L乳酸高产菌株的诱变选育

合集下载
  1. 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
  2. 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
  3. 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。

$&$#+ , ?@":,・ >8#:
+&$ , 尿 素 $&# ,
$&$,, , CDC:) ;8#3:,
高 乳 酸 平 板 (9 ) 葡 萄 糖
$&$* , =6":,・ >8#:
%$ ,琼脂
(9 )
$&$#+ , ?@":,・ >8#:
尿素
$&$,, ,乳酸
#&$ , 78*&$ ; $&# , ;8#3:,
# , 78*&$ ;
$&$#+< ?@":,・ # , 78*&$ ; $&# ,
$&# ,
!"#$%&’$
!"#$% &’ ()$ #(*"+’ ,*$$%+’- ()$&*. "’% /$(",&0+1 $’-+’$$*+’- ()$&*.2 ()$ #$0$1(+&’ "’% ,*$$%+’- &3 " 4 50"1(+1 "1+% 6*&%71+’- /7("’( 8$*$ #.#($/"(+1"00. #(7%+$% +’ ()+# ()$#+#2+’107%+’,*$$%+’- "’% 4 50"1(+1 "1+% 3$*/$’("(+&’ 6*&1$## ,. "660.+’- 70(*"9+&0$( 0+-)( (& /7("-$’+:$ ;<<45 =>?@A3($* 3$*/$’(+’- 3&* BC )&7*# ()$ /7("’( #("+’ -"9$ " 4 50"1(+1 "1+% &7(67( &3 D=@C?- E 42=D@?FG )+-)$* ()"’ ()"( &3 ()$ 6"*$’( #("+’ "’% #("60$ 0"1(+1 "1+% 6*&%71$% +# 453&*/@ ()* +,%-# !"#$%&’( %)*$+, H 450"1(+1 "1+% ; ,*$$%+’-H
研究与探讨
!纯化 ! 细胞或孢子悬浮液制备
诱变剂量确定 活细胞计数 !
诱变剂处理 活细胞计数!中间培养 初筛
!目的突变株分离
!
! 复筛
! 生产性实验
作用后的变色圈、 透明圈、 生长圈、 抑菌圈或沉淀圈。 因为它可以粗略的表示菌株产生某些生理物质活性 的高低。复筛的过程是在代谢控制发酵育种中对突 变株发酵培养基的组成 (包括碳源、 氮源、 无机盐、 生 长因子等) 、 种子培养、 接种量、 培养温度、 培养时间、
斜面培养基
3-’ ; %$$453-’ 中 加 $&%6 溴 钾 酚
(9 ) 琥 珀 酸 (08,) ), #":,
溴钾酚紫平板 琥珀酸平板
紫、 $&%6 脱氧胆酸钠、 78*&$ ;
关键词 米根霉
’(乳酸
诱变育种
$&* , ;8#3:, >8#:
溴化钾
$&$#< =6":,・ >8#: $&$$%< 琼脂
收稿日期: #$$%(%$(#+ 作者简介:乔长晟 ($*1*( ) , 男, 讲师, 研究方向: 发酵工程。
%&#&#
细胞悬浮液的制备
根据经验, 一 般 诱 变 处
理真菌的孢子, 其细胞悬浮液的浓度为 %$* 个 L 45 。 细
!""!#!
万方数据
%&
!"#$%"$ &%’ ($")%*+*,- *. /**’ #%’0123胞悬浮液的浓度可用平板活菌计数法和血球计数板 计数法测定,本课题根据实际选用这两种方法同时 进行。悬浮液根据所使用的诱变剂的不同, 可用生理 盐水或用缓冲液配制。一般情况下, 使用物理诱变剂 处理时, 用生理盐水配制; 使用化学诱变剂处理时, 因此使用 由于 !" 的变化易引起诱变剂性质的改变, 缓冲液配制细胞悬浮液。本课题采用的是紫外线作 诱变剂, 所以用生理盐水配制细胞悬浮液。 乳酸产生菌的诱变筛选 收集上述 产 酸 菌 的 出发菌株
米根霉产 &’乳酸机制的探讨
米根霉产 90 乳酸的途径 丙酮酸在乳酸 葡萄糖经 BGH 途 径 生 成 丙 酮 酸 ,
中, 将其置于磁力搅拌器上; 预 5$ 开 启 &’6 紫 外 灯 , 开启磁力搅拌器, 打开皿盖, 分别照射 热 %’*-. 后 ,
%、 1、 (、 ,、 #’ 、 #% 、 #1 、 #(*-. ; /$ 取不同时间诱变处 理 的
复筛。前者以量 (选 留 菌 株 的 数 量 ) 为主, 后者以质 (测定数据的精度) 为主。初筛的要求是根据在平板 上的直观反应挑选高产菌株。所谓平板上直观反应, 是指每个菌落产生的代谢产物与培养基内的指示剂
%(
!""!#!
万方数据
研究与探讨
!"#$%&’("$%’%))%
$** $** (* 4/ /* 4* )E* )* -* #* !* $* * * ! 图$ 存活率 (5) 存活率
菌液 #*+ , 分别做 #’0#、 涂于溴甲酚 #’0%、 #’0& 倍稀释, 计算每皿菌落。 紫平板上于 &17 培养 1,8 ,
脱氢酶的作用下生成乳酸, 乳酸的前体物 0 丙酮酸除 生成乳酸外,还在丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶的作 用下生成乙醇,也可以在丙酮酸羧化酶的催化下通 过二氧化碳作用生成苹果酸和富马酸,丙酮酸经丙 酮酸脱氢酶系进入 DIE 循环以提供足够的能量和合 成菌体的中间产物。因此, 要想提高乳酸的产量, 必 须切断或减弱丙酮酸脱羧酶和丙酮酸羧化酶的催化 反应。根据米根霉发酵乳酸的代谢机制, 90 乳酸高产 菌应具有以下生化特征: 有较高的乳酸脱氢酶活性; 弱化的丙酮酸脱羧酶, 乙醇脱氢酶活性减弱或失活; 弱化的二氧化碳固定能力;耐高浓度的葡萄糖、 乳 酸, 不具有以乳酸为唯一碳源而生长的能力。 育种思路 根据对育种的经典 方 法 的 研 究 和
中图分类号: !"#$%&# 文献标识码: ’ 文 章 编 号 : %$$#($)$* (#$$# ) $#($$)+($,
$&$,,< AB":,
$&#+ ,琼脂
高锰酸钾(溴化钾平板
(9 ) ;=@:,
葡萄糖 高 葡 萄 糖 平 板 (9 )
#$ , 尿 素
;8#3:,
$&$) , =6":,・ >8#: >&$ , 78*&$ ;
!"、供氧等参数进行精确的测定,找出最佳发酵条
件, 以便放大。 本课题的筛选方案如下: 第一轮: 一株出发菌株 初筛, 每株一瓶 出三株 第二轮: 三株出发菌株 初筛, 每株一瓶 出三株 第三轮、 第四轮…… (同第二轮) 。 以上筛选工作可以连续进行多轮,直 至 获 得 良 好结果为止。采用这种筛选方案, 不仅可以通过较少 的工作量得到较好的菌株,而且还可以使某些眼前 产量虽不高, 但有发展前途的优良菌株不致落选。 诱变剂处理 ! 选出三十株 诱变剂处理 ! 选出三十株单菌落 ! 每株三瓶 !复筛,
玻璃管平板初筛乳酸产生菌的探讨变色圈法是用于检出产酸菌的常用方法由于米根霉在平板上的蔓延生长使得无法通过观察变色圈与菌落直径之比来检查出乳酸高产菌加入脱氧胆酸钠获得单菌落是由于脱氧胆酸钠抑制了菌株孢子的形成所致因而在平板上所观察到的变色圈并不是菌株充分生长后真正产酸水平的体现同时由于孢子的形成受到抑制也无法观察到诱变前后孢子形态的变异无法得到形态突变株
#$&$& #$&$1
存活率的测定 残糖的测定
平板记数法。
C=F 显色法。
!
!#$ !#!
结果与讨论
菌种选育程序 筛选方案
关于筛选方案,一般认为筛选过程分 为 初 筛 和
%$&$%
对糖酵解途径的解析,本课题特制定了以下的育种 思路: 4$ 利 用 溴 钾 酚 紫 平 板 选 出 产 酸 的 菌 株 ; 5$ 经 紫 外线诱变后再利用高锰酸钾平板筛选出产乳酸的菌 株; /$ 利用琥珀酸平 板 筛 选 出 BGH 途 径 强 化 DIE 途 径减弱的菌株; 高酸平板筛选出耐高渗 J$ 利 用 高 糖 、 的菌株; K$ 利用纯乳酸平板筛选出不分解利用乳酸的
+ ,琼脂
摇瓶培养基
#&$ , 78*&$ ;
(9 )
2&$ , 08,0:)
・ $&$#+ , ?@":,
$&# , ;8#3:, >8#:
白胨
・ $&$* , =6":, >8#: 葡萄糖
$&$$+ , CDC:)
%&+ , 08,0:)
>&$ , 78 自然;
+&$ , 酵 母 膏 %&+ , 蛋
研究与探讨
!"#$%&’("$%’%))%
! " 乳酸高产菌株 的 诱 变 选 育
(宁夏农学院食品科学系, 永宁 !"#$#") 乔长晟 汤凤霞 苏建宇 朱晓红

要 以代谢控制 发 酵 理 论 为 依 据 , 利 用 紫 外 线 对 %&&’()*" 进行诱变处理, 然后用溴钾酚紫平板、 高锰酸钾平板、 高 糖平板、 高酸平板、 纯乳酸平板、 琥珀酸平板, 筛选得到一 株高产 ’( 乳 酸 的 正 向 突 变 菌 株 %+,(#)- ,其 平 均 产 酸 率为 !).#"/ 0 ’ , 对糖的转化率为 12.)3。
!选 出 十 株
!选
#$%$1
表型的出现, 表型的改变落后于基因型改变的现象, 称为表型延迟, 为了克服表型延迟, 必须将诱变处理 的菌液进行中间培养,即将一定量的菌液接入完全 液体培养基中培养过夜。 玻璃管初筛平板的制作 将 直 径 为 #%** 的
! !选
!选 出 十 株
每株三瓶 !复筛,
#$%$2
玻璃管截成 #2** 长的玻璃管,用硫酸 0 重铬酸钾洗 液浸泡, 洗涤, 干热灭菌备用。 将无菌融化后的培养基
#’’*+ 倒入平整的直径为 #2’** 的培养皿中,凝固
前无菌操作放入 #%3#2** 的玻璃管中, 凝固后可用。
#$%$(
致死率曲线的制作
4$ 取 #’*+ 菌液于培养皿
!#%
%$&$#
"
葡萄糖 酸果糖 甘油酸 丙酮酸
!!"磷酸葡萄糖 !$"磷酸甘油醛 !%"磷酸甘油酸 乙醇 ! 乙醛 !
!"二磷 !!"磷酸果糖 !#, #, $"二磷酸甘油酸 !$"磷酸 ! !磷酸烯醇式丙酮酸 !
纯乳酸平板 ・ $&$* , =6":, >8#: 乳酸
・ $&$#+ , ?@":, >8#: 葡萄糖
$&$,, ,
乳酸是一种常见的结构简单的羟基羧酸 , 广 泛 存在于人体、 动物体、 植物和微生物中, 乳酸按其旋 (( ) —乳 酸 , (/ ) —乳 酸 和 -.—乳 酸 光性可分为 . 三种。 人体只能代谢利用其中的 .—乳酸, 因此, 世界 卫 生 组 织 提 倡 使 用 .—乳 酸 作 为 食 品 添 加 剂 和 内 服 药, 取代目前普遍使用的 -.—乳酸。此外, .—乳酸, 农业和化 .—乳酸盐及其聚合物还广泛应用于医药、 学工业。尤其近几年, 人们利用 .—乳酸聚合生成的 聚 .—乳酸制造生物降解塑料、 绿色包装材料及农用 薄膜, 用以解决日益严重的环境污染问题, 引起了世 界的广泛关注, 应用前景非常广阔。 以 本 课 题 采 用 011.()2+ 米 根 霉 为 出 发 菌 株 , 紫外线为诱变剂,经筛选得到一株高产乳酸且耐高 渗并且不分解利用乳酸的正向突变菌株。
$
$#$
材料与方法
实验材料
菌种 米根霉 011.)2+ ;
$#!
%&#&%
实验方法
产酸菌的分离 取 011.)2+ 菌 株 孢 子 洗 脱
分 别 稀 释 %$ 、 然后分别 液 %$45 , %$#、 %$)、 %$,、 %$+ 倍 , 取 %45 涂于溴钾酚紫平板, 在 ),E 培养 JI , 分离出变 色圈大的菌落接入斜面保藏。
#$%$&
孢子配制成 #’( 个孢 子 ) *+ 的 悬 浮 液 , 取 #’*+ 置 于 培养皿中, 用磁力搅拌器搅拌的过程中, 用紫外灯照 射 ,*-. , 照射距离 &’/*。 将诱变菌液在琥珀酸平板、 高锰酸钾 0 溴化钾平板、 高葡萄糖平板、 高乳酸平板、 纯乳酸平板上涂布分离,挑选在琥珀酸平板上生长 慢、 菌落小的, 耐高葡萄糖、 高乳酸且不分解利用乳 酸的产乳酸的菌珠进行斜面保藏。 中间培养 突变基因的出现并不意 味 着 突 变
中间培养基
$&# , ;8#3:,
・ $&$) , =6":,
>8#:
・ $&$#+ , ?@":, >8#:
$&$$+ , 78*&$ 。
以上培养基均采用 %#%E , %+4F@ 湿热灭菌。 其 中葡萄糖采用 $&$+=3D<)$4F@ ;尿素采用 $&$>+=3D , 碳酸钙灭菌后加入, 其灭菌条件是 %+$E , 干热 )4F@ ; 灭菌 #G 。 斜面培养: 培 养 +H>I ; 平板培养: 培 ),E , ),E , 养 ,JG ; 复筛摇瓶培ห้องสมุดไป่ตู้: 培养 *$G , 装液量 *$45 , ),E , 摇床转速为 #$$K L 4F@ 。
$#%
#$&$# #$&$%
分析方法
!" 的测定
用 !" 计测定。 定性测定采用纸层析法: 展
90 乳 酸 的 测 定
开剂为正 丁 醇 : 甲 酸 : 水 (2:&:# , , 显色剂; ; ) ;) ’$%< 溴 钾酚紫 :’$’2< 甲 基 红 :’$2<=4>"?#:#:’$#2@; ) ;A ; 定量 测定采用 BCDE 定钙法。
相关文档
最新文档