一起轮状病毒中毒案例分析-精选文档
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放入到试管内， 加入9倍的生理盐水后均匀搅拌，在静止后或者 低速离心以后，在加样处另外滴加3-4滴粪便上 清液，在室温情况下，10min以后进行辨别分析。 如果测试卡显示的是两条红线，即可判断属于 阳性，如果只仅仅出现一条对照线，则阴性， 若没有出现对照线，说明检测结果无效，必须 重新进行检测。
加入50μL核酸释放液，95℃，5min 4℃，10000g，离心10min
转移上清液（RNA）到无Rnase的离心管
real-time RT-PCR
报告结果
荧光PCR结果的判定 1、对照结果
ａ） 阳性对照：有荧光增幅现象；
ｂ） 阴性对照：无荧光增幅现象；
ｃ） 空白对照：无荧光增幅现象；
ｄ） 否则，实验视为无效
04
预期结果
预期结果：该患儿为轮状病毒感染 确诊依据： 1、细菌培养未见可疑菌生长 2、WBC/CRP值未出现升高现象 3、实时荧光PCR确诊结果阳性
致谢
GN肉汤(35 ℃ ,24h)
接种平板分离：B-P平 板、SS/HE、MAC
血常规检测 CRP值检测
分离平板上未见 可疑菌生长
病毒检测
血常规监测
在临床上可以通过动态血常规检测、CRP值检测 来对两种疾病新生儿进行初步鉴别。
轮状病毒感染新生儿通常有发热及轻微消化道症 状，易与严重细菌感染的新生儿混淆。从严重细菌感 染新生儿的WBC、CRP检测结果来看，发病初始阶 段（<12h）的WBC、CRP水平与轮状病毒感染新生 儿无无显著差异，但发病24h后则显著高于轮状病毒 新生儿。
01
real-time RT-PCR检测A组轮状病毒的灵敏度优于其他 4 种方法,可用于轮状病毒的高通量检测; ELISA和胶 体金具有良好的灵敏度与特异性,且胶体金成本低,非 常适合于初筛检测。行业标准推荐的RT-PCR尽管特 异性较高,但灵敏度偏低,有待改进，ELISA法诊断效 能优于胶体金法，胶体金法敏感、快速、单独样本可 随时检测。 综上 本小组选用胶体金法作为初筛方法
3、但同时还应该考虑到一些常见细菌的感染，例如：致病性大 肠杆菌（蛋花样粪便）、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等。
4、喂养不定时、不当或以淀粉食品为主食，或饮食脂肪过多以 及断奶后突然改变事物品种，均能引起轻~中度腹泻（消化不 良）。气候突然变化，腹部受凉肠蠕动增加；天气过热，消化液 分泌减少；由于口渴，乳脂过多，增加消化道负担，均易诱发腹 泻。大便为稀薄或蛋花汤样，无脓血和酸臭味，如不及时控制， 极易引发肠道感染。
real-time RT-PCR作为确诊方法
胶体金免疫层析法原理
02
胶体金免疫层析法原理：以抗A组轮状病毒多克隆抗体 包被硝酸纤维素膜、以胶体金标记的小鼠抗A组轮状病 毒VP6单克隆抗体为结合物，利用免疫层析原理来检测 粪便标本中的轮状病毒抗原。将试纸条插入用稀释液稀 释好的标本中后，胶体金结合物与标本一起移动，当移 动至硝酸纤维膜上的抗轮状病毒多抗时，如果标本中含 有轮状病毒，则胶体金-轮状病毒结合物会与抗轮状病毒 多抗结合，5-10分钟出现红色的检测线。多余胶体金结 合物继续移动，将与包被在膜上的羊抗鼠IgG抗体结合， 形成另外一条红色的对照线。
1. 案 例 分 析
2. 样品采集及前处理
目
3. 实 验 室 检 测
录
4. 预 期 结 果
01
案例分析
案例分析
1、 急性水样便腹泻，多为轮状病毒或产毒素性细菌感染。小儿 尤其是2岁以内婴幼儿，发病在冬秋季节，以轮状病毒肠炎可能 性大；发生在夏季以产肠毒性大肠杆菌（ETEC）肠炎可能性大。
2、根据患儿表现出的症状（发热、水样腹泻、呕吐、蛋花样粪 便）以及患病时间（深秋季节），高度怀疑为患儿感染了轮状病 毒（rotavirus）；
02
样本采集及前处理
样本种类及采样方式
1 婴儿奶粉：取30g奶粉于无菌采样袋中，密封 2 奶 瓶 ： 洁净棉拭子采样 3 患儿粪便：采样杯采集婴儿新鲜粪便，0℃保存 4 患儿血液：普通真空采集管采集患儿足跟血； 5 接触物品：洁净棉拭子采样 6 接触人群的手：洁净棉拭子采样
03
实验室检测
实验室检测
轮状病毒检测
轮状病毒：轮状病毒基因组由11个 不连续的dsRNA节段组成，分别编 码6个结构蛋白(VPI—VP4，VP6和 VP7)和5个非结构蛋白(NSP1一 NSP5)。VP6是内层衣壳的主要成 分，具有组和亚组抗原性，不同株 轮状病毒VP6蛋白具有高度保守性。
检测方法的选择
01
检测方法的选择
real-time RT-PCR检验流程图
取蛋花样便5mL离心 4℃，10000g，离心10min
取1mL上清液+0.14mL 16%PEG8000
冰上放置1h 4℃，10000g，离心10min
1mL结合缓冲液重悬沉淀
加入50μL纳米磁珠，混匀 室温放置5min~15min
磁力吸附纳米磁珠1min~5min，弃上清液
2、检测结果判定 A、同时进行的阴性、阳性和空白对照实验结果正常，待检
样品无荧光增幅现象，则判断样品中未检出Ａ 群轮状病毒。
B、同时进行的阴性、阳性和空白对照实验结果正常，待检 样品有明显的荧光增幅曲线，且Ct值≤ 35时，则判断样品中检出 Ａ 群轮状病毒。
C、同时进行的阴性、阳性和空白对照实验结果正常，待检 样品荧光增幅曲线的Ct值介于35和40之间时，应重新进行实时荧 光RT-PCR 检测。若重新检测的Ct值≥40时，则判断样品中未检出 A群轮状病毒。若重新检测的Ct值仍介于35和40之间，则判断样品 中检出A群轮状病毒
Part 1
动态血常规检测 CRP值检测
Part 2
细菌学检验
Part 3
病毒学检查
实验室检测流程图
患儿血液
接触物、手、奶 瓶棉拭子标本
奶粉溶解液
患儿粪便
直接接种平板: B-P平板(37℃,24h)、
MAC/SS/HE平板 (35~37 ℃ ，24h)
增菌：7.5%Nacl或胰酪 胨蛋白肉汤(37 ℃ ,24h) TTB增菌液（42 ℃ ,24h）
轮状病毒确诊
04
轮状病毒的确诊采用 real-time RT-PCR作为 确诊方法。
方法原理：，取待测样品，加入匀浆缓冲液 研磨，通过温育促进病毒粒子释 放，利用PEG8000使病毒沉降，采用纳米磁 珠直接从PEG8000沉降后的病毒悬液中富集 病毒粒子，吸
附于纳米磁珠上的病毒粒子经高温裂解，释 放出病毒RNA，无需进一步纯化，直接实时 荧光RT-PCR方法进行检测。
加入50μL核酸释放液，95℃，5min 4℃，10000g，离心10min
转移上清液（RNA）到无Rnase的离心管
real-time RT-PCR
报告结果
荧光PCR结果的判定 1、对照结果
ａ） 阳性对照：有荧光增幅现象；
ｂ） 阴性对照：无荧光增幅现象；
ｃ） 空白对照：无荧光增幅现象；
ｄ） 否则，实验视为无效
04
预期结果
预期结果：该患儿为轮状病毒感染 确诊依据： 1、细菌培养未见可疑菌生长 2、WBC/CRP值未出现升高现象 3、实时荧光PCR确诊结果阳性
致谢
GN肉汤(35 ℃ ,24h)
接种平板分离：B-P平 板、SS/HE、MAC
血常规检测 CRP值检测
分离平板上未见 可疑菌生长
病毒检测
血常规监测
在临床上可以通过动态血常规检测、CRP值检测 来对两种疾病新生儿进行初步鉴别。
轮状病毒感染新生儿通常有发热及轻微消化道症 状，易与严重细菌感染的新生儿混淆。从严重细菌感 染新生儿的WBC、CRP检测结果来看，发病初始阶 段（<12h）的WBC、CRP水平与轮状病毒感染新生 儿无无显著差异，但发病24h后则显著高于轮状病毒 新生儿。
01
real-time RT-PCR检测A组轮状病毒的灵敏度优于其他 4 种方法,可用于轮状病毒的高通量检测; ELISA和胶 体金具有良好的灵敏度与特异性,且胶体金成本低,非 常适合于初筛检测。行业标准推荐的RT-PCR尽管特 异性较高,但灵敏度偏低,有待改进，ELISA法诊断效 能优于胶体金法，胶体金法敏感、快速、单独样本可 随时检测。 综上 本小组选用胶体金法作为初筛方法
3、但同时还应该考虑到一些常见细菌的感染，例如：致病性大 肠杆菌（蛋花样粪便）、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等。
4、喂养不定时、不当或以淀粉食品为主食，或饮食脂肪过多以 及断奶后突然改变事物品种，均能引起轻~中度腹泻（消化不 良）。气候突然变化，腹部受凉肠蠕动增加；天气过热，消化液 分泌减少；由于口渴，乳脂过多，增加消化道负担，均易诱发腹 泻。大便为稀薄或蛋花汤样，无脓血和酸臭味，如不及时控制， 极易引发肠道感染。
real-time RT-PCR作为确诊方法
胶体金免疫层析法原理
02
胶体金免疫层析法原理：以抗A组轮状病毒多克隆抗体 包被硝酸纤维素膜、以胶体金标记的小鼠抗A组轮状病 毒VP6单克隆抗体为结合物，利用免疫层析原理来检测 粪便标本中的轮状病毒抗原。将试纸条插入用稀释液稀 释好的标本中后，胶体金结合物与标本一起移动，当移 动至硝酸纤维膜上的抗轮状病毒多抗时，如果标本中含 有轮状病毒，则胶体金-轮状病毒结合物会与抗轮状病毒 多抗结合，5-10分钟出现红色的检测线。多余胶体金结 合物继续移动，将与包被在膜上的羊抗鼠IgG抗体结合， 形成另外一条红色的对照线。
1. 案 例 分 析
2. 样品采集及前处理
目
3. 实 验 室 检 测
录
4. 预 期 结 果
01
案例分析
案例分析
1、 急性水样便腹泻，多为轮状病毒或产毒素性细菌感染。小儿 尤其是2岁以内婴幼儿，发病在冬秋季节，以轮状病毒肠炎可能 性大；发生在夏季以产肠毒性大肠杆菌（ETEC）肠炎可能性大。
2、根据患儿表现出的症状（发热、水样腹泻、呕吐、蛋花样粪 便）以及患病时间（深秋季节），高度怀疑为患儿感染了轮状病 毒（rotavirus）；
02
样本采集及前处理
样本种类及采样方式
1 婴儿奶粉：取30g奶粉于无菌采样袋中，密封 2 奶 瓶 ： 洁净棉拭子采样 3 患儿粪便：采样杯采集婴儿新鲜粪便，0℃保存 4 患儿血液：普通真空采集管采集患儿足跟血； 5 接触物品：洁净棉拭子采样 6 接触人群的手：洁净棉拭子采样
03
实验室检测
实验室检测
轮状病毒检测
轮状病毒：轮状病毒基因组由11个 不连续的dsRNA节段组成，分别编 码6个结构蛋白(VPI—VP4，VP6和 VP7)和5个非结构蛋白(NSP1一 NSP5)。VP6是内层衣壳的主要成 分，具有组和亚组抗原性，不同株 轮状病毒VP6蛋白具有高度保守性。
检测方法的选择
01
检测方法的选择
real-time RT-PCR检验流程图
取蛋花样便5mL离心 4℃，10000g，离心10min
取1mL上清液+0.14mL 16%PEG8000
冰上放置1h 4℃，10000g，离心10min
1mL结合缓冲液重悬沉淀
加入50μL纳米磁珠，混匀 室温放置5min~15min
磁力吸附纳米磁珠1min~5min，弃上清液
2、检测结果判定 A、同时进行的阴性、阳性和空白对照实验结果正常，待检
样品无荧光增幅现象，则判断样品中未检出Ａ 群轮状病毒。
B、同时进行的阴性、阳性和空白对照实验结果正常，待检 样品有明显的荧光增幅曲线，且Ct值≤ 35时，则判断样品中检出 Ａ 群轮状病毒。
C、同时进行的阴性、阳性和空白对照实验结果正常，待检 样品荧光增幅曲线的Ct值介于35和40之间时，应重新进行实时荧 光RT-PCR 检测。若重新检测的Ct值≥40时，则判断样品中未检出 A群轮状病毒。若重新检测的Ct值仍介于35和40之间，则判断样品 中检出A群轮状病毒
Part 1
动态血常规检测 CRP值检测
Part 2
细菌学检验
Part 3
病毒学检查
实验室检测流程图
患儿血液
接触物、手、奶 瓶棉拭子标本
奶粉溶解液
患儿粪便
直接接种平板: B-P平板(37℃,24h)、
MAC/SS/HE平板 (35~37 ℃ ，24h)
增菌：7.5%Nacl或胰酪 胨蛋白肉汤(37 ℃ ,24h) TTB增菌液（42 ℃ ,24h）
轮状病毒确诊
04
轮状病毒的确诊采用 real-time RT-PCR作为 确诊方法。
方法原理：，取待测样品，加入匀浆缓冲液 研磨，通过温育促进病毒粒子释 放，利用PEG8000使病毒沉降，采用纳米磁 珠直接从PEG8000沉降后的病毒悬液中富集 病毒粒子，吸
附于纳米磁珠上的病毒粒子经高温裂解，释 放出病毒RNA，无需进一步纯化，直接实时 荧光RT-PCR方法进行检测。