基于ITS2序列的柴胡属植物种子的鉴定及遗传多样性分析

中药与临床Pharmacy and Clinics o f Chinese Materia Medica 2Q2\.，\2(2)
•品种品质1•基于ITS2序列的柴胡属植物种子的鉴定及遗传多样性分析
康蕾，周兰玉，闫婕，高继海，陈江，裴瑾，彭成
[摘要]目的：本研究旨在对国家中药种质资源库收集的41份柴胡属植物种子进行分子鉴定，验证ITS2序列对柴胡属
植物种子的鉴定能力，并分析柴胡属植物的遗传多样性。

方法：应用ITS2序列测定样品种子的DNA序列，从分子角度鉴
定柴胡属种子的物种，并构建系统聚类树，分析其遗传多样性。

结果：鉴定出8种柴胡属植物的种子，2种非柴胡属植物
的种子，测得的所有种子DNA序列的GC量在53.9%-57.0%,平均为55.7%，变异位点数202个，K2P遗传距离为0-1.460，
构建出UPGMA聚类树。

结论：基于ITS2序列的分子鉴定方法可成功鉴别柴胡属药用埴物及其混淆品的种子，是一种操
作方便，准确性高、鉴定效果好的鉴定方法。

柴胡属植物物种内及物种间具有丰富的遗传多样性，相同物种间的遗传变
异相对稳定，种质及生态环境对柴胡属药用植物的遗传变异有较大的影响。

[关键词]柴胡属植物；ITS2序列；D N A条形码技术；遗传多样性
[中图分类号]R 282 [文献标识码]A [文章编号]1674-926X(2021)02-001-05
Identification and genetic diversity analysis of Bupleurum seed based on ITS2 Sequence / KANG Lei, ZHOU Lan-yu, YAN Jie, GAO Ji-hai, CHEN Jiang, PEI Jin, PENG Cheng // (State Key Laboratory o f Characteristic Chinese Medicine Resources
in Southwest China, Chengdu University o f Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, Sichuan)
(Abstract) Objective: The aim of this study was to identify 41 species of Bupleurum seeds from the state seed bank, verify the sequencing ability of ITS2 sequences on Bupleurum plants, and analyze the genetic diversity of Bupleurum plants. Method: The DNA sequence of sample seeds was detected by ITS2 sequence. The species of Bupleurum seeds were identified from molecular point of view, and the system clustering tree was constructed to analyze its genetic diversity. Result: The seeds
of 8 species of Bupleurum and 2 seeds of non-Bupleurum plants were identified. The GC content of all seed DNA sequences was 53.9%-57.0%, with an average of 55.7% and 202 sites of variation. The K2P genetic distance was 0-1.460, and the UPGMA clustering tree was constructed. Conclusion: The molecular identification method based on ITS2 sequence can successfully identify the seeds of Bupleurum and its adulterants, which is a convenient, accurate and effective method. There are abundant genetic diversity within and among species of Bupleurum, and the genetic variation among the same species is relatively stable. Germplasm and ecological environment have great influence on genetic variation of Bupleurum plant.
[Key words] Bupleurum plant; ITS2 sequence; DNA barcode technology; genetic divers
[基金项目]中国博士后科学基金（2020M673566X B),国家 自然科学基金委青年科学基金项目（81503200);
四川省科技厅应用基础研究计划项目
(2019YJ0333),中央引导地方专项目“西南特色
中药资源基因组学创新平台”（2020ZYD058),
成都中医药大学“杏林学者”学科人才科研提升计
划（QNXZ2018015, CXTD2018003)
[作者单位]西南特色中药资源重点实验室成都中医药大学药 学院，成都611137
[作者简介]康蕾（19%-)，女，本科在读，专业：中药资源 与开发
Tel:183****5695Email:1909502822@
[通讯作者]闫婕（1984-),女，博士，讲师，研究方向：中药品种、质量及资源研究
Tel:158****3271Email:yanjie9@126.co
[收稿日期]2020-12-22
柴胡属植物药用品种众多，应用历史悠久，分 布广泛，我国有35种、6变种、7变型[1]。

自古以来，就有柴胡属多种植物的根和地上部分入药121。

目前，全国约有20余种在各地区作为柴胡类中药人药[3'41。

柴胡属植物常依靠种子繁殖，果实为双悬果，分果 椭圆形或卵状长圆形，外具5棱。

国家中药种质资源 库对柴胡属植物的种子（实为果实）进行了广泛收 集，这些种子的形态极为近似，通过传统方法鉴别 极为困难。

目前，DNA条形码技术在中药鉴定领域取得较 好进展。

其中18S~26S核rRNA基因的内转录间隔区 (internal transcribed spacer,丨TS)具有序列短、多拷贝、两端具有保守区易于通用引物的设计、扩增容 易、鉴定效果好等优点，是研究物种遗传变异、系统发育和生物遗传多样性的最重要的分子标记>8]。

中药与临床尸/iawiacj CZ/n/cs o/C/n_«ese Mater/a MetZ/ca 2021; 12(2) ITS2与国际条形码联盟推荐的叶绿体序列rbcl和matK
联合条形码相比具有显著高效性，中药品种鉴定率高
达92.7%，尤其适合存在DNA降解的中药材材料19M1、
通过比较不同DNA条形码在柴胡属植物中的鉴定效
率，本实验拟采用ITS2序列对柴胡属种子进行分子
鉴定。

本文对国家种质资源库收集的41分柴胡属种子
进行DNA提取，利用ITS2序列进行分子鉴别，验证
了ITS2鉴定柴胡属种子方法的可行性，为提高国家
中药种质资源库物种分子鉴别的效率和准确性提供
基础数据，为柴胡属植物及为伞形科其它药用属的
种质资源的分子鉴定及保存具有指导意义。

1仪器与材料
1.1仪器和试剂
PCR扩增仪（BIO RAD)，台式微量高速离心
机（HITACHI),移液器（Eppendorfjt本德），电
泳仪（BIO RAD)，凝胶成像系统（BIO RAD)，
X射线辐射成像系统（Faxitron MX-20)。

DNA提取
试剂来自TIANGEN公司，弓丨物来自成都擎科梓熙生
物技术有限公司。

1.2材料
本实验所使用的样品为国家中药种质资源库收
集的41份柴胡属植物种子，分别采自河北、河南、
甘肃、湖北、湖南、吉林、青海、陕西、安徽、四
川等10个省。

表1实验材料来源
产地份数编号
河北114、5、6、7、9、10、11、12、13、14、36
河南416、18、20、39
甘肃138、21、22、23、24、28、29、31、33、34、
35、37、38
四川330、32、41
湖北219、40
湖南117
吉林41、2、3
青海225、26
陕西127
安徽115
2方法
2.1形态学观察
将完成净选的种子放在体视镜下观察记录外观 形态特征，并采集种子的照片。

2.2种子饱满度筛查
使用X-ray辐射成像系统对实验样品进行检查，除去干瘪虫蛀的种子。

挑选出饱满度较高的种子，备用。

2.3 DNA提取
取种子样品30-40 mg，用自动研磨仪研磨1mm 后，采用植物基因组DNA提取试剂盒提取总DNA，提取的DNA用琼脂糖凝胶电泳法检测。

将合格样品 的DNA进行PCR扩增。

2.4 PCR扩增和测序
PCR扩增引物为ITS2 F:5’-ATG CGA TAC TTG GTG TGA AT-3’和ITS2 R:5’-GAC GCT TCT CCA GACTACAAT-3’。

PCR反应体积50叫，包括样品 DNA l|iL,ITS2F2nL,ITS2R 2^L,mix 25 |iL, ddH20 2〇n L,PCR反应扩增程序为98 °C预变性3 min、98 -C变性 10s,55 -C IO s,72 °C10s,35个循 环，72 I：延伸时间2 min,8 °C保存。

PCR扩增产物 送自成都擎科梓熙生物技术有限公司进行双向测序。

lO O b p
图1PCR扩增产物电泳图（部分）
(Marker D2000)
2.5柴胡属植物种子样品的分子鉴定
运用软件CodonCode Aligner (CodonCode.，USA)对测得的序列进行拼接及校对，得到样品的目标序列。

分别在NCBI GenBank (http://www.ncbi.nlm. /blast/blast.cgi)和中药材DNA条形码鉴定系统 ()的BLAST鉴定系统中检索 本课题测得的目标序列，检索结果中相似度最高的 物种即为样品分子鉴定的结果。

2.6遗传多样性分析
将鉴定结果为柴胡属植物的扩增得到的ITS 序列导人MEGA7.0 (molecular evoutionary genetics analysis)软件中，进行K2P(Kimura 2-parameter)遗 传距离分析、碱基组成并构建UPGMA((Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Mean)系统聚类 树，分析柴胡属植物的遗传多样性。

3结果
3.1形态学观察结果
经过种子形态学鉴别可知：41分样品均为双悬 果，柴胡属植物的分果外形极为相似，均呈椭圆形 或卵状长圆形，两侧略扁平
，果棱线形，稍有狭翅
中药与临床 Pharmacy and Clinics o f C hinese Materia Medica 2Q 2Y.,12(2)
或不明显，横剖面圆形或近五边形。

前胡属刺尖前 胡（5号）的果实椭圆形，背部扁压，中棱和背棱丝 线形稍突起，合生面紧紧契合，不易分离；迷果芹 属迷果芹（31号）果实呈长圆形，两侧微扁，合生 面收缩，外面有5条突出的主棱。

3号 30号
5号
31号
图2部分样品体视镜照片
3.2样品DNA 提取及ITS 2序列PCR 扩增
样品提取所得的DNA 经琼脂糖凝胶电泳法检 测之后出现清晰明亮的核酸条带，说明各样品均成 功提取出总DNA 。

PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳法检 测之后均在750bp -1 OOObp 之间出现整齐明亮的清晰 核酸条带，说明各样品均有效扩增出ITS 2序列的条 带。

3.3鉴定结果
经鉴定，41份样品分别来自于10种伞形科植 物，结果如下。

表2物种鉴定结果
基原拉丁名
份数
种子编号
1、2、
3、 6、 8、 9、 10、 12、柴胡B upleurum chinense
2013、14、 16、 17、 19、 21、 28、 33、 36、 37、 38、 40、 41银州柴胡及
711、18、 20、 22、 27、 34、 39
黄花鸭跖柴胡
B. com m elynoideum var.
523、 24、 25、 26、 35
fla viflo ru m
竹叶柴胡万.329、 30、 32
黑柴胡5w /7/»7
14红柴胡B. sco rzo n efifo liu tn 17三岛柴胡B. fd /c a tu m
1
15
刺尖前胡
P eucedanum elegans
迷果芹
31
Sphallerocarpus g ra c ilis
3.4碱基组成
样品的ITS 序列的平均长度为503b p ，样品的
ITS 序列的变异位点有202个、信息位点156个，分 别占总位点数40.2%和31%,其中核苷酸频率分别是 (T ) 25.2%、（A )19.3%、（C )26.6%、（G )29.0%，序 列GC 量在53.9%-57.0%,平均量在55.7%。

3.5 K 2P 遗传距离
对本课题所用的39个实验柴胡样品进行K 2P 遗传 距离计算，详情见表3和表4,由表可知，本次实验 样品的计算数值在0-1.460,相同物种的遗传距离计 算数值在0-1.401，不同物种的遗传距离数值在0.004- 1.460,相同地区的遗传距离计算值在0-1.432,不同 地区物种的遗传距离计算值在0-1.460。

结果表明， 柴胡种内遗传变异程度较大，其物种内与物种间具 有丰富的遗传多样性。

表3基于ITS 2序列的柴胡属种子K 2P 遗传距离
B. B.
B _ B.
B. B. B. com m elynoideum B.ch in en se
kom arovianum
sm ithii
scorzonerifolium
yin ch o w en se
fa lc a tu m
var. F laviflorum
m arginatum
B. chinense 0-1.315B. kom arovianum
0.029-1.379—
B. sm ithii 0.924-1.344 1.269—
B. scorzonerifolium
0.033-1.3320.012 1.269—
B. yin ch o w en se
0.004-1.4600.033-1.3640.029-1.3290.033-1.3410-1.401B. fa lc a tu m 0.938-1.334 1.2630.012 1.2630.033-1.320—
B. com m elynoideum var. F laviflorum 0.030-1.4060.008-1.3180.012-1.2540.012-1.3180.033-1.3520.025-1.2480-1.304B. m arginatum
0.908-1.432
1.341
0.029-033
1.341
0-1.376
0.033-0.037
0.033-1.326
0-0.004
•4 •_药与'\备床Pharmacy and Clinics of C hinese Materia Medica 2Q2V,12(T)
表4基于ITS2序列的不同地区柴胡种子的K2P遗传距离
吉林河北河南湖北湖南甘肃陕西四川安徽青海吉林0.004-0.028
河北0-1.4120-1.438
河南0.004-1.4380-1.4650.033-1.412
湖北0-0.0320-1.3760-1.4380.004
湖南0.004-1.4120-1.4180-1.4380.004-1.412-
甘肃0-1.4060-1.4320-1.4600-0.0040-1.4320-1.432
陕西0.004-0.0320-1.3760.004-1.401 1.352-1.387 1.3760-1.369-
四川0-1.4280-1.4380-1.4120-1.4120-1.4120-1.4320.004-1.3760.004-1.418
安徽0.004-1.4120-1.4380-1.412 1.376-1.4120.0000-1.432 1.3760-1.412-
青海0-1.3870-1.4120.025-1.387 1.352-1.3870.0330-1.406 1.3520.033-1.3870.0330-0.917
3.6 UPGMA系统发育树
以UPGMA法对所得的39份柴胡ITS序列构建 系统发育树，所得的结果如图4，由图可知，39个 样本可以聚为3类，编号为1、6、9、14、36、13、16、2、12、40、41、8、28、11、34、22、37、19、33、27、38的样品聚集成第一大类，编号为7、3、35的样品聚集成成第二类，编号为4、10、15、17、18、20、21、23、24、25、28、29、30、39的样品聚集成成第三大类。

分析聚类图可知，41份柴 胡样品大致上按照种质来进行分类，但其中也有 差异，如编号为 11、18、20、22、27、34、39的B. yinchowense并不十分严格的聚在一起。

结果表明，柴胡种质对柴胡的遗传变异影响较大。

除此之外，分析聚类图还可得知，除种质对柴胡有较大的影响 外，河北、四川、甘肃等地所产的多种柴胡属植物 也聚集在一起，这表明产地即生态环境对柴胡的遗 传变异也有不可避免的影响。

4讨论
4.1种子的鉴定结果
检索测得的样品IT S2序列，鉴定出8种柴胡 属植物的种子，分别为柴胡S.长白柴
胡5.黑柴胡谓/加7、狭叶柴胡 S. ■y corzonenyb/fwm、银州柴胡S.j/nc/jovvense、二岛 柴胡/a/can<w、黄花鸭妬柴胡S.cowwe/jno/deww var.F/av^/Zorww、竹叶柴胡5. 2种伞形科非柴胡属植物的种子，分别为前胡属刺尖前胡Pet/cet/am/m e/ega/w和迷果序属迷果序
grac/f e，说明分子鉴定方法可成功鉴别柴胡属植物 的种子及同科其他易混淆物种的种子，是一种操作方 便、准确性高的鉴定方法，对于国家中药种质资源库 收集保存种子的准确性具有指导意义。

4.2 ITS2序列对柴胡属植物的测序能力
本实验运用丨TS2序列对实验样品进行测序，41 份样品全部测序成功，成功率达到1〇〇%。

1TS2序列 对不同柴胡属植物的及同科其他2种植物的种子均能 成功测
序，所得序列在两系统都能被检索并鉴定。

中药与胳床Pharmacy and Clinics of Chinese Materia Medica 2021.，12(2)
说明运用ITS2序列对柴胡属植物进行测序具有很强 的可操作性，可用于柴胡属药用植物及易混淆物种 种子的分子鉴定。

4.3遗传多样性分析
柴胡属植物来源广泛，我国现知的柴胡属种类 有35种、6变种、7变型。

本研究中，样品ITS序列 的变异位点较多，说明柴胡种内遗传变异成程度较 大。

计算样品的种内、种间以及地区的K2P遗传距 离，其计算结果数值范围较大，表明柴胡属植物物 种内及物种间具有丰富的遗传多样性。

柴胡样本的 聚类结果与种质来源显著一致，表明相同物种间的 柴胡的遗传变异相对稳定。

这与王秀全[12]基于RAPD 序列分析不同种质来源的柴胡植物遗传多样性的研 究相一致，但本课题柴胡属植物的系统聚类图中S.并不十分严格的聚在一起，这表明
的遗传多样性可能正在降低，需要加强 对其种质资源的保护。

竹叶柴胡S.与银州柴胡常聚集在一起，说明两者之间 DNA序列有较强的相似性，亲缘关系较近，这与甘 肃大量种植的竹叶柴胡也被鉴定为银州柴胡[13，14]的 结果是一致的。

另外，柴胡属植物在全国的分布区 域区也十分广阔，西北与西南高原地区，河南、河 北、甘肃、北京等地区自古以来都是我国野生柴胡 的主要产地。

本研究中，河北、甘肃、四川等地区 的柴胡表现出较为稳定的遗传变异现象，表明柴胡 的生长环境对柴胡的遗传多样性也有显著影响，这 与张永刚[15]的研究结果相一致。

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(责任编辑：何瑶）。