Bt杀虫基因与Bt转基因抗虫植物研究进展

植物学通报　1999,16(1):51～58
Chinese Bulletin of Botany
Bt杀虫基因与Bt转基因抗虫植物研究进展①
王忠华　舒庆尧　崔海瑞　夏英武
(浙江大学原子核农业科学研究所　杭州　310029)
摘要　苏云金杆菌是一类非常重要的昆虫病原体,它能产生特异性的杀虫结晶蛋白,对农业上和生物医学上的许多有害的昆虫有毒杀作用,这些害虫包括鳞翅目、双翅目、鞘翅目、膜翅目、螨类和线虫。

近三十年来,以苏云金杆菌为基础的生物杀虫剂已在世界范围内商业化用于防治重要经济作物的害虫。

近年来有关Bt基因的遗传、分子生物学和基因工程已取得显著进展。

本文对苏云金杆菌杀虫晶体蛋白基因的分类和杀虫机理及用该类基因构建的工程转基因植物研究状况作一简要综述,同时对Bt基因工程存在的潜在问题和解决途径作了简单的探讨。

关键词　苏云金杆菌,杀虫结晶蛋白基因,抗虫植物,基因工程
THE STU DY OF INSECT2RESISTANT PLANT WITH
BACILL US THURINGIENSIS CR YSTAL
PROTEIN GENES
WAN G Zhong2Hua　SHU Qing2Yao　CU I Hai2Rui　XIA Y ing2Wu
(Instit ute of N uclear A gricult ural Sciences,Zhejiang U niversity,Hangzhou310029)
Abstract　B.thuringiensis(Bt)is a very important entomopathogen since it can produce specifically toxic crystal proteins against many agriculturally and biomedically detrimental pests including lepidopteran,dipteran,coleopteran,hymenopteran,acarian and nematodes. Commercial Bt2based biopesticides were used worldwide for controlling economically impor2 tant pests in the past30years.Significant progress has been made in recent years on Bt ge2 netics,molecular biology and genetic engineering.This review will focus on classification and insecticide mechanism of Bt crystal protein genes,the application of Bt crystal protein genes in engineering of insect2resistant plants.In addition,the potential problems of Bt toxic pro2 tein gene engineering and resolving ways will be discussed.
K ey w ords　Bacillus thuringiensis,Crystal protein genes,Insect2resistant plants,G ene En2 gineering
虫害是制约农作物高产、稳产的重要因素。

据联合国粮农组织统计,全世界虫害造成的损失约占农作物总收成的13%,每年大约损失数千亿美元。

如何有效地防治害虫,减少损失已受到各国政府和科学家的普遍关注,化学防治随着时间的推移其弊端越来越突出,如化学农药不仅会对人、畜有严重危害,也会因其在自然界中的残留及在食物链中的富积造成严重的环境污染;化学农药的作用方式往往是非特异性的,不但杀死了害虫,也
①浙江省“九五”重大项目和洛氏基金资助项目。

52　植物学通报16卷
杀死了有益的昆虫和害虫的天敌,造成生态平衡的破坏。

而生物防治却能克服上述缺点,因而受到人们的高度重视和密切关注。

其大致有三条防治策略,即生物杀虫剂、生态防治和培育抗虫品种,其中最有效的方法是培育抗虫品种。

但常规抗虫育种由于育种周期长,种质资源有限,加上抗虫机制不太明了等原因,其利用受到极大的限制。

鉴于此,最理想的、有前途的方法是通过遗传工程手段培育农作物抗虫品种,即将抗虫基因通过一定的途径导入农作物中,使其在寄主细胞内稳定地遗传和表达,从而形成抗虫新品系或新品种。

目前,在植物抗虫基因工程中使用的抗虫基因主要有两大类,一类是从细菌中分离出来的细菌抗虫基因,如Bt毒蛋白基因、异戊基转移酶基因(ipt);另一类是从植物中分离出来的植物抗虫基因,如豇豆胰蛋白酶抑制剂基因、马铃薯蛋白酶抑制剂2Ⅱ基因、淀粉酶抑制剂基因、外源凝集素基因等。

Bt毒蛋白基因工程是目前开展得最广泛和最有潜力的抗虫基因工程。

本文对近十年来Bt毒蛋白基因工程的研究状况作一简要综述。

1　Bt毒蛋白的杀虫机理及基因分类
Bt是Bacillus thuringiensis的简称,其中文名称是苏云金杆菌。

它是一类非常重要的病原性细菌,广泛分布在世界各地。

苏云金杆菌在芽孢形成过程中产生蛋白质,并以结晶方式出现。

这些蛋白质具有特异性的杀虫活性,通常被称为杀虫结晶蛋白(insecticidal crystal protein即ICP)或δ2内毒素或苏云杆菌毒蛋白(Bt toxic protein)。

Bt毒蛋白在伴孢晶体内是以原毒素(Protoxin)的形式存在,当被鳞翅目等昆虫摄食之后,在昆虫幼虫的肠道内经蛋白酶水解,转变成为65～70kD带有N2末端的具有杀虫活性的毒性多肽分子,它可以与敏感昆虫的肠道上皮细胞表面的特异受体相互作用,诱导细胞膜产生一些非特异性小孔,扰乱细胞的渗透平衡,并引起细胞肿胀甚至裂解,从而导致昆虫幼虫停止进食而最终死亡(林良斌等,1997)。

目前已发现Bt杀虫蛋白对许多重要的农作物害虫,包括鳞翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目等都具有特异性的毒杀作用,而对人、畜、哺乳动物和天敌无害(罗科等,1995;Krattiger,1997)。

近三十年来,由于Bt基因的重要性,科研工作者加速了对它的研究,目前已有数千个Bt菌株被分离和纯化。

根据其生化特性和鞭毛抗源反应性,已分离纯化的菌株可分成30种血清型,但仅知道Bt的血清型或菌株,并不能准确地知道其杀虫蛋白质基因和杀虫活性及范围,而且由于不同的研究者经常使用不同的名字来命名他们克隆到的基因,这样也很容易造成混淆。

鉴于此,Hofte等(1989)根据从克隆基因推导的杀虫蛋白质氨基酸序列的相似性和蛋白质的杀虫活性,把已克隆的基因分成类型,分别用罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ等来命名,这些数字代表了Bt杀虫蛋白质的几种杀虫范围(如Ⅰ和Ⅱ指明了对鳞翅目昆虫的毒性,Ⅲ和Ⅳ分别代表了对鞘翅目和双翅目昆虫的毒性等)。

在每一类型下用英文字母A、B、C等代表不同的基因型,然后用小写的英文字母表示同一基因型内由于核苷酸序列差异造成的基因亚型。

按照此系统,编码Bt杀虫蛋白质的基因称为晶体蛋白质基因(简称cry),其编码的蛋白质称为晶体蛋白质(简称Cry)。

此后,该系统分类方法被广泛地采用,但随着克隆毒素蛋白基因的增多,发现按照该系统进行分类在氨基酸序列和杀虫活性间存在矛盾。

为此,在第一届Bt分子生物学大会上成立了Bt毒蛋白基因命名委员会。

新的Bt毒蛋白基因分类系统只以氨基酸序列为分类依据。

据报道,到1995
年上半年止,已发现96种Bt 毒蛋白基因(Pefereon ,1997),1997年则超过了100种。

表1是氨基酸序列同源性小于96%的54种Bt 毒蛋白基因。

表1　氨基酸序列同源性小于96%的54种Bt 毒蛋白基因
Bt 毒蛋白基因沿用的名称编码蛋白质的分子量(kD )杀虫范围一些靶标昆虫cry1Aa1cryIA (a )133500L
烟草天蛾,欧洲玉米螟等　cry1Ab1cryIA (b )130615L
棉叶夜蛾等cry1Ac1cryIA (c )131000L
小菜蛾等cry1Ad1cryIA (d )131000L
粉纹夜蛾等cry1Ae1cryIA (e )131000L
欧洲玉米螟等cry1Ba1cryIB 136500L/C
大菜粉蝶等cry1Bb1ET5136500L
大菜粉蝶等cry1Bc1cryIB (c )138000L
烟草天蛾等cry1Ca1cryIC 132000L
甘蓝夜蛾等cry1Cb1cryIC (b )130500L
粉纹夜蛾等cry1Da1cryID 129500L
烟草天蛾等cryDb1prtB 129000不明
不明cry1Ea1cryIE 133236L
斜纹夜蛾等cryEb1cryIE (b )130500L
烟草天蛾等cry1Fa1cryIF 130500L
欧洲玉米螟等cry1Fb1prtD 131000不明
不明cry1G a1prtA 129500不明
不明cry1Ha1prtC 130000不明
不明cry1Ia1cryV 81200L/C
烟草天蛾等cry1Ib1cryV 80000不明
不明cry1Ja1ET4129500L
欧洲玉米螟等cry1J b1ET1131000L
烟草天蛾等cry1K a1cryI 不详不明
不明cry2Aa1cryIIA 70500L/D
舞毒蛾,烟草天蛾等cry2Ab1cryIIB 70500L
烟草天蛾等cry2Ac1cryIIC 69000L
烟草天蛾等cry3Aa1cryIIIA 72500C
cry3Ba1cryIIIB 74300C
cry3Bb1cryIIIBb 72500C
cry3Ca1cryIIID 73000C
cry4Aa1cryIVA 134545D
舞毒蛾等cry4Ba1cryIVB 126000D
舞毒蛾等
cry5Aa1cryVA (a )153500N
cry5Ab1cryVA (b )143000N
cry5Ba1PS86Q3139000C
cry6Aa1cryVIA 525000N
cry6Ba1cryVIB 44000N
cry7Aa1cryIIIC 126500C
cry7Ab1cryIIICb 126500C
cry8Aa1cryIIIE 128500C
cry8Ba1cryIIIG 130000C
cry8Ca1cryIIIF 127500C
cry9Aa1cryIG 128500L
1期王忠华等:Bt 杀虫基因与Bt 转基因抗虫植物研究进展53　
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cry9Ba1cryIX127000L
cry9Ca1cryIH129800L
cry10Aa1cryIVC75000D
cry11Aa1cryIVD71500D
cry11Ba1Jeg80不详D
cry12Aa1cryVB139500N
cry13Aa1cryVC89000N
cry14Aa1cryVD132800C
cry15Aa1cryV E38000L
Cyt1Aa1cytA27340无特异性
Cyt2Aa1cytB29000无特异性
注:表中L代表鳞翅目;C代表鞘翅目;D代表双翅目;N代表线虫纲
2　Bt转基因抗虫植物
Obukowics等学者在1986年将cryⅠA(b)基因经转座子Tn5介导引入到植物的假单孢杆菌中,使植物具有抗虫性,从而创造了第一代Bt转基因抗虫植物,这也是Bt毒蛋白基因使植物获得抗虫性的最早报道。

真正的Bt毒蛋白转基因植物是第二代Bt抗虫植物,第一个成功的例子是由比利时的植物遗传系统公司在1987年6月报道的(Vaeck等, 1987),他们用农杆菌介导法成功地将完整的cryⅠA(b)基因和3’、5’端缺失后只保留5’端编码毒蛋白核心区的不同长度的cryⅠA(b)基因导入烟草获得了抗烟草天蛾的转基因烟草植株。

自那时起,人们在Bt毒蛋白基因的修饰和改造、表达载体的构建、植物组织转化、抗虫植物的培育等方面进行了大量的研究(Krattiger,1997;Pefereon,1997a;Estruch 等,1997;Pefereon,1997b)。

迄今,国内外已有许多实验室和科研单位用不同的Bt毒蛋白基因和转化方法获得50多种不同的抗虫转基因植物,有的已进入大田试验和商品化生产阶段(详见表2)。

Krattiger(1997)报道,从1995年起,Bt转基因抗虫玉米、棉花和马铃薯已商品化,到1997年,全世界已发放Bt转基因抗虫玉米品种11个,棉花和马铃薯品种各5个,主要种植于8个国家和地区(见表3),其中美国的种植面积最大,1996年已达300万英亩,预计1997年可超过2000万英亩。

表4列举了部分转Bt抗虫植物的化学或抗虫性结果。

表2　已获得的转Bt杀虫晶体蛋白基因植物
植物类别转Bt毒蛋白基因的物种
粮、棉、油类水稻、玉米2、小麦、棉花2、大豆1、油菜1、花生、向日葵1
果树类苹果1、梨、甜橙、柑桔、葡萄、越桔、洋李、胡桃1、草莓、山楂、黄实黑茶麓子、悬钩子、酸果曼1、唐棣、番木瓜、花楸果、板栗
蔬菜类番茄1、茄子1、颠茄1、牛角椒、芹菜、芥菜、莴苣、白菜1、花椰菜1、卷心菜、芜箐、胡萝卜、豌豆、豇豆、鹰嘴豆、石刁柏、黄瓜、甜瓜、马铃薯2
林木杨树1、落叶松、白云杉、枫香树、欧洲黑杨
花卉类石竹、田旋花、长春花、玫瑰、兰花、矮牵牛、菊花
其它烟草1、甜菜1、苜蓿1、桔味薄荷、三叶草、甘蔗
注:1示已进入田间试验,2示已商品化
表3　已商品化的转Bt杀虫毒蛋白基因作物品种
作物类别转化基因品种来源商品化国家
玉米cryIA(b)Monsanto,Novartis,Mycogen阿根廷、加拿大、欧共体、日本、美国cryIA(c)Novartis美国
棉花cryIA(c)Monsanto,Delta and Pine Land澳大利亚、墨西哥、美国、南非cryIA(a)Monsanto美国
马铃薯cryIA(a)Monsanto加拿大、日本、美国、墨西哥
表4　部分Bt毒素蛋白基因转化植物检测结果
基因转基因植物　转化方法阶段化学检测结果或抗虫测试效果
cryⅠA(a)水稻花粉管通
道法实验室组织化学法测定转基因植株的GUS活性,结果表明与Bt杀虫基因形成翻译融合的GUS基因已表达(谢道昕等,1991)
cryⅠA(a)棉花花粉管通
道法大田实验Southern blotting结果表明,杀虫基因已整合到棉花基因组中.田间抗虫测试表明对棉铃虫抗虫效果明显(谢道昕等,1991)
cryIA(b)烟草农杆菌介导实验室用烟青虫作为测试昆虫,结果发现有60%的转基因植株对该虫有
致死或抑制作用(梁小友等,1994)
cryIA(b)番茄农杆菌介导大田实验 1.烟天蛾
人工接种150卵/株:转基因植株上的虫很快死亡,而对照大部分
全部落叶.
大田实验:转基因0.25%受害而对照9.5%受害
2.番茄果螟
人工接种:转基因8.7%受害而对照22.3%受害
大田实验:转基因4.1%受害而对照17.8%受害
3.番茄红铃虫
大田实验:转基因77.2∽83.6%受害而对照94.2%受害(莽克
强,1993)
cryIA (b)粳稻电击法实验室对R1,R2代进行化学检测,表明转基因植株中存在高水平的
cryIA(b)转录体(Fujimoto等,1993)
cryIA(b)籼稻基因枪法实验室抗虫性测试表明:转基因植株对二化螟、三化螟初孵幼虫致死率
均达100%,对稻纵卷叶螟为50∽60%(Wunn等,1996)
cryIA(b)香稻基因枪法实验室抗虫性测试表明:转基因植株对二化螟、三化螟的幼虫致死率为
70∽90%(Ghareyazie等,1997)
cryIA(b)马铃薯农杆菌介导实验室Southern blotting结果表明:可翻译的融合物已整合进了植物基因
组.抗虫测试表明转基因植株叶片受烟草天蛾新生幼虫的危害明
显减轻(Chen等,1992)
cryIA (b)玉米基因枪法大田实验每株接玉米螟300头幼虫:
转基因植株:叶片极轻微斑点无明显破孔,穗柄中隧道1.7∽7.
2cm;
对照植株:约一半叶有2∽3.5cm枯斑,每株有2∽3片叶中脉断,
穗柄隧道20∽50∽113cm(K oziel等,1993)
cryIA (b)棉花农杆菌介导大田实验棉铃虫接虫卵块为10∽15卵/铃:转基因植株保护率70∽75%而
对照100%受害(莽克强,1993)
cryIA (b)白云杉基因枪法实验室对2龄棕色卷蛾虽可杀死但统计学显著性不够.接种后6天虫体
显著减轻,有拒食现象(莽克强,1993)
1期王忠华等:Bt杀虫基因与Bt转基因抗虫植物研究进展55
cryIA(c)马铃薯农杆菌介导大田实验抗虫测试表明:马铃薯麦蛾死亡率为10%,玉米螟的存活率也明
显低于对照(Sticklen,1993)
cryIA(c)烟草农杆菌介导大田实验已选出5个纯合系,离体叶片或整株虫测,烟青虫1∽4龄幼虫,
30头以上/处理,80∽100%校正死亡率,残留虫体重显著减轻
(田颖川,1995)
cryIA(c)棉花农杆菌介导大田实验棉铃虫接虫10∽15卵/铃:转基因植株保护率70∽87%而对照
88%果受害(莽克强,1993)
cryIA(c)大豆基因枪法大田实验由转化品系增殖而成的植株对毒素-感受态烟草蚜虫具有很强
的杀虫活性,对具有相对毒素抗性的玉米铃虫具有很强活性(2
拷贝品系落叶率为7.5%,1拷贝品系为19%),而对照品系落叶
率为35∽50%(Stewart等,1995)
cryIA(c)花生基因枪法大田实验表达量:可溶性蛋白占总蛋白的0.18%;抗虫测试表明:转基因植
株幼虫死亡率为66∽100%(Chong等,1997)
cryIA(c)玉米子房注射法大田实验转基因玉米经点渍法,Southern blotting及PCR扩增均获得阳性
结果;用T1代植株叶片DNA进行扩增,在71株中有7株呈阳性
反应;对其中4株进行抗玉米螟测试,有一定的抗虫效果(丁群星
等,1993)
cryIA(c)欧洲黑杨农杆菌介导大田实验已选出抗虫能力60∽70%校正死亡率同时表型无明显差异,生长
势比对照好的株系共9个;杨尺蠖,舞毒蛾死亡率为80∽100%
(田颖川等,1993)
cryⅡA马铃薯农杆菌介导实验室Western印迹分析表明,转基因植株中的Bt蛋白占总蛋白的0.
005∽0.02%.抗虫测试表明:转基因植株获得了对科罗拉多马铃
薯甲虫的不完全保护(Gulina等,1994)
cryⅢA烟草农杆菌介导实验室表达量:可溶性蛋白占总蛋白的0.6%.抗虫测试表明:用3.6μg/
cmd的叶片喂虫可抑制90%马铃薯甲虫的生长(莽克强,1993) cryⅢA马铃薯电击法实验室抗虫测试表明:在63个转基因品系中有58个能防治马铃薯叶甲
一龄幼虫(Adang等,1993)
cryⅢB茄子叶盘共培
养法实验室Southern blotting结果表明:嵌合cryⅢB基因已稳定地整入了转基因株染色体同一连锁组的单一或多个位点;抗虫测试表明:8
个独立转基因植株的籽苗对科罗多拉马铃薯甲虫一龄和二龄幼
虫有明显抗性(Chen等,1995)
3　Bt毒蛋白抗虫基因工程的潜在问题、解决途径及展望
由上所述可以看到,从Bt毒蛋白基因到Bt转基因抗虫植物的研究已取得很大进展,但其在应用中的潜在问题也日益受到人们的关注。

首先Bt毒素蛋白基因抗虫谱较窄是一个很大的缺陷,尽管已分离到的Bt毒蛋白基因,其抗虫谱几乎覆盖了所有鳞翅目、鞘翅目、双翅目等害虫,但就具体而言,每一种Bt毒素蛋白基因的抗虫谱却十分有限;另一个严重问题是,昆虫易对杀虫结晶蛋白产生耐受性(周兆斓等,1994)。

苏云金杆菌杀虫制剂在农业上的应用已有几十年的历史,但尚未见在大田中昆虫对Bt毒蛋白产生耐受性的报道。

一个主要因素是Bt毒蛋白作用时间短,残留量低,使得选择压小。

但由于抗虫转基因植物的广泛应用使得这种情况正在发生显著变化,一年几代的昆虫连续暴露在Bt毒蛋白的作用下,增加了选择压,使有耐受性的昆虫群体得到发展,以致在群体水平上昆虫产生了耐受性(林良斌等,1997)。

据研究证明,晶体蛋白的杀虫机理是该蛋白与昆虫中肠道上皮纹缘膜细胞上的受体位点结合,引起并破坏纹缘膜细胞渗透压的平衡,使细胞裂56　植物学通报16卷
解,杀死昆虫.在长期选择压力下,纹缘膜细胞上的受体位点会发生改变,使晶体蛋白不能与纹缘膜细胞上的受体位点结合,失去毒杀作用,结果昆虫就产生了抗性(郭三堆,1995)。

可见,如何有效防止害虫产生耐受性将成为Bt 毒蛋白基因能否顺利应用于抗虫作物培育的关键。

第三是Bt 毒蛋白基因在植物体内表达的水平和稳定性问题。

目前已发现转基因在植物体内的表达存在着基因“沉默”现象(杨金水等,1995;Meyer ,1995;Taylor ,1997),也有转Bt 毒蛋白基因发生甲基化的报道(郭亮等,1997)。

即使转入的基因能表达,但若表达的水平低,也不能有效地毒杀害虫。

在目前所得的转Bt 毒蛋白基因植物中,Bt 毒蛋白基因的表达水平普遍较低,这也是众多Bt 转基因植物未进入商品化生产的主要原因之一。

鉴于此,人们已经设计了几种对策,以解决这些潜在的问题。

首先,同时使用两个以上的Bt 毒蛋白基因转化植物,这样即使害虫对其中一种产生耐受性,也不致于使植物丧失抗虫能力;其次,联合使用Bt 毒蛋白基因和其他类型的抗虫基因,如具有广谱抗虫特点的豇豆胰蛋白酶抑制剂(CPTI )基因。

这些措施对防止或延迟害虫产生耐受性具有一定的作用,同时对于扩大转基因植物的抗虫谱也会有很好的效果;再次,使用调控型启动子与Bt 毒蛋白基因构成嵌合基因,然后转化植物,培育出Bt 毒蛋白基因特异性表达的抗虫品种,使得Bt 毒蛋白基因只在害虫侵害时或者只在作物易受害虫侵害的部位或者只在一定的条件下(化学调节剂)高效表达,以减少产生耐受性昆虫种群的环境选择压,不利于耐受性昆虫种群的发展。

如利用Bt 毒蛋白基因和PR 2la (致病蛋白)基因的启动子构成嵌合基因,该启动子可受多种病源物的诱导和几种化学物(如水杨酸、聚丙烯酸)的诱导,然后用这种嵌合基因转化烟草可获得转基因植株,用化学调节物可以诱导Bt 毒蛋白基因在转基因植物中高效表达(林良斌等,1997)。

最近国际水稻所一批昆虫专家和分子生物学专家协作研究Bt 毒蛋白基因结构与功能的关系,以期达到控制昆虫对转基因作物产生耐受性的目的。

抗虫植物基因工程是一项应用性极强的研究,而Bt 基因工程作为最有潜力的抗虫基因工程就显得具有更大的应用价值。

目前Bt 基因工程虽然仍存在一些尚待解决的新问题,但一系列大田作物已获得抗虫能力,进入田间试验,甚至在一些国家已进入大面积推广阶段并取得可喜的成绩。

随着研究的进一步深入,越来越多的转Bt 基因抗虫材料将作为新的种质资源在常规育种中加以运用,相信在不远的将来,人们会实现培育抗虫作物,减少环境污染,保护人类健康的美好愿望。

参考文献
丁群星等,1993.中国科学B 辑,23(7):707～713
田颖川,1995.农业生物技术学报,13(2):45～52
田颖川等,1993.生物工程学报,9(4):291～297
林良斌等,1997.生物工程进展,17(2):51～56
周兆斓等,1994.生物工程进展,14(4):18～24
罗科等,1995.农业生物技术学报,13(3):15～20
杨金水等,1995.生物工程进展,15(3):41～45
莽克强,1993.生物工程进展,13(5):1～8
郭三堆,1995.中国农业科学,28(5):8～13
郭亮等,1997.遗传学报,24(3):255～262
谢道昕等,1991.中国科学B 辑,21(8):830～834
谢道昕等,1991.中国科学B 辑,21(4):367～373
1期王忠华等:Bt 杀虫基因与Bt 转基因抗虫植物研究进展57　
58　植物学通报16卷
梁小友等,1994.北京农业大学学报,20(4):347～353
Adang M J et al,1993.Plant Mol Biol,21(6):1131～1145
Chen J et al,1992.Plant Sci,81(1):83～91
Chen Q et al,1995.J A m Soc Hontic Sci,120(6):921～927
Chong S et al,1997.Transgenic Research,(6):169～176
Estruch J J et al,1997.N at ure Biotechnology,15(2):137～141
Fujimoto H et al,1993.Bio/Techology,11(10):1151～1155
Ghareyazie B,1997.Molecular B reedi ng,(3):401～414
Gulina I V et al,1994.Mol Biol,28(5):1166～1175
Hofte H et al,1989.Microbiol Rev,53(2):242～255
Krattiger A F,1997.ISAAA Briefs No.2.ISAAA:Ithaca,N Y pp42
K oziel M et al,1993.A bst r Pap A m Chem Soc,206.Meet
Meyer P,1995.Trends i n Biotechnology,13(9):332～337
Obukowics M G et al,1986.J Bacteriol,168:982～989
Pefereon M,1997a.Advances in insect control:the role of transgenic plants Taylor and Francis.pp21～48
Pefereon M,1997b.Trends i n Biotechnology,15(5):173～177
Stewart J r C N et al,1995.Plant Physiol,108(2)Suppl:22
Sticklen M B,1993.Biotechnol,A gric,25:233～236
Taylor C B,1997.The Plant Cell,9(9):1245～1249
Vaeck M et al,1987.N at ure,328(6125):33～37
Wunn J et al,1996.Biotechnology,14(2):171～176。