桔霉素检测技术研究现状及展望

桔霉素检测技术研究现状及展望
李秀利;曹学丽;廖永红
【摘要】Citrinin is a toxic secondary metabolites produced by several
fungi ,w hich exists widely in food. The mycotoxin is hepatonephrotoxic and implicated in disease outbreaks in animals and humans. In recent years ,it attracts wide concerns in the field of food safety ,and its detection methods are continuous-ly improved. In this paper ,the physicochemical properties ,toxicities ,sources ,sample pre-treatment and analytical methods of citrinin were reviewed in detail ,and the detection of citrinin in monascus products and red sufu ,a vast consumptive traditional Chinese food were also discussed.%桔霉素是霉菌的次级代谢产物，在食品中广泛存在，对人和动物具有肾毒性，近年来在食品安全领域受到广泛关注，桔霉素的分析检测方法也不断发展进步。

文章对桔霉素的理化性质、毒性、来源、及其分析方法、前处理方法进行了详细综述，并对我国食用历史悠久、食用量大的红曲及其相关产品中桔霉素的分析检测问题进行了探讨。

【期刊名称】《分析仪器》
【年(卷),期】2014(000)001
【总页数】6页(P1-6)
【关键词】桔霉素;分析方法;前处理方法;食品;红曲产品
【作者】李秀利;曹学丽;廖永红
【作者单位】北京工商大学食品学院，食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，北京100048;北京工商大学食品学院，食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，北京100048;北京工商大学食品学院，食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，北京 100048
【正文语种】中文
1 前言
桔霉素（citrinin）分子式为C13H14O5，分子量为250.25，结构式如图1，是一个醌类的甲基化合物，具有荧光特性（λex＝331nm，λem＝500nm），在低pH、β－CD环糊精溶液、乙腈、醋酸环境中荧光性会加强［1］。

它是霉菌代谢产生的次级代谢产物。

1931年首次从桔青霉中分离得到［2］，后来又证实其它一些青霉、曲霉属真菌也会产生桔霉素。

最早研究发现，桔霉素具有抗菌、抑制细菌繁殖、抑制真菌、抑制原生动物的性能［3］，后来发现桔霉素具有肝毒性、生殖毒性、诱导细胞畸变和凋亡［4］。

目前世界多国已有关于桔霉素的研究，桔霉素曾在世界各地的多种农产品、食品、红曲制品、饲料中被检出。

在我国被桔霉素污染的主要食物是发霉的谷物、饲料、红曲及其相关产品。

一般情况下，桔霉素在食物中的含量较低，食品被桔霉素污染后，外观上没有明显变化，无法用肉眼辨识，因此对相关产品中桔霉素的快速准确检测显得尤为重要。

图1 桔霉素结构式
2 桔霉素的分析方法
2.1 分光光度法
因为桔霉素可产生荧光，所以最早用荧光光度计进行桔霉素的定性或定量。

1984年，Trantham［5］对玉米、大麦和花生中的桔霉素进行半定量荧光检测，最高
回收率仅为66.6%。

Vazquez［6］又用此法对奶酪中分离的青霉菌培养物进行检测，pH为2.5时，在365nm下可见黄色荧光，整个检测过程操作简单、快速，5min内就能得出结果。

Zhou［7］等在研究桔霉素的荧光性质时，采用F－2700型荧光光度计，λex＝330nm，λem＝500nm，可检测出80μg／kg的桔霉素溶液。

现在荧光检测器多联于液相色谱仪，作为一种检测手段，比紫外检测器的灵敏度高100倍。

分光光度法虽然操作简单、速度快、成本低，但受各种干扰物的影响，其准确度较低，检测范围一般在几十μg／kg以上，仅适合于大量样品的筛选。

2.2 薄层色谱法
在液相色谱流行之前，薄层色谱（TLC，thin layer chromatography）是一种既实用，又快速、经济的霉菌毒素检测方法。

从1983年 Gimeno［8］用TLC检测苹果和梨中的桔霉素以来，已有许多人用此方法检测食品中的桔霉素。

L.Abrunhosa［9］以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝5∶4∶1为展开剂，对葡萄真菌培养物中桔霉素进行定性检测，3－甲基－2－苯并噻唑酰腙氢氧化物喷雾后，110℃加热15min显色。

Blanc［10］用改进的双向层析法检测了红曲霉中的桔霉素。

他预先将硅胶板在含有10%草酸的乙醇溶液中浸泡，第一相：氯仿∶丙酮＝90∶10，第二相：甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝6∶3∶1，然后在366nm下检测黄色荧光定性。

宫慧梅［11］也用同样的方法检测了红曲中的桔霉素，第一相分离除桔霉素外的其它成分，第二相分离桔霉素，最小检出量为0.1μg。

Ajaz［12］用高效薄层色谱法（HPTLC）检测霉菌发酵液中的桔霉素和洛伐他汀，以甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝3∶2∶1为展开溶剂，对HPTLC板上的样品进行展开，测得样品中的桔霉素含量为243.37mg／kg。

TLC 法通常所用的检测波长是366nm 或254nm。

检测桔霉素存在的主要问题是它本身的荧光较弱，可在用之前将TLC 板浸渍于酸性有机溶液中，或用之后暴露于吡啶、醋酸酐蒸气或浸入氯化铝试剂中
显色。

为了减少拖尾，还可适当加入乙醇酸，使桔霉素点更清晰。

TLC法速度快，但其灵敏度较低，重现性差，通常用来做定性检测。

但高效薄层色谱则可以同时检测多种物质，节省试剂和时间，灵敏度也大大提高，可在生产中用于快速常规分析。

2.3 高效液相色谱法
在过去的十几年中，高效液相色谱（HPLC）在真菌毒素检测中用的越来越多，在桔霉素的检测当中，液相色谱法也是最普遍的方法，已成功地应用于谷物、奶酪、饲料、红曲米等桔霉素的检测当中。

但是在色谱柱、流动相、柱温、进样量、检测器等的选择上各不相同［13］，表1按照时间顺序列出了HPLC检测桔霉素的进
展情况。

总体来讲，反相HPLC是检测桔霉素最常用的方法，因为从桔霉素的性质上看，
它对疏水性试剂有较高的亲和力。

另外桔霉素的荧光性，使用荧光检测器的灵敏度可比紫外检测器提高100倍，检测波长为λex＝331nm，λem＝500nm。

在洗脱液的选择上最常使用的试剂是磷酸水、甲醇、乙腈，梯度洗脱或恒定洗脱。

随着检测仪器的不断改进，超高压液相色谱逐渐兴起，成为未来的发展趋势，Els［23］
和Han［24］都研究了超高压液相色谱串联质谱（UHPLC－MS－MS）同时分析多种霉菌毒素的方法，取得了很好的结果，具体情况将在液质联用部分详细介绍。

2.4 液质联用
液质联用最早在2001年应用于桔霉素检测，当时Tuomi［25］采用LC－ESI－MS－MS法检测桔霉素，他先将样品提取净化，然后用反相液相色谱和电喷雾离
子化质谱检测。

液质连用通常采用ESI离子化法，MRM 模式，检测 m／z为251、233、205、191的几个特征峰。

潘振球［26］等用液质连用检测桔霉素时，质谱采用电喷雾离子化，正离子方式，条件为：喷雾电压3900V，传输毛细管温度270℃，氮气43aU，离子吹扫气5aU，碰撞气1aU，母离子m／z＝251（M＋1），Tube Lens为105V，子离子 m／z233和m／z205，碰撞能量分别为14V
和27V。

得到最低检出限为2μg／kg。

近年来液质联用的方法倾向于向同时检测几十种毒素的方向发展，追求更高效的方法。

2008年Spanjer［27］建立了同时检测33种霉菌毒素的方法，样品经乙腈－水混合液提取后，直接进LC－MS／MS，30min内全部出结果。

2010年Rasmussen［28］寻找出 LC－MS／MS同时检测玉米青贮饲料中27种真菌毒素的方法。

随着超高压液相色谱的兴起，有人开始尝试用它代替高效液相色谱。

Els用UHPLC－MS－MS方法对青贮玉米中26种真菌毒素进行了同时定量，样品提取后经WatersHLB柱纯化，再用液质联用仪分析，桔霉素在3.62min出峰。

Han也用类似的仪器对中药中35种霉菌毒素进行了同时检测，17min内完成分析，桔霉素的最低检出限为0.03μg／kg。

UHPLCMS－MS比高效液相色谱所用色谱柱柱效更高，分析时间缩短，使用溶剂更少，分离效果更好，是未来的发展趋势。

表1 HPLC法检测桔霉素样品固定相流动相检测器检出限参考文献真菌提取物Nucleosil，C18反相柱，5μm水、乙腈（0.05% 三氟乙酸）梯度洗脱，流速2.0mL／min紫外（254nm）定性分析［14］谷物食品正相 Si100 column，C18，5μm n－正己烷∶三氯甲烷＝60∶40，1.0mL／min 光电二极管阵列检测器0.1ng／g ［15］发酵玉米 Nova－Pak，C18，150×3.9mm i.d.乙腈∶异丙醇∶0.75M磷酸＝35∶10∶55荧光（λex＝360nm，λem＝500nm） 0.1ng／g ［16］干酪及其提取物桔霉素Nucleosil，离子对C18反相柱，5μm，
250×4.6mm i.d.Hypersil，ODS 反相柱，250 ×4.6mm i.d.含有四丁胺氢氧化物的甲醇，用1M盐酸调pH为5.5，流速0.8mL／min甲醇∶0.25M 磷酸＝80∶20，流速0.5mL／min荧光（λex＝331nm，λem＝500nm）0.91×10－7 M ［17］荧光（λex＝331nm，λem＝500nm） 100pg ［18］谷物早餐 C18，3μm，250 ×4.6mm i.d.0.33M磷酸∶乙腈∶异丙醇＝70∶30∶5，流速0.7mL／min荧光（λex＝331nm，λem＝500nm）0.5μg／kg ［19］红曲类产品 C18
反相柱，5μm，250×4.6mm i.d.乙腈∶水（磷酸调pH为2.5）＝35∶65，流速
1mL／min荧光（λex＝331nm，λem＝500nm）50μg／L或1mg／kg ［20］红曲米 C18反相柱，5μm，250×4.6mm i.d.小麦 C18反相柱，5μm，
250×4.0mm i.d.乙腈∶水（0.1%磷酸）＝45∶55，流速1mL／min 0.33M磷酸∶乙腈∶异丙醇＝65∶40∶5，流速1mL／min荧光（λex＝331nm，λem＝
500nm）0.8μg／kg ［21］荧光（λex＝330nm，λem＝500nm）0.25μg／kg ［22］
2.5 毛细管电泳
毛细管电泳是一种很优秀的分析方法，经常用于药物分析，与液相色谱相比，毛细管电泳所需用的样品量更少，更节省试剂，分析时间也更短。

2007年起毛细管电泳开始应用于桔霉素检测。

常用的有毛细管区带电泳和胶束电动毛细管电泳。

Zhu ［29］采用毛细管区带电泳，检测发酵食品中的桔霉素，条件是正极15kV电压，柱子是内径75μm、长度48.5cm的二氧化硅毛细管柱。

最近Biljana［30］进一
步研究出采用胶束电动毛细管电泳同时检测红曲米中的洛伐他汀和桔霉素的方法，电解液为20mM磷酸盐缓冲液（pH7.0）和30mM十二烷基磺酸钠，外加电压
25kV，216nm下检测，可在2min之内完成检测，桔霉素的最低检出限为
0.08μg／kg。

可见毛细管电泳法的灵敏度也很高，但由于价格较高，应用不如液
相色谱普遍。

2.6 免疫分析法
免疫检测法不需要前处理，可以快速筛选出被测物质，专一性强，灵敏度也远远高于其它方法，已被用于许多毒素的检测，近几年也开始应用于桔霉素的检测。

免疫检测法包括酶联免疫吸附法（ELISA）、放射免疫分析法、免疫层析法。

ELISA一个重要环节是抗体的制备。

桔霉素是一种小分子半抗原，无免疫原性，必须将其连接到大分子载体上形成偶联物，然后免疫动物才会产生针对半抗原的特异
性抗体。

目前所用最多的载体是牛血清白蛋白、匙孔血蓝蛋白，使用最多的免疫动物是兔子、小鼠。

Duan［31］等用桔霉素人造抗原免疫来亨蛋鸡，从鸡蛋中提取并纯化得到桔霉素免疫球蛋白（IgY），分子量接近100KD，进一步建立了间接竞争ELISA法，检出限为10ng／mL，在20～640ng／mL范围内线性关系良好。

此法还可通过血液检查病人是否桔霉素中毒，具有很强的实用性。

Li［32］等是采用桔霉素和匙孔血蓝蛋白连接制成人造抗原，用其免疫小鼠，得到IgG，将样品用甲醇超声提取后，用间接竞争ELISA检测，最低检出限为0.01ng／mL，与红曲
色素的交叉反应低于0.01%，回收率为89%～92%。

但陈福生［33］认为甲醇处理的样品中色素含量较高，附着于酶联板孔内壁很难去除，使吸光值上升，测得桔霉素含量偏低。

ELISA方法基于抗原抗体结合反应，避免假阳性和假阴性的出现非常重要。

一般认为单克隆抗体特异性强、亲和力高，只有一个识别位点，与免疫原其它成分无交叉反应，是最合适的抗体类型。

而多克隆抗体特异性差，容易造成假阳性结果。

李泳宁［34］用合成的桔霉素－蛋白偶联抗原、免疫小鼠，得到IgM
类单克隆抗体，交叉反应率低于0.1%，以此建立的ELISA方法的IC50值为
0.3μg／L。

但单克隆抗体固定的亲和性和局限的生物活性限制了它的应用范围，
其反应强度不如多克隆抗体，而且制备技术复杂、费时费工，所以单克隆抗体的价格也较高［35］。

放射免疫分析灵敏度高、特异性强，但由于放射性物质对人体有害，对仪器设备、操作人员要求较高，限制了它的推广使用。

David Heber［36］曾用放射免疫分
析方法检测我国红曲米中的桔霉素，采用竞争免疫分析法，加入酶标二抗并洗脱后，加入一种无色的色原体，与之结合后显示蓝色，加入终止剂后，蓝色转变为黄色，在450nm下检测即可。

免疫层析法也是检测毒素的好方法，该方法以胶体金颗粒、乳胶颗粒、磁性颗粒等示踪粒子代替标记酶，它能迅速稳定与抗原或抗体结合，使其带颜色，可用于检测
各种物质。

这种方法特异性强、灵敏度高、操作简便、反应迅速，特别适用于大量样品的检测，应用前景广阔，但未见应用于桔霉素检测的报道。

2.7 电化学法
2012年起电化学法开始应用于桔霉素的检测，阿根廷人Adrian［37］首次用生
物传感器检测大米中的桔霉素，使用碳电极，电极由许多碳纳米管组成，管内填充矿物油、辣根过氧化物酶和二茂铁作为氧化还原剂，传感器表面覆盖着透析膜。

将大米样品经萃取之后，用此方法检测，最低检出限是0.25nM。

在此之前，他还研究过用免疫传感器的方法检测大米中的桔霉素［38］，该方法用到两种不同动物
产生的桔霉素抗体和辣根过氧化物酶，检测在2min内就能完成，而且灵敏度很高，最低检出限为0.1ng／mL。

虽然如此，电化学检测方法应用于桔霉素检测还处于
起步阶段，有待进一步研究。

3 桔霉素前处理方法
上述桔霉素的检测方法，除免疫检测法外，都需要一个样品前处理过程。

样品的前处理，过程复杂，一般在分析工作里占70%以上的时间，并直接影响检测结果的
准确性和可行性。

将痕量桔霉素从生物流体或生物基质中释放出来，除去其中的干扰杂质，并达到仪器可检测的浓度范围是目前检测桔霉素的技术壁垒，有许多学者尝试用不同的方法对样品进行提取和净化。

3.1 液液萃取
液液萃取也叫溶剂萃取，即向待分离溶液中加入与之不互溶的萃取剂，利用各组分在两相中溶解度（包括经化学反应后的溶解）的差别，实现组分间的分离。

Chiraz Zaied［22］检测突尼斯小麦中的桔霉素，将研磨后的样品用乙腈：4%氯化钾溶
液＝9：1提取，滤液加入正己烷萃取，弃去上相，再加入水：氯仿＝1：1萃取，上相旋蒸后甲醇溶解，即可进液相检测。

Polisenska［39］检测捷克谷物中的桔
霉素时，用磷酸（0.33M）：乙腈：丙二醇＝700：300：50的混合溶液进行萃取，
再进行液相检测。

在采用液液萃取（LLE）的方法时，应尽量节省步骤，因为步骤多，相对耗时较长，而且会因器皿吸附而造成样品损失。

3.2 固相萃取
固相萃取是一种精度高、回收率高的样品处理技术。

许多物质可作为固定相柱填料，如硅胶、氧化铝、活性炭、C18、C8、弗罗里硅土、凝胶、分子印迹聚合物等。

现在固相萃取用品已经商品化，在市场上就可以买到各种型号的固相萃取小柱和固相萃取装置。

Frenich［40］分析鸡蛋中的霉菌毒素时，在采用溶剂提取后，用
C18或Oasis HLB柱进一步对样品进行净化。

Han［24］在提取中药中的桔霉素时，用硅胶填充的自制固相萃取柱和购买的固相萃取装置上进行萃取，甲醇为洗脱液。

总体来讲，固相萃取（SPE）所用试剂少，速度快，可以使样品得到富集，检测结果更好，是目前微量物质分析中常用的方法。

3.3 免疫亲和柱净化技术
IAC是霉菌毒素检测中较受欢迎的一种方法，利用抗原－抗体反应灵敏度高特异性强的特点，大大提高了样品的净化效果和检测灵敏度。

检测效果很大程度上依赖于抗体的特异性。

目前有很多人研究这种方法，有的是将聚合物与桔霉素抗体偶联，自制免疫亲和柱，有的是使用市场上的桔霉素免疫亲和柱产品。

许艳丽［41］检
测辣椒中的桔霉素，样品用甲醇：水＝70：30预处理后，用美国Vicam公司的
桔霉素免疫亲和柱净化。

Zhu［29］等自制免疫亲和柱，从牛血清蛋白中得到桔
霉素抗体，将其用硅胶固定，制成前处理免疫亲和柱，该柱子的最大容量为
380ng桔霉素，回收率为80.4%～97.1%。

4 红曲及其相关产品中桔霉素检测问题
虽然桔霉素在食品中广泛存在，但粮谷、水果类食品只要不腐败变质，就可避免桔霉素的存在。

而红曲及其相关产品则不同，有研究表明，目前我国食品工业用的红曲霉菌株大都产桔霉素。

而且我国红曲及其相关发酵产品食用量相当大，这类食品
中桔霉素的检测至关重要。

红曲制品本身成分复杂，色素含量高，其中桔霉素的检测，最关键的还是样品的前处理问题。

目前红曲霉培养液、红曲米、红曲醋、红曲红、中药红曲中的桔霉素检测都已有研究，红曲保健品还有专门的国标方法［42］检测桔霉素。

但还有一些
红曲产品，如红腐乳、红曲酒、红曲糕点中的桔霉素的检测鲜见报道。

5 展望
综上所述，目前对食品中桔霉素的分析检测方法的研究已经达到了较高的水平，但在各种分析手段不断改进的今天，检测方法还有很大的提升空间，超高压液相色谱和免疫法会在将来得到充分发展，也是桔霉素检测方法未来的发展趋势。

今后还可从前处理着手，建立QuECHERS（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe）的萃取方法，改进红曲及其相关产品中桔霉素的检测，不仅提高食品质量
安全，还可增强出口竞争力。

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