河南省9株狂犬病毒的N基因序列分析

河南省9株狂犬病毒的N基因序列分析
熊成龙;邵中军;郑刚;居丽雯;周联娣;姜庆五
【摘要】目的分析河南省9株狂犬病毒的核蛋白基因序列,探讨狂犬病毒流行株毒力与致病性的可能变异.方法以RT-nested-PCR扩增9株2006年12月分离于河南省信阳市的狂犬病毒街株,经纯化、克隆、测序后获得9条N基因全长序列,采用生物信息学软件对N基因序列进行分析.结果 9株狂犬病毒核蛋白在核苷酸及氨基酸水平上彼此的同源性分别为97.5%～99.3%和98.4%～99.8%;病毒与CTN疫苗的核苷酸序列同源性最高,为88.9%～90.1%,氨基酸序列同源性为97.6%～98.0%;与其他疫苗株相比,9株病毒与其核苷酸及氨基酸同源性范围分别为84.4%～87.9%和94.2%～97.3%;与已知的基因1型狂犬病毒比较,9株病毒核蛋白氨基酸序列发生了若干位点的取代.结论 9株河南省狂犬病毒流行株均属基因1型,其核蛋白在基因的核苷酸及推导的氨基酸水平上均有变异,这些变异可能影响疫苗对流行株所致
狂犬病的保护效果.
【期刊名称】《复旦学报（医学版）》
【年(卷),期】2010(037)003
【总页数】5页(P331-335)
【关键词】狂犬病毒;N基因;遗传特征;河南省
【作者】熊成龙;邵中军;郑刚;居丽雯;周联娣;姜庆五
【作者单位】复旦大学公共卫生学院流行病学教研室-公共卫生安全教育部重点实验室,上海,200032;复旦大学公共卫生学院流行病学教研室-公共卫生安全教育部重点实验室,上海,200032;第四军医大学预防医学系流行病学教研室,西安,710032;江
西省乐平市人民医院内二科,乐平,333300;复旦大学公共卫生学院流行病学教研室-公共卫生安全教育部重点实验室,上海,200032;复旦大学公共卫生学院流行病学教
研室-公共卫生安全教育部重点实验室,上海,200032;复旦大学公共卫生学院流行病学教研室-公共卫生安全教育部重点实验室,上海,200032
【正文语种】中文
【中图分类】R373.9
狂犬病是由狂犬病毒(rabies virus,RV)引起的人兽共患病,人与动物感染后引起致死性脑炎,病死率几乎达100%,是迄今为止人类病死率最高的急性传染病。

全球有
100多个国家和地区有狂犬病流行,每年仅由犬伤导致的狂犬病死亡人数就达到约55 000例,同时有数百万人因疑似带毒动物咬伤而接受暴露后免疫治疗[1]。

我国是世界上受狂犬病危害最为严重的国家之一。

1998年以来,一度在我国得到控制的狂犬病疫情持续回升,形成新中国建国后的第3次流行高峰[2-3]。

河南在我国狂犬病的历次流行中都是高发省份,本次流行期间,河南省的人间狂犬病疫情迅速恶化,每
10万人年发病率从2000年的0.001到2005年的0.12,6年增长了120倍,信阳、周口、驻马店、商丘以及南阳市为河南省狂犬病的重灾区,这5个市5年发病数占
全省总发病数的85.7%,其中信阳市即占26.8%[4-5]。

因此,研究狂犬病毒的病原
学特征对当地狂犬病预防工作具有重要意义。

狂犬病毒为弹状病毒科(Rhaboviridae)狂犬病毒属(L yssaavirus)成员,是不分节段
的单股负链RNA病毒,病毒核蛋白基因(nucleop ro tein gene,N)是其基因分型与感染诊断的重要指标,所编码的核蛋白(nucleop rotein,NP)不但可以保护病毒核酸免受宿主细胞核酸酶的破坏,同时还是狂犬病毒主要保护性抗原之一,能刺激机体产
生细胞免疫[6]。

狂犬病暴露后免疫存在一定的失败比率,东莞市的一项调查表明,在51例狂犬病死亡个案中,有15例进行过暴露后免疫,暴露后免疫失败的比率高达
29.5%[7]。

狂犬病免疫失败的原因复杂多样,但流行株和疫苗株间序列存在差异可能是重要原因之一[8]。

本文通过对河南省狂犬病毒核蛋白遗传信息的研究,旨在揭示其流行毒株的病原特征,为控制狂犬病的流行提供合理依据。

试剂及狂犬病毒街毒株 9株河南省狂犬病毒街毒株分离于2006年12月在河南省信阳市农贸市场所收集的121份犬脑样品,分别被命名为 FD Ls03、FD Ls09、FD Ls23、FD Ls48、FD L s53、FD L s57、FD L s89、FD L s101、FD Ls103,经清洁级昆明小鼠乳鼠颅内攻毒实验证实,9株狂犬病毒均具乳鼠神经毒力,病毒的磷蛋白及基质蛋白基因序列分析已先期完成,序列尚未提交 GeneBank[9]。

TRIzol总RNA提取试剂、AM V逆转录酶及其反应缓冲液、TaqDNA聚合酶及其反应缓冲液、Top10大肠埃希菌感受态细胞、U ItraPureTMPCR产物纯化试剂盒购自赛百盛上海公司;pMD18-T vector克隆载体、DV 801A M iniBEST质粒小量提取试剂盒购自上海皓嘉生物制品公司;逆转录及扩增所用引物由上海生工公司合成。

RT-nested-PCR 按照使用说明书,用 TRIzol总RNA提取试剂提取病毒及其鼠脑组织培养物的总RNA。

取RNA 5μL,加入引物RHN1(5′-ACAGACAGCGTCAATTGCAAAGC-3′,28～50 nt)[10],94 ℃变性3 min后冰浴退火,然后加入AMV逆转录酶及其反应体系,42℃作用60 min,75℃5 min灭活;以RHN1 与 N8(5′-GAGATGG-CTGAAGAGACT-3′,1 584～1 568 nt)[11]进行第1轮 PCR扩增;以RHN3(5′-CTAGGATTGA-CAAAGATTTTGCTC-3′,1 539～1 516 nt)[10]与N7(5′-ATGTACCACCTCTACAATGG-3′,55～74 nt)[11]进行第2轮PCR扩增,两轮扩增的反应条件均为94℃预变性3 min,循环模式为94℃1 min,37℃1 min,72℃3 min,循环数为30。

PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳后,用U ItraPureTMPCR产物纯化试剂盒纯化回收,回收产物连接于pMD18-T Vector,再将连接产物转化至Top 10感受态细胞中涂板培养;挑选阳性克隆菌落,经
DV801A MiniBEST试剂盒提取含有目的片断的质粒送上海生工公司进行序列测定。

DNA序列的测定与分析序列文件的剪切、拼接使用DNAStar软件包;序列比对使用 Clustal X1.83,参数设置取默认值;用M EGA 3.1软件以邻位相连法(NJ)构建基
因与蛋白的系统发育树,分析往返数均采用1 000个序列组。

用于比较的其他狂犬
病毒N基因序列来源于 GeneBank,见表1。

病毒N基因及其氨基酸序列同源性测序结果表明,9株狂犬病毒的核蛋白基因全长1 424 bp,含有一个开放读码框,起始于71 nt,终止于1 424 nt,编码核蛋白为450
氨基酸(amino acid,aa)残基。

9株狂犬病毒核蛋白基因中A、T、G、C 4种碱基
的平均含量分别为28.68%、26.98%、23.80%、20.55%,A+T 含量为
55.65%,C+G含量为44.35%。

9株狂犬病毒彼此N基因核苷酸与氨基酸序列的同源性范围分别为97.5%～99.3%和98.4%～99.8%,与其他基因1型狂犬病毒株核苷酸同源性为83.8%～93.8%,氨基酸同源性为94.5%～99.3%。

9株病毒与印度尼西亚株 SW 01-23及SN01-11
同源性最高,其核苷酸及氨基酸序列同源性分别达到93.0%～93.8%和97.5%～99.3%。

与疫苗株相比,CTN疫苗与9株病毒的核苷酸序列同源性最高,为88.9%～90.1%,氨基酸序列同源性为97.6%～98.0%。

与其他疫苗株及标准攻击毒相比,9
株病毒与其核苷酸及氨基酸同源性范围分别为84.4%～87.9%和94.2%～97.3%;
值得重视的是,9株病毒与我国另一株人用疫苗株aG的氨基酸同源性最低,为
94.2%～95.3%。

9株病毒与基因3型狂犬病相关病毒即Mokola的N基因核苷
酸及氨基酸序列同源性最低,分别在 78.0%和93.3%以下。

进一步将9株病毒N基因推导出来的氨基酸序列与已知的基因1型狂犬病毒比较,发现有若干位点发生了取代,其中42位T→S、379位V→L以及397位G→S的
取代似乎是我国狂犬病毒的特有现象,可作为我国狂犬病毒核蛋白的分子标记(表2)。

在各取代位点中,315位点参与构成核蛋白的NⅢ抗原区(313～337),379位点位于
N IV抗原区的两个区段(358～367,375～383)之一,397位点则位于394～408的Th细胞表位上。

与现阶段在我国有使用的疫苗株 CTN、aG、PM以及 ERA相比,9株病毒与疫苗株CTN的同源性最高,但也存在着8(FD Ls03)～10(FD L s48)处变异,其中有1～2变异出现在核蛋白各抗原相关部位及 T淋巴细胞表位;9株病毒与我国早期的疫苗株aG之间的差异最大,达到12(FD Ls03)～18(FD Ls48)处,其中有3～5处出现在核蛋白的抗原相关部位及 T淋巴细胞表位;9株病毒与PM及ERA疫苗株的变异位点数介于以上两种疫苗之间。

病毒N基因及氨基酸序列的系统发育分析 N
基因构建的系统发育树见图1。

本文报道的9株病毒在系统发育树上高度聚类,并且与来自印度尼西亚的SN 01-23及SW 01-11株系统发育关系最为近缘,它们与分离自泰国的4个街毒株D48、HM 65、HM 88、THA-Abha关系次近,我国人用精制疫苗株CTN也属于这一次近关系群。

9株病毒与韩国、印度、巴基斯坦,以及日本的一些街毒及疫苗株进化关系较远。

尤其值得注意的是,9株病毒与在我国目前广泛应用的另一疫苗株aG、法国巴斯德疫苗株PM,以及兽用疫苗株 ERA等系统发育关系似乎也都很远。

河南省地处中原,历史上一直为我国人间狂犬病的重灾区,同时也是本次狂犬病流行的高发省份之一。

本研究分离于河南省的9株狂犬病毒街毒株,与选自 GeneBank 的基因1型狂犬病毒参考株N基因核苷酸同源性为83.8%～93.8%,氨基酸同源性为94.5%～99.3%,均在文中参考的其他基因1型狂犬病毒彼此同源性范围内,此前对其磷蛋白及基质蛋白分析的结果表明8株河南省狂犬病毒(其时FD Ls03尚未测序)病毒磷蛋白基因 P在核苷酸及其氨基酸序列水平上与基因1型狂犬病毒的同源性数值分别为80.2%～89.7%和83.2%～94.3%,基质蛋白基因M的相应值分别为83.6%～92.0%和90.1%～98.0%,因此,依照狂犬病毒的分型标准,河南省9株狂犬病毒均为基因1型。

在以N基因,以及此前的P、M基因构建的系统发育树中,河南
省9株(或8株)病毒也都与已知的1型病毒处于同一分支。

序列分析结果显示,9株河南省狂犬病毒株与1956年分离自我国山东济南的,现已成为我国人用精制狂犬病疫苗株的 CTN、泰国街毒株 D48、HM 65、HM 88、THA-Abha、印度尼西亚 SN 01-23及SW 01-11株同源性高、进化关系近。

这一结果不但与此前的磷蛋白、基质蛋白的分析结果高度吻合,同时也与国内其他研究者所报道的湖南武岗市、洞口县以及贵州安龙县的结果一致[2-3],说明这类狂犬病毒是我国广泛流行的优势流行型,而且也意味着存在于我国不同地区的这些狂犬病毒与流行于东南亚国家的狂犬病毒可能有共同起源。

考虑到东南亚华人移民史及华人热衷养犬食犬的生活习惯,这些国家的部分狂犬病毒株可能是由我国传入。

尽管狂犬病毒变异很少,但在我国,狂犬病毒大致可以分为3个亚型,并存在明显的地理聚类[12]。

本研究所涉及的9株狂犬病毒均在同一批次采自同一疫区,其高度的同源性再次证明这种现象的确存在。

狂犬病毒的这种多样性,给我国的狂犬病预防与控制工作带来了一定的难度,因为针对不同的株型,现有的疫苗可能提供的保护作用有很大差别,如何增进现有疫苗对不同株型病毒的效力、是否要制备多价狂犬病疫苗,都是我国目前狂犬病防治工作中值得思考的问题。

较早的观点认为狂犬病毒的核蛋白不能诱生抗狂犬病毒的中和抗体,因此在保护性免疫上意义不大,后来证实狂犬病毒的核蛋白在诱生保护性免疫方面起着重要作用,单克隆抗体结合实验表明,N蛋白上至少有4个抗原区,能诱导机体产生持久的体液免疫以及细胞免疫[6,13]。

对比河南省9株狂犬病毒与疫苗株的遗传特征发现,这9株病毒与我国目前所使用的各种疫苗株的氨基酸序列均有差异,即便是与同源性最高的疫苗株CTN,也有着8～10处变异,与我国早期的疫苗株aG之间的差别则多达有12～18处变异,而且这些变异分别有1～2、3～5处出现在核蛋白的以上抗原相关部位。

因此,针对目前我国所流行的狂犬病,CTN株生产的纯化疫苗或许有最好的保护效果,对于用aG株与 PM株生产的人用疫苗,以及用 ERA株生产的兽用疫苗是
否能取得如CTN株一样的保护效果亟待进一步评价,尤其是aG疫苗株,由于分离时间较早,经过70多年来狂犬病毒流行株的遗传漂变,该疫苗株的保护效果很值得探讨。

近年来,在我国不同地区出现了在长达10年以上无疫情后局部地区突然出现狂犬病的暴发流行,而且还伴随着潜伏期变短等新的流行特征[2-3],除以上分析的流行株与疫苗株的差异可能导致的免疫保护降低以外,流行株的毒力与致病性有所加强也极有可能是其中一个原因。

在本研究中,9株狂犬病毒街毒株核蛋白的氨基酸序列与已知的基因1型(血清Ⅰ型)狂犬病毒株比较均有不同程度的差异,考虑到核蛋白对病毒的转录与复制的调控作用[6,14],核蛋白的任何形式的变异,都有可能影响到病毒的转录与复制并进而影响到病毒的毒力。

因此,是否这些氨基酸位点的变化能增加病毒的毒力与致病性,使感染病毒后的潜伏期变短或更有利于病毒的流行,还有待于进一步的研究。

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