium tumefaciens）单独存在时提高了2.7倍。

A
+
B
A B
图3 异戊二烯焦磷酸（ IPP）的生物合成途径[20]
A—MVP途径；B—MEP途径
IPP—异戊二烯基焦磷酸；DMAPP—二甲基烯炳基焦磷酸；DXP—2-脱氧-5-磷酸-木酮糖；MEP—甲羟戊酸；dxs—2-脱氧-5-磷酸-D-木酮糖合成酶基因；dxr—甲羟戊酸合成酶基因；idi—异戊二烯焦磷酸-二甲基烯炳
基焦磷酸异构酶基因
3.2.3 聚异戊二烯焦磷酸（PPP）合成途径及其代谢工程策略
在重组大肠杆菌中PPP合成途径如图4所示，聚异戊二烯链合成的起始物是DMAPP，经过与一个个IPP缩合而得以延伸。

催化该途径反应的有两个酶，催化起始反应步骤的是法尼基焦磷酸（FPP）
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Q-6→
MK-7→
→Q-8MK-8
Q-9→
Q-10→
图4 聚异戊二烯基焦磷酸的合成途径
[20]
IPP —异戊二烯焦磷酸；DMAPP —二甲基烯炳基焦磷酸；GPP —牻牛儿基焦磷酸；FPP —法尼基焦磷酸；GGPP —牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸；GFPP —香叶基焦磷酸；HexPP —六异戊烯基焦磷酸；HepPP —七异戊烯基焦磷酸；OPP —八异戊烯基焦磷酸；SPP —九异戊烯基焦磷酸；DPP —十异戊烯基焦
磷酸；ispA —法尼基焦磷酸合成酶基因；ispB —八异戊烯基焦磷酸合成酶基因
合成酶，另一个是催化后面反应步骤的PPP 合成酶，大肠杆菌中，编码这两个酶的基因分别是ispA 和ispB 。

不同微生物中FPP 合成酶催化的反应是相同的，差异主要表现在聚异戊二烯焦磷酸合成酶上，该酶对生物体内合成的聚异戊二烯侧链长度起决定作用。

E.coli 通过自身ispA 和ispB 基因编码的一系列异戊二烯焦磷酸合成酶，将MEP 途径中得到的前体合成一系列长度不同的侧链。

3.3 芳香环的修饰
不同的生物中，芳香环的修饰顺序有所差别，图5是大肠杆菌和某些真核生物中芳香环的修饰过程。

芳香环修饰的第一步是PHBA 和PPP 的缩合反应，大肠杆菌中催化此反应的酶为对羟基苯甲酸聚异戊二烯焦磷酸转移酶（UbiA ），此酶为膜结合蛋
白，是CoQ 生物合成的限速步骤[38]。

对该酶活性研究发现，它对底物PPP 的聚合长度并无特殊要求，
即对底物的识别具有相对专一性。

在大肠杆菌中，过表达CoQ 合成途径中的酶UbiC 、UbiA 、UbiB 、UbiG 和UbiH ，可以使CoQ 的产量从0.19mg/g DCW 增加到0.95mg/g DCW ，CoQ 的含量相对较低可能是由于前体（PHBA 和OPP/DPP ）的不足造成的[32]。

随着芳香环修饰过程中基因及其酶的功能的不断阐明，如UbiX ，为进一步进行大肠杆菌CoQ 10代谢工
程提供了很好的依据[39－
40]。

在芳香环的修饰过程中，需要经过三次甲基化过程，此过程中甲基化的供体是SAM ，在微生物体内SAM 是由甲硫氨酸转化而来，因此它是由甲硫氨酸合成途径供给。

甲硫氨酸是天门冬氨酸家族成员，因此它与苏氨酸、赖氨酸、异亮氨酸一样，合成的起始物都是天门冬氨酸，其碳骨架是由三羧酸循环中间产物草酰乙酸生成。

从代谢工程策略上来说，通过定点突变选育苏氨酸、赖氨酸双
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3+
PPi
Yeast H 33
图5 芳香环的修饰[20]
UbiA —对羟基苯甲酸聚异戊烯基转移酶；UbiB —2-八异戊烯苯酚羟化
酶；UbiC —分支酸丙酮酸裂解酶；UbiD/UbiX —3-异戊烯基-4羟基苯甲酸脱羧酶；UbiG —2-八异戊烯基-6-羟基苯酚甲基化酶/ 2-八异戊烯基-3-甲基-5-羟基-6-甲氧基-1,4苯醌甲基化转移酶；UbiH —2-八异戊烯基-6-甲氧基苯酚羟基化酶；UbiE—2-八异戊烯基-6-甲氧基-1,4苯醌甲基化酶；
UbiF —2-八异戊烯基-3-甲基-6-甲氧基-1,4苯醌加氧酶
重营养缺陷型，增加甲硫氨酸和SAM 合成途径中各酶基因尤其是限速酶的拷贝数及表达量，可以提高SAM 的产量，以提高CoQ 10合成过程中前体SAM 的供给[31]。

4 CoQ 合成酶之间相互关系的分析
代谢工程改良大肠杆菌发酵生产CoQ 10的过程中，有必要考察一下酶在细胞内的附着位点，分析它们是否以蛋白质复合物的形式发挥其催化活性。

所有的CoQ 合成途径的中间代谢物都拥有一个疏水性的异戊烯基侧链，疏水侧链使它们附着在细胞膜或线粒体膜上。

到目前为止，已经证实有些CoQ 是与膜相交联的。

进一步的研究表明，UbiB 、UbiG 或UbiH 失去活性后，造成中间代谢物2-十异戊烯
基酚的积累[41]，也就是说，上述3种酶中任何一种
失去活性后都阻碍了2-十异戊烯基酚的羟基化。

这一现象表明，以上3种蛋白是相互作用的或者是以蛋白复合物的形式发挥催化活性。

Knoell 等从大肠杆菌线粒体膜中分离得到一种水溶性的蛋白复合物能够催化2-十异戊烯基酚生成CoQ ，进一步证明了CoQ 合成酶以蛋白复合物形式存在的可能性[42]。

Gulmezian 的研究表明，大肠杆菌中UbiG 和UbiX 在CoQ 的合成过程中存在交互作用[39]，UbiX 和UbiD 共同作用完成4-羟基-3-十异戊烯基-苯甲酸的去羧基化[40]，这也表明UbiX 、UbiD 和UbiG 在胞内很有可能是以蛋白质复合物的形式相互作用的。

近年来，在酿酒酵母CoQ 合成酶的研究中也发现蛋
白复合物的存在[43－
45]，因为在这两种生物中，合成途径是相似的，所以，E.coli 中CoQ 合成酶很有可能是以蛋白质复合物的形式而发挥活性的。

鉴于这种新的发现，利用代谢工程改良大肠杆菌生产CoQ 10，有必要对CoQ 合成酶和相关蛋白的相互作用进行细致分析，用以指导相关途径的基因修饰。

5 展 望
微生物发酵产生CoQ 10的产量在30～130
mg/L ，据估计商业化生产CoQ 10的产量应该高于
500 mg/L [22]。

Zahiri 等将MVP 途径引入到大肠杆菌中改善前体物IPP 的供给，优化发酵过程的pH 值
后，胞内CoQ 10的含量高达2.4 mg/g DCW [10]。

Dawei 等构建的重组大肠杆菌中，通过共表达系统同时表达dps 和ubi CA 基因，补料培养32 h CoQ 10的产量达到了50.29 mg/L [46]。

说明利用重组大肠杆菌生产CoQ 10具有较好的潜力，可以通过重组大肠杆菌的代谢工程操作进一步提高CoQ 10的产量。

对CoQ 合成代谢途径的分析可以看出，虽然已经对CoQ 合成途径及其调控机制进行了较多研究，但是该途径中有的酶及其调控机制尚未完全阐明（如由酿酒酵母中酪氨酸生成对羟基苯甲酸途径），尚需进一步研究；其次，增加莽草酸途径和MEP 途径的碳通量，是增加CoQ 10产量的重要策略。

CoQ 10合成的过程中，每合成一分子产物需要一分子PHBA 和一分子PPP ，还需要SAM 和O 2的供给，因此要提高CoQ 10产量必须保证前体的协同供给。

外源途径的引入也是提高CoQ 10产量的重要策略，如酿酒酵母中的MVP 途径、酪氨酸生成对羟基苯甲酸途径，外源途径的引入不仅能够提高前体物的通量，还可以绕开途径中某些限制步骤。

化工进展 2009年第28卷·862·
通过代谢工程的合理设计与分析，使微生物向大量合成目标产物的方向代谢，是构建具有重大经济价值的工程菌的一种重要策略。

CoQ10的生物合成网络比较复杂，利用重组大肠杆菌生产CoQ10的研究中，对于某一限速步骤进行改良后，有可能造成了其它节点成为限速步骤，从而使某局部节点的改善不能发挥其应有的潜能，甚至某些中间产物的过多积累时造成细胞的损伤。

因此，要获得理想的CoQ10生产菌株，利用大肠杆菌代谢工程生产CoQ10时，应进行系统的代谢通量分析，分析细胞途径通量，识别途径中的柔性和刚性节点，确定修饰或改造的靶点，进行多点协同改造。

此外，生物过程的优化包括两个方面：菌株的优化和过程工程的优化。

构建的高产菌株还需要进一步探讨其合适的培养基，培养条件以及前体添加的优化。

要实现CoQ10的工业化生产，应从多方面结合进行，包括生物合成途径的探讨分析，代谢工程高产CoQ10大肠杆菌工程菌株的构建、高产菌株的选育、发酵工艺过程的优化、CoQ10的分离纯化等。

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