微波加热多酶协同水解大豆蛋白制备小分子肽

FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY
2010年第35卷第6
期
大豆蛋白是优质的植物蛋白质，其营养价值高，必需氨基酸平衡良好，具有诸多的生理功能[1]，倍受人们青睐。

但它的溶解性差、消化率低不易全部吸收等缺点影响了使用效果。

所以人们
通过各种方式将其分解成小分子以扩大应用范围。

其中最好的酶水解方法[2]，反应条件温和，产品纯度高且安全可靠，特别是用蛋白酶定位水解大豆蛋白后得到的大豆多肽，含有组成与蛋白质完全
Microwave heating to hydrolysis soybean protein into low molecular
weight peptides by enzymes'cooperation
LIU Jing 1,2,ZHANG Guang-hua 1
(1.Key Laboratory of Auxiliary Chemistry &Technology for Chemical Industry,Ministry of
Education,Shaanxi University of Science &technology,Xi'an 710021;2.College of Chemistry and Engineer,Xianyang Normal University,Xianyang 712000)
Abstract:Microwave was uesd to hydrolysis soybean protein into low molecular weight peptides by
enzymes'ing AN as standards,the optimized conditions of one enzyme hydrolysis,the best condition of low molecular weight of soybean polypeptide and the order of three enzymes (alkaline protease,papain,typsin)hydrolysis have been found.With capillary electrophoresis,the relative molecular mass of soybean polypeptides were determined.The results shows that three enzymes hydrolysis is prefer to that of one enzyme,the relative molecular mass of soybean polypeptides mostly below 6000u.
Key words:alkaline protease;papain;typsin;soybean polypeptides;enzymes hydrolysis
刘
静1,2，张光华1
(1.陕西科技大学省部共建教育部轻化工助剂化学与技术重点实验室，西安710021；2.咸阳师范学院化学与化工学院，咸阳712000)
摘要：以大豆蛋白为原料，采用微波加热多酶协同水解法制备小分子肽。

以氨基氮含量为指标，确定了微波加热条件下，单酶水解的最佳条件及3种酶(碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶)协同水解大豆蛋白制备小分子大豆肽的最佳工艺条件和加酶顺序，并通过毛细管电泳方法对水解多肽的相对分子质量进行测定。

实验表明：3种酶协同水解明显优于单酶，制得的大豆肽相对分子质量主要集中在6000u 以下。

关键词：碱性蛋白酶；木瓜蛋白酶；胰蛋白酶；大豆肽；多酶水解中图分类号：TS 201.2
文献标志码：A
文章编号：1005-9989(2010)06-0039-05
微波加热多酶协同水解大豆蛋白制备小分子肽
收稿日期：2009-09-29
基金项目：国家自然科学基金项目(5037302)；陕西省教育厅自然科学基金项目(09JK801)；省科技厅资助项目(2009JM2010)。

作者简介：刘静(1962—)，女，陕西西安人，博士研究生，教授，主要从事高分子研究工作。

·39
·
一致的必需氨基酸，尤其是小分子大豆肽具有许多生理活性[3]，如降血压，降胆固醇，抗疲劳，健脑等，比蛋白质和氨基酸的混合物具有更好的消化吸收性，溶解性、高稳定性和抗凝胶性等优点。

随着人们对食品、药品乃至化妆品等诸多领域功能性越来越强烈的要求，大豆多肽的生产及应用前景必将非常广阔[4]。

由于蛋白质易变性和酶分解的严格选择性，酶水解对反应温度要求苛刻，大多需6h以上。

因此本工作拟利用微波可以穿透样品，瞬间达到一定温度等加热特征，结合多酶协同水解的方法，有效的将大豆蛋白水解成小分子大豆肽和氨基酸。

1材料与仪器
1.1主要材料与试剂
多肽分子量标准品：毛细管电泳专用，mer－sham Biosciences公司；碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶：食品级，经测定酶活力分别为2.3×104、1.25×104、1.5×104U/g，由无锡杰能科生物工程有限公司上海化学试剂站分装，国药集团化学试剂有限公司提供；大豆蛋白(食品级，蛋白质含量≥89%，NSI≥85%)：新乡同飞有限公司；其余所用试剂：AR级。

1.2主要仪器与设备
CE－212高效毛细管电泳仪：北京大学；Free－zone4.5冻干机：美国LABCONCO公司；LG-微波炉：LG电子电器公司，经改造；Specord50紫外可见分光光度计：德国jena公司；RF-5301PC荧光分光光度计：日本SHIMADZU公司。

2实验方法
2.1小分子大豆肽的制备
准确称取大豆蛋白溶解于一定体积的水中，在90℃水浴中加热15min预处理，破坏大豆蛋白的立体网状结构。

用稀碱调至最适pH，加入适量的蛋白酶，在微波炉中进行间歇式加热水解，整个过程保持温度和pH值恒定。

反应结束后，将水解液在沸水浴中加热15min灭酶，冷却后于4000 r/min的速度离心15min，移取上清液0.5mL于50mL容量瓶中，用二次水定容，进行酶解分析。

剩余水解液在-51℃、180kPa真空度冻干机中冷冻23~25h，研细置于干燥器中备用。

2.2大豆肽的分离纯化
分别将多肽分子量标准品和蛋白水解物冻干粉溶解，沸水浴中加热5min，离心分离，取上清液经0.45μm膜过滤，超声脱气5min后，于毛细管电泳中进样分析[5]。

分离通道：未涂层弹性石英毛细柱(30cm×0.25mm×0.25μm)；气动方式：阴极端进样；进样时间10s；分离电压18kV；分离温度：室温；检测波长214nm。

运行缓冲液：100mmol/L Tris/HCl+3.5mmol/L SDS+0.1%PEO，pH8.5。

样品缓冲液：60mmol/L Tris/HCl+35mmol/LS－DS+70mmol/L2-巯基乙醇，pH6.5。

2.3分析方法
蛋白酶活力测定：紫外法[6]；小分子肽相对分子质量测定：采用高效毛细管电泳无胶筛分方式[7]；蛋白质含量即氨基氮(AN)含量测定：乙酰丙酮和甲醛荧光法[8]。

由于蛋白质水解得到的大豆肽、氨基酸残基，可与乙酰丙酮和甲醛反应，生成N-取代-2,6-二甲基-3,5-二乙酰基-1,4-二氢吡啶，产生黄-绿色荧光，可用荧光法检测蛋白质水解液中AN含量。

2.3.1工作曲线绘制准确称取甘氨酸对照品(105℃干燥2h)，配成浓度为20mg/L标准溶液，分别移取上述溶液1、2、3、4、5mL定容至10mL，即得到2、4、6、8、10mg/L的标准系列。

移取上述甘氨酸溶液各2.0mL，加入混合试剂(取乙酸钠溶液10mL，乙酰丙酮0.4mL和30 %甲醛溶液1mL，用水稀释至30mL)2.0mL，用棉花塞满试管口，避光下于100℃下加热10min，冷却，加高纯水4.0mL，摇匀后测定其荧光强度。

以甘氨酸浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标，并绘制I-C标准曲线，采用一元线性回归法求得甘氨基浓度与荧光强度关系的回归方程。

2.3.2氨基氮含量(AN)的测定移取2.2中得到的水解液0.5mL加入1.5mL水，再加入混合试剂2.0mL，按照2.3.1同样方法测定荧光强度。

由方程算出水解液中氨基酸的浓度，从而计算出样品中的氨基氮含量。

3结果与分析
3.1回归方程的建立
以410nm为激发波长，在430~560nm扫描，测定标准系列的荧光强度，结果见图1。

根据I-C结果，用最小二乘法得荧光强度y 与甘氨酸浓度x的关系曲线的回归方程式为：y=
·40·
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY
2010年第35卷第6
期
59.736x +102.64，相关系数为r =0.9998。

3.2木瓜蛋白酶最佳水解工艺条件的确定3.2.1
酶用量对氨基氮含量的影响
取1.0g 大豆
蛋白，溶于20mL 水中，调节溶液pH=7，分别加入木瓜蛋白酶0.010、0.015、0.020、0.025、0.030
g ，在微波炉中60℃间歇水解20min ，按照2.3.2方法，测其氨基氮的含量，结果见图2。

固定底物浓度时，酶用量越大，酶的催化位点与蛋白分子相应位点接触几率越大，水解液中游离的氨基氮含量越高。

当这些位点快全部断裂时，即使继续加入酶，肽健断裂数目增加缓慢。

由图2看出：随着木瓜蛋白酶用量的增加，AN 含量也在递增。

但酶用量E/S 达到2%，AN 含量增加非常缓慢，考虑到酶的成本比较高，选取酶用
量E/S 为2.0%。

3.2.2微波作用时间对氨基氮含量的影响按照3.2.1步骤，加入E/S=2%木瓜蛋白酶，其他条件
不变，选取微波作用时间为8、9、10、11、12
min 进行实验，考察微波作用时间对氨基氮含量的影响，结果见图3。

由图3知，当酶用量一定时，水解时间愈长，
AN 含量愈大，微波作用时间为10min 时，水解液
的氨基氮含量最高，之后随着时间递增，氨基氮含量增加缓慢，故木瓜蛋白酶的最佳水解时间为
10min 。

3.2.3温度对氨基氮含量的影响
在已确定最佳
酶用量2.0%和微波作用10min 条件下，其他条件不变，同样实验方法，考察反应温度对氨基氮含量的影响，结果见图4。

温度对酶水解反应有两方面影响，其一温度可使反应加快，其二随温度的升高酶失活速度加快。

这两方面的综合影响导致水解反应存在最适温度。

由图4看出：60℃时水解液的氨基氮含量最高，所以木瓜蛋白酶的水解的最适温度为60℃。

3.2.4pH 值对氨基氮含量的影响在已确定实验
条件下，选取pH 为5.0、 6.0、7.0、8.0、9.0，按照上述方法实验，结果见图5。

酶是一种特殊的蛋白质，酶解反应与pH 密切相关。

其分子构像和解离状态及底物分子的解离状态会随着环境pH 的变化而变化，从而影响酶分
图1甘氨酸系列荧光强度
800
600
400
200
0.00430
496560波长/nm
强度
10mg/L 8mg/L 6mg/L 4mg/L 2mg/L
图2酶用量对AN 影响
850800750700650600550500A N /(m g /L ) 1.0
1.5
2.0 2.5
3.0
酶用量(E/S)/%
图3微波作用时间对AN 的影响
900890880870860850840830820810800
A N /(m g /L )
8
9
1011
12
微波作用时间/min
图4温度对AN 的影响
900880860840820800780760740A N /(m g /L )
45
50
5560
65
温度/℃
图5pH 对AN 的影响
pH
10501000950900850800750700650600
A N /(m g /L )
56
789
·41
·
子与底物的结合和催化。

因此pH 过高或过低均对酶水解反应产生不利影响。

由图5看出：木瓜蛋白酶的最佳水解pH 值为7.0。

3.2.5底物浓度对氨基氮的影响调节pH=7，其
他条件不变，配制不同底物浓度进行实验，结果见图6。

底物浓度对水解影响较大，当底物浓度较低时，酶与底物蛋白质分子接触几率小，生成的小分子肽产率低；但底物浓度太大时，蛋白质分子会通过疏水作用和二硫健作用，形成网状聚合体，反而降低酶解效率[9]。

由图6底物浓度为6%时，水解效果最好。

综上所述，木瓜蛋白酶的最佳水解条件是：温度60℃，pH 值为7.0，酶用量(E/S)2.0%，底物浓度为6%，微波水解时间10min ，此条件下，水解效率最好，AN 含量为1414.2573mg/L 。

在酶水解过程中，各因素是相互交叉影响的，从而影响着酶解程度。

在单因素实验基础上，采用了L 9(34)正交试验，研究底物浓度、酶用量、反
应温度、pH 值4因素对酶水解的影响，结果见表1。

由极差分析知：各因素影响效果为：酶用量>温度>pH>固液比，即酶用量是此反应的关键，正交试验确定木瓜蛋白酶的水解底物浓度是5%，与单因素不一致。

综合考虑氨基氮含量变化趋势，确定木瓜蛋白酶最佳水解条件为温度60℃，pH 值为7.0，E/S 为2.0%，底物浓度5%，水解时间
10min ，此时AN 含量为1511.8349mg/L 。

同样可得用胰蛋白酶水解大豆蛋白的最佳条件为：温度50℃，pH 值为8.0，底物浓度5%，酶用量E/S 为10%，微波加热水解15min ，此条件下水解AN 含量为1493.2665mg/L 。

碱性蛋白酶水解大豆蛋白的最适条件为：pH 为9.0，温度为60℃，酶用量E/S 为7%，底物浓度为5%，微波作用8min 。

酶解效果最好。

3.3多酶协同水解条件确定
根据3种单酶水解最适pH 、温度、酶用量等
条件，采用多酶分步协同水解，考察加酶顺序对大豆蛋白水解的影响。

结果见表2。

由表2可知：先加碱性蛋白酶，再加木瓜蛋白酶，最后加胰蛋白酶，这样采用3种酶协同水解方法，增加了蛋白质催化位点，有效地将大豆蛋白分解成相对分子质量低的小分子大豆肽。

3.4不同加热方式的比较
采用3种酶协同水解方法，利用常规恒温水
浴、超声波和微波加热水解35min ，测定AN 含量,结果见表3。

由表3可见，相同时间内，微波加热方式进行酶水解效果最佳。

既缩短了水解时间，大大节省能源，且无污染，成为蛋白质化学领域中很有
表2
加酶顺序对大豆蛋白AN 影响
加酶顺序
氨基氮AN /(mg/L)
先加碱性蛋白酶后加木瓜蛋白酶1994.3581先加木瓜蛋白酶后加碱性蛋白酶1901.8113先加碱性蛋白酶后加胰蛋白酶1689.4351先加胰蛋白酶后加碱性蛋白酶1607.6548先加木瓜蛋白酶后加胰蛋白酶1585.8696先加胰蛋白酶后加木瓜蛋白酶
1562.9404
表3加热方式对AN 影响
加热方式氨基氮AN /(mg/L)
水浴894.3581超声波3101.8113微波
4213.3506
图6底物浓度对AN 的影响
150014001300120011001000900800700600500
A N /(m g /L )
3
4
567
底物浓度/%
表1
木瓜蛋白酶的正交试验分析
实验号
因素
AN/
(mg/L)
pH A 酶量（E/S ）/%B 固液比/%C 温度/℃D
11(5)1(2)1(7)1(55)
999.9584
212(2.5)2(6)2(60)1142.8223
31
3(3)
3(5)
3(65)
878.5309
42(6)
1231221.3978
52231821.385962
312957.1034
73(7)
1321442.8342832131114.2513
9
3
3
2
1
749.3656
K 11007.10391221.39681023.7710856.9033K 2999.96241026.15321037.86191180.9200K 31102.1503
861.6666
1047.58371071.3933R 102.1880359.7302
23.8127324.0167
·42
·
FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY
2010年第35卷第6
期
图7
大豆多肽毛细管电泳分离图
45678910111213141516171819
时间/min
4.37B B
5.24B B
5.48B B
9.90B B
8.73B B 9.37B B
10.58B B
11.69B B 12.00B B 12.87B B 13.79B B
16.82B B
19.00B B 19.54B B
前景的新技术。

3.5多酶协同水解大豆蛋白的毛细管电泳图在最佳水解条件下，将3种蛋白酶协同水解大
豆蛋白，水解产物的毛细管电泳图见图7。

大豆多肽相对分子质量标准品的毛细管电泳图见图8[10]。

比较图7、图8可知，多酶协同水解制备大豆多肽相对分子质量主要集中在6000u 以下，远小于未水解前蛋白质相对分子质量(10万以上)，所得的多肽已在小分子量范围内。

可见3种酶协同水解大豆蛋白的效果明显优于单酶。

4结论
3种单酶的最佳水解条件为：木瓜蛋白酶水解最适pH7.0，温度60℃，酶用量E/S 为2%，底物
浓度为5%，微波水解10min ；碱性蛋白酶水解大豆蛋白的最适条件为：pH 为9.0，温度为60℃，
酶用量E/S 为7%，底物浓度为5%，微波作用8
min ；胰蛋白酶最佳工艺条件为：温度50℃，pH
为8.0，酶用量E/S 为10%，底物浓度5%，微波作用时间15min 。

此条件下,微波加热酶水解效果最好。

3种酶协同水解加入顺序为先加碱性蛋白酶，
再加木瓜蛋白酶，最后加胰蛋白酶，增加了蛋白质催化位点，有效地将大豆蛋白分解成相对分子质量低的小分子大豆肽。

单酶水解大豆蛋白，得到的多肽分子量各范围均有，分布均匀；多酶协同水解、微波加热得到小分子大豆多肽的相对分子质量主要集中6000u 以下，水解效果明显优于单酶。

参考文献：
[1]杨彩艳,宋俊梅.大豆肽研究进展[J].粮食与油脂,2009,(1):
43-45
[2]刘静,陈均志.多肽分离纯化方法研究进展[J].食品工业科技,2006,(9):171-174
[3]
J Feng,Y L Xing.Interaction and functionality of mixed myofibililax and enzyme -hydrolyzed soy proteins [J ].Journal of Food Science,2003,68(3):803-809
[4]Kazunobu Tsumura,Tsutomu Saito,Keisuke Tsuge,et al.Functional properties of soy protein hydrolysates obtained by selective proteolysis[J].LWT-Food Science and Tech -nology,2005,38(3):255-261
[5]刘静,张光华,张海平,等.小分子大豆肽的分离检测研究
[J].化学研究与应用,2008,20(8):1028-1030
[6]姜锡瑞,段钢.酶制剂实用技术手册究[M].北京:中国轻工业出版社,2001:412-417
[7]
肖玉秀,梅洁,何秀峰,等.磷脂的分离纯化及高效毛细管电泳分析[J].色谱,2006,24(1):30-34
[8]张水华.食品分析[M].北京:中国轻工业出版社,2004:174-
182
[9]丛建民.大豆肽制备及其精制研究[J].中国酿造,2008,(9):
29-32
[10]
陈均志,张海平,顾玲,等.高效毛细管电泳-紫外检测法分离测定微波复合酶法大豆蛋白水解物中的多肽[J].食品工业科技,2005,(12):14-17
图8大豆多肽分子量标准品HPCE 图
Ⅵ
ⅠⅡ
Ⅲ
ⅣⅤ
91113151719
2123252729313335
时间/min
注：Ⅰ为2512u ，Ⅱ为6214u ，Ⅲ为8159u ，Ⅳ为10700u ，Ⅵ为
14404u ，Ⅶ为16949u 。

"
"
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!"
!!!!!!"
欢迎订阅2010年《食品科技》
邮发代号：2-681全年订价：300元
·43
·。