载脂蛋白PPT课件

④免疫印迹分析
取出转移后的NC膜在洗涤液中洗3次后，置封 闭液中室温封闭3h（或37℃1h
在洗涤液中洗3次
加入1：100稀释的第一抗体并充分混匀，37℃ 温浴6h（或过夜）
用洗涤液洗5次（10min×5）甩干
加入1：500稀释的第二抗体，混匀，37℃作用 2h
洗涤同上
加入新配制的底物溶液于室温下摇动直至出现 紫色（或紫褐色）并看到背景（1～5min）时 用蒸馏水冲洗终止反应，空气干燥封于塑料袋
Marcovina等
应用SDS-1.5%agarose凝胶电泳结合 免疫印迹技术，首次报道人类至少 有35种Apo（a）异构体，此法是在 Kamboh等法基础上发展起来的一种 高分辨的分析方法。
上述两类方法有许多共同点，即首先 采用电泳技术将Apo（a）与其他载 脂蛋白分离，然后Western blotting，灵敏而特异地显示Apo （a）多态区带的位置，最后根据其 与ApoB100电泳速率比较或根据其分 子量大小而确定Apo（a）表型。
免疫印迹反应中也可选用鼠抗人Apo（a） 单克隆抗体作为一抗，用酶标兔抗鼠IgG 作为二抗。
应用酶标抗体反应作为二抗时，底物以 脂溶性4-氯-1-萘酚或联茴香胺较水溶性 DAB溶液为好
金标、I125标抗体作为二抗，通过银染或 放射自显影技术显示Apo（a）蛋白区带
将生物素标记的抗体作为二抗，通过生 物素-亲和素系统放大信号，可大大提高 检测敏感性
③电转移
取此凝胶，切下分子量蛋白带放入SDS洗脱 液中过夜，以固定凝胶大小并洗脱掉未与蛋 白结合的SDS，0.01%考马斯亮蓝G-250染色 室温1h，7%乙酸脱去背景颜色。
剩余凝胶铺在已浸过转移电泳缓冲液的NC膜 上，搭建滤纸/凝胶/NC膜/滤纸一同放在电 泳转移支架上，按层次相夹置于装满转移电 泳缓冲液的电泳槽中。120V电泳6h（30℃以 下）或4℃30V转移过夜
3．Apo（a）异构体分子量与其血清Lp （a）浓度呈负相关。即高分子量 Apo（a）表型伴低Lp（a）浓度，低 分子量Apo（a）表型伴高Lp（a）浓 度，见图2所示
图2 Apo（a）异构体分子量，人群中出现频率 和血清Lp（a）水平
4．冠心病(CHD)患者与正常人Apo（a）表型频率 分布具有显著性差异，双表型频率明显高于正常 人,伴高Lp(a)水平的Apo（a）表型B、S1和S2频率 也显著高于正常人。同种表型者，冠心病组血清 Lp(a)水平多高于正常对照组。国内秦树存等研究 认为，Apo（a）低分子量表型（B、S1、S2）与高 水平的Lp（a）密切相关，为我国汉族人群中CHD 的独立的遗传危险因素。庄一义等研究发现Apo （a）研究表型在心脑血管疾病（CCVD）患者与正 常对照组之间的分布存在明显差异，伴高水平Lp （a）的表型B、S1在CCVD组中出现的频率（19%） 高于对照组（5.7%）；相反，伴低水平Lp（a）表 型S4和未检出（null）在CCVD组中出现频率 （36.2%）,低于对照组(51.9%)。
国产电泳槽冷却装置效果较差
进口较好
选用诸如Bio-Rad产垂直板电泳槽及转印槽 （Model 220 dual vertical-slab gel electrophoresis cell,TransblotTm cell； Bio-Rad Labs；Richmond,CA）
低电压、长时间、4℃环境中电泳的措施， 可取得较好效果
载脂蛋白表型（phenotype） 指载脂蛋白的基因型与发育的环境
相互作用而产生的个体的可观察到 的性状 纯合子（homozygous） 杂合子（heterozygous） 分别由一种或几种异构体构成
检测方法 等电聚焦（IEF） 十二烷基硫酸钠-聚内烯酰胺凝胶电
泳（SDS-PAGE） 双向电泳电泳技术 免疫印迹技术 分子生物学技术
5．研究证明，Ⅲ型高脂血症（HLP）、 周围血管性疾病（PVD）、晚期肾病 （ESRD）、糖尿病等患者Apo（a）表型 频率分布与正常人均无显著性差异，但 血清Lp（a）浓度显著高于正常人。一般 高分子量表型（S2、S3、S4）患者血清 Lp（a）水平高于同表型正常人。这些资 料显示，除Apo（a）基因多态性明显影 响血清Lp（a）水平外，一些非遗传因素 （如环境、性激素水平等）和/或其他遗 传因素对Lp（a）水平也有影响
主要试剂有：
①30%丙烯酰胺贮存液；
②电泳缓冲液为pH8.3，内含0.1%SDS的 0.025mol/l Tris-0.192mol/L甘氨酸溶液；
③转移电泳缓冲液为pH8.3，内含20%甲醇的 0.02mol/l Tris～0.15mol/L甘氨酸溶液；
④样品处理缓冲液：50g/l SDS水溶液4ml， β-疏基乙醇800μl，750ml/L甘油溶液 800μl ，10g/L溴酚蓝溶液200μl混合液。
2．实验方法
①凝胶板制备 安装好垂直板电泳槽，参照 Utermann等方法配制6.6%聚丙烯酰胺分离胶 和3.6%浓缩胶制备胶板
②电泳：血清样品18μl与100μl新鲜配制样 品处理缓冲液混匀，置100℃水浴10min，冷 却，取混合物20μl电泳，ApoB100与高分子 量蛋白标准处理，（通常120V电泳6h）
⑤洗涤缓冲液为pH7.4内含9g/L的 0.01mol/l Tris-HCl溶液；
⑥封闭液为内含50g/L去脂奶粉（或含 10g/L小牛血清白蛋白）的洗涤缓冲液； ⑦第一抗体为羊抗人Apo（a）血清
⑧第二抗体作为辣根过氧化物酶标记的 兔抗羊IgG；
⑨底物溶液为脂溶性4-氯-1-萘酚底物液 或水溶性二氨基联苯胺（DAB）底物
采用标准蛋白分子量定型法确定Apo（a） 异构体。Apo（a）6种异构体分子量分别为 F：＜400000，S1≈520000，S2≈580000， S3≈640000，S4＞700000，国外现已有Apo （a）表型测定标准物（含异构体F、S1～ S3-ImmunoAG、Austria），可用于Apo（a） 异构体判定及质控。分子量标准除采用凝 胶染色外，也可将分子量标准蛋白转移电 泳至NC膜上，切下非特异性转移带（即标 准部分）用低浓度CBBG-250或氨基黑10B染 色法染色，并记下标准的位置。
§2 载脂蛋白E表型
ApoE是一种含有299个氨基酸的单链多肽糖蛋白 （Mr34200），主要存在于CM、VLDL和HDL中。 ApoE多 态性的产生是由于其一个遗传位点上的3个主要等位基 因ε2、ε3、ε4所编码的3种主要ApoE异构体E2、E3、 E4之间单个氨基酸替换及其与四种受体的亲和力不同。 人群中有6种不同的ApoE表型：三种纯合子（E2/2、 E3/3、E4/4）和三种杂合子（E3/2、E4/2、E4/3）。 ApoE3/3是人群中最常出现的形式，常被称为“野生型” （Wild-type），其多肽链112位和158位均为Arg
2．Apo（a）表型以一种异构体构成的 单一表型为多（以S4较多见）；最多由两种 Apo（a）异构体构成同一血清表型，此类双 表型以S2/S3为多见，正常人群中较常见的 Apo（a）表型为S4、S3、S2、B、S1少见；F 罕见。亚洲人群S4较欧美人群频率明显增高， 说明Apo（a）多态性可能存在一定种族差异
三、Apo（a）表型检测的临床意义
临床上对Apo（a）多态性研究是从80年 代开始的。
近年来，国内外学者通过分析不同Apo （a）多态在不同种族正常人、冠心病、 高脂血症、脑血管病、糖尿病等人群中 的分布，以及对高脂血症家系调查，得 出下述一些结论：
1．Apo（a）表型对于每个研究个体来说 是终生固定的，不因身体状况而改变。Apo （a）表型受遗传基因控制，其遗传遵循孟 德尔遗传规则，即个体中出现的Apo（a）多 态总存在其双亲中。
检测Apo（a）多态性表型在不同人群中的分 布对CCVD的预测及防治具有重要意义
一、Apo（a）表型检测的方法学
Apo（a）表型检测方法主要有两大类
1.SDS-PAGE分离载脂蛋白，然后结合免疫印 迹技术检测不同Apo（a）表型
2.SDS-agarose（琼脂糖）
Utermann等 应用-SDS垂直板PAGE 结合免疫印技术，检出6种Apo（a） 异构体，共14种临床表型。此法仅 有50%受试者可检出Apo（a）异构体 区带
载脂蛋白表型及基因型的检测
蛋白质多态性（protein polymorphism） 指一种蛋白质存在多种不同的变型，这些 变型的产生是由于同一基因位点内的突变， 产生复等位基因，导致合成不同类型的蛋 白质，人类蛋白质的多态性往往和人种及 其地理分布有关。在目前已发现的近20种 载脂蛋白中，ApoAⅠ、AⅡ、AⅣ、CⅡ、 CⅢ、E及Apo（a）等存在明显的多态性， 这些载脂蛋白可以以分子大小/电荷互不相 同的多种形式存在。彼此互称异构体 （isoform）
Kraft等 将上法垂直板电泳槽改为 水平板式，避免了带型之间污染问 题且使方法更适合于大批量标本检 测
Huang等 将生物素-亲和素放大技术 引入Utermann法免疫印迹检测系统，使 检测灵敏感大大提高，88%的受试者均 可检出Apo（a）异构体区带
Gaubatz等
应用含0.75%agarose的
SDS-PAGE结合免疫印迹技术，发现美国
人中共有在11种Apo（a）异构体，共32
种表型。仅有1%受试者未检出任何一种
Apo（a）异构体
Kamboh等报道应用SDS-agarose电泳结
合免疫印迹技术检测Apo（a）表型的方 法，检出23种不同Apo（a）异构体，共 115种表型
Geroldi等 将上述加以改良，以毛细管 印迹聚偏二氟乙烯（PVDF）膜代替传统 的（NC）膜，使检测方法更为简便、适 合于大规模人群调查
§1 载脂蛋白（a）表型
Apo（a）是一结构复杂的糖蛋白，Lp（a）特 征性的蛋白成分，占Lp（a）的20%。Apo（a） 含糖量30%～35%，Apo（a）分子量在250KD～ 800KD，是目前所发现的最具多态性的人类蛋 白质。Apo（a）多态性产生的原因在于其肽 链长度不等而且糖基化程度不同；由于Apo （a）基因中Kringle-4结构重复的数量差异 所致，在不同个体中重复10～40次不 等
Apo（a）与血纤维蛋白溶酶原基因结构(A)与cDNA结构(B)的比较
运用RFLP等方法证明Apo（a）是以孟德尔共 显性方式进行遗传的。随着检测方法的改进， 报道控制Apo（a）多态性的等位基因数目越 来越多。已发现Apo（a）等位基因位点中至 少有34个等位基因与其多态性有关。高Lp（a） 是心脑血管疾病（CCVD）的独立危险因子， 与Apo（a）作用密切相关
二、SDS-PAGE结合免疫印迹法检测Apo （a）表型
检测Apo（a）表型的方法中，以 Utermann法或其改良法最为常用。
先用SDS-PAGE分离Apo（a）异构体，然 后用特异的多克隆或单克隆抗体作免疫 印迹显示
1．仪器与试剂
电泳仪，夹心式垂直板电泳槽及凝 胶转移电泳槽，NC膜（孔径0.45μm,转 移电泳用）；高分子量系列蛋白标准 （MW67000～669000，Pharmacia产品）； ApoB100纯品
⑤Apo（a）表型判定
量出Apo（a）蛋白带中心距分离胶界面的距离，对 照ApoB100和高分子量标准的泳动距离，确定Apo （a）带型及各表型的分子量范围。在SDS-PAGE中 蛋白质的迁移速度主要取决于它的分子量大小而与 其形态及所带电荷多少无关。用巯基乙醇打开Apo （a）与ApoB100之间的二硫键，Apo（a）的分子量 即poB100在凝胶中迁移速率的快慢而将其 分为F（较ApoB100快），B（与ApoB100相似），S1、 S2、S3、S4（依次较ApoB100慢）6种多态异构体并
组合成各种Apo（a）表型，见图1所示。
图1 几种Apo（a）表型的免疫印迹分析示意图谱
3．实验条件的优化
在此方法中，PAG起载体和分子筛的双重 作用，不同浓度的凝胶适于不同分子量 的蛋白质分离，国外用于Apo（a）表型 测定的凝胶浓度差异较大（3.25%～ 7.5%）, 一般认为分离胶选用6.6%较为 适宜，其操作方便，分离效果也较好。 分离和转移电泳都会因产热而影响实验 效果。