雌激素及其受体与卵母细胞成熟的相关性

Ningxia Medical University
Thesis for Application of Master’s Degree
Estrogen and Estrogen Receptor Were Associated with Oocytes
Maturation
Student’s Name: Li Yiran
Supervisor：Li Jichun/Chen Zijiang
Assistant Supervisor: Ri-cheng Chian
Subject Category: Medicine
Major: Gynaecology &Obstetrics
Specialty: Reproduction
School: Clinical Medicine
Completion Date: 2013.04
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年月日年月日
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年月日年月日
雌激素及其受体与卵母细胞成熟的相关性
摘要
目的通过测定取卵日人血清及卵泡液内雌二醇水平、卵丘细胞雌激素-β受体
-β受体mRNA的表达量的关系和卵mRNA的表达，探讨卵泡液雌激素浓度与卵丘细胞E
2
母细胞成熟与卵丘细胞-β受体mRNA的表达量的相关性；通过观察雌激素G蛋白偶联受体GPR30在小鼠卵母细胞上的表达定位和不同时期的表达量以及体内成熟和体外成熟的卵母细胞表达量的比较，探讨GPR30对小鼠卵母细胞成熟调控作用和对卵母细胞体内、体外成熟调控作用的差异。

为探索体外环境和体内微环境下雌激素通过调控雌激素受体的表达进而控制卵母细胞发育和凋亡的机制，调节控制卵母细胞的静止、启动及发育成熟提供理论依据。

方法
选择因男性不孕行单精子卵母细胞胞质内注射（ICSI）治疗的的患者34例，研究对象的一般资料：见附表1，所有研究对象的一般资料无差异性。

在取卵日收集外周血、卵泡液及卵丘细胞，分别测定雌二醇浓度和ER-βmRNA的表达量，采用电化学发光法（ECLIA）检测血清及卵泡液中雌二醇（E2）的水平，采用实时荧光定量聚合酶链式反应（Realtime-PCR）检测卵丘细胞ER-βmRNA的表达量，并记录卵母细胞成熟度并进行相关性分析。

选择CD1系鼠龄为8－10周的雌性老鼠作为研究对象，通过促排卵方法获取小鼠体内成熟的卵母细胞（MII期），从无任何药物刺激的小鼠获得未成熟卵母细胞（GV期）经体外成熟培养（IVM）发育至成熟卵母细胞（MII期）和老化卵母细胞（Aging期）。

采用激光共聚焦扫描显微镜（LSM）获取二维和三维（2D、3D）的显微镜图片，鉴定GPR30在小鼠卵母细胞内的定位并测定其表达量。

运用蛋白质免疫印迹的方法，鉴定不同成熟度卵母细胞膜组分中GPR30蛋白的表达量。

结果 (1)取卵日每卵泡平均血清E
2水平与卵泡液中E
2
水平呈正相关（P=0.002）。

（2）MⅡ期卵母细胞内卵泡液E
2
水平显著高于MⅠ期和GV期卵母细胞水平，差异有统计学意义P<0.01。

（3）MⅡ期卵母细胞的卵丘细胞中ER-βmRNA的表达量是MⅠ期的2.74倍（P<0.01），是GV期的3.51倍（P<0.01）。

卵丘细胞的ER-βmRNA的表达量与卵泡液内雌激素浓度呈正相关（4）GPR30为小鼠卵母细胞特异性的雌激素膜受体，在小鼠不同发育时期的卵母细胞均有表达（5）不同成熟期的卵母细胞，GPR30表达量不同，各期表达量比较有显著性差异（P<0.01）。

（6）GPR30表达量体外成熟的卵母细胞明显低于体内成熟的卵母细胞，两者比较有显著性差异（P<0.05）。

结论（1）外周血雌激素水平可以间接反映卵泡液内雌激素水平作为预测卵母细胞成熟度的指标；（2）ER-β在卵丘细胞的表达量与卵母细胞成熟度和卵泡液内雌激素水平有正相关性（3）GPR30为小鼠卵母细胞特异性的雌激素膜受体。

（4）卵母细胞膜GPR30的表达量和卵母细胞的成熟度有相关性。

（5）体外培养能减少GPR30在卵母细胞膜的表达量。

关键词雌激素，雌激素受体，卵母细胞，卵丘细胞，卵母细胞成熟
Estrogen and Estrogen receptor was associated with Oocytes maturation
.
ABSTRACT
Object:In this study, by measuring estradiol levels of serum and follicular fluid on oocyte retrieval day as well as the estrogen-β receptor mRNA of cumulus cells investigate the relationship between the estrogen concentration of follicular fluid and estrogen-β receptor mRNA expression of cumulus cells; to investigate the correlation of oocyte maturation and estrogen-β receptor mRNA expression in cumulus cells by measuring the estrogen-β receptor mRNA expression in different stages of oocytes. At the same time by observing the location and expression of G-protein-coupled receptor 30 (GPR30) in mouse oocytes with different developing stages as well as the different expression between in vivo matured oocytes and in vitro matured oocytes to find out the role of GPR30 on mouse oocyte maturation and differential role on oocytes maturated in vivo and in vitro. Try to verity the feasibility of controlling oocytes development and apoptosis by regulation of GPR30 expression which can be affected by adjusting the dosage of estrogen under vitro environment, provide a basis theoretical for that oocytes maintenance、growth and maturation controlled by regulation of the micro-environment in vivo.
Method :A total of 34 patients received intra-cytoplasmic sperm injection （ICSI） were enrolled in this study. Samples of blood and follicular fluid (FF) were obtained on the day of oocyte pick-up (OPU). 3-6 oocytes were obtained from each patient and total 282 oocytes collected from patients. Electro-chemiluminesence immunoassay (ECLIA) was used to measure blood serum and follicular fluid concentrations of E
, ER-β mRNA expression in cumulus cells
2
was measured by Real-time PCR， Oocytes maturation was recorded and then analysis their relevance.Cells in vitro experimental study : Mice (CD1, female: 8–10 weeks-old) were employed in this study. Obtained mature oocytes (MII) from ovaries stimulated by gonadotropins. Immature oocyte collected from the natural cycling mice (without any stimulation with gonadotropins). The fully growing immature oocytes (GV)surrounded with cumulus cells from antral follicles were selectively collected for in vitro maturation(IVM) of culture. By maturating in vitro (IVM), the immature oocytes (GV) develop to mature oocytes (MII) and aging oocyte (Aging). The expression of GPER from different maturation stages of oocytes, in vivo and in vitro matured oocytes was examined by immune-fluorescence GPR30 antibody and the images were analyzed by laser scanning confocal microscope.Further confirmation was performed by Western blots analysis of GPR30 for cell fractionation.
Results：(1) Concentrations of E2 in blood serum were significantly lower than follicular fluid and there were positive correlations between them. (2) ER-βconcentrations in the FF of MII oocytes were significantly higher than in the FF of MⅠ and GV oocytes. (3) ER-β mRNA expression in cumulus GC from MII oocytes was significantly higher than in MⅠand GV oocytes and showed significant differences（P<0.01）. (4) Experiments (immuno-fluoresence and western-blots) indicate that GPER is expressed on the plasma membrane as a estrogen receptor. (5)GPER protein expression changes in different stages of mouse oocytes and there were significant differences among them (p<0.01) (6) The level of GPER expression on plasma membrane was significantly higher in oocytes matured in vivo compared to the oocytes matured in vitro (p<0.05).
Conclusion:(1) Estrogen levels in follicular fluid and peripheral blood have a direct correlation. The estrogen levels in peripheral blood can indirectly
reflect the level of estrogen in the follicular fluid that regards as indicators of predicting oocyte maturity;(2) ER-β may promote oocyte maturation through enhancing bioavailability of E2 and ER-β expression in cumulus cells was positively correlated with oocyte maturity as well as estrogen levels in follicular fluid. (3)GPER was observed on the plasma membrane of mouse oocytes as estrogen receptor. (4) The GPR30 expression was related to the oocytes maturation. (5) The changes of expression of GPER on mouse oocytes plasma membrane confirm oocyte membrane maturation, suggesting that those changes of GPER may be related to the functional role of oocyte maturation.
KEYWORDS estrogen, estrogen receptor, oocyte, cumulus cells,oocyte maturation
英文缩写注解
ER GPER nER mER ER-βcAMP MAPK EGFR PI3K PMSG
BSA COCs IVM Estrogen receptor
G protein estrogen receptor
Nuclear estrogen receptor
Membrane estrogen receptor
Estrogen receptor-β
Cyclic adenosine monophosphate
Mitogen-activated protein
kinases
Epidermal growth factor
receptor
Phosphatidyl inositol 3-kinase
Pregnant mare stimulating
gonadotropin
Bovine serum albumin
Cumulus-oocyte complexes
In vitro maturation
雌激素受体
G蛋白雌激素受体
雌激素细胞核受体
雌激素细胞膜受体
雌激素－β受体
环磷酸腺苷
促分裂素原活化蛋白激酶
上皮生长因子受体
磷脂酰肌醇激酶
孕马血清促性腺激素
牛血清白蛋白
卵丘－卵母细胞复合体
体外成熟
IGF-Ⅰinsulin-like growth factor -Ⅰ胰岛素样生长因子-Ⅰ
E
2
Estradiol 雌二醇
mRNA Messenger RNA 信使核糖核酸
ART assisted reproductive
technology
辅助生殖技术
IVF-ET in vitro fertilization-embryo
transfer
体外受精-胚胎移植
ICSI intracytoplasmic sperm 卵胞浆内单精子显微注射
injection
OPU ECLIA Oocyte pick-up
Electro-chemiluminesence
immunoassay
取卵
电化学发光
GnRH-a gonadotropin releasing
hormone-ant 促性腺激素释放激素激动剂
Gn Gonadotrophin 促性腺激素
FSH follicle-stimulating hormone 卵泡刺激素
LH Luteinizing hormone 黄体生成素
HCG human chorionic gonadotropin 人类绒毛膜促性腺激素SHBG sex hormone-binding globulin 性激素结合蛋白VEGF Vascular Endothelial Growth
Factor
血管内皮生长因子
FF follicular fluid 卵泡液
GV期germinal vesicle period GV期
MⅠ期mitosis Ⅰperiod MⅠ期
MⅡ期mitosis Ⅱ period MⅡ期
DNA Deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸
RNA Ribonucleic Acid 核糖核酸
mRNA RNase Realtime -PCR messenger RNA
Ribonuclease
Real time polymerase chain
reaction
信使RNA
核糖核酸酶
聚合酶链式反应
DEPC diethyl pyrocarbonate 焦碳酸二乙酯
目录
引言 (1)
材料与方法 (9)
1 研究材料 (9)
1.1 研究标本来源 (9)
1.2 研究使用的主要试剂 (10)
1.3 研究使用的主要仪器、设备 (11)
1.4 其他实验材料 (12)
2 研究方法 (12)
2.1 人体外受精过程及研究标本收集 (12)
2.2 小鼠卵母细胞获取和GPR30的定位与表达量的测定 (16)
2.3 统计学分析 (21)
结果 (22)
1 人卵母细胞成熟度与雌激素水平及其受体表达量的关系 (22)
1.1 取卵日外周血E
2与卵泡液E
2
的关系 (22)
1.2 不同成熟度卵母细胞卵泡液中E
2
水平的比较 (22)
1.3 不同成熟度卵母细胞卵丘细胞中ER-βmRNA的比较 (23)
2 雌激素膜受体GPR30在小鼠卵母细胞膜上的表达及变化 (24)
2.1 雌激素G蛋白偶联受体GPR30在度卵母细胞的定位确认 (24)
2.2 雌激素膜受体GPR30在不同成熟度卵母细胞上的表达 (24)
2.3 体外成熟卵母细胞和体内成熟卵母细胞GPR30表达量的比较 (24)
讨论 (27)
结论 (31)
参考文献 (32)
文献综述 (40)
致谢 (46)
攻读学位期间的研究成果 (47)
雌激素及雌激素受体与卵母细胞成熟的关系
引言
卵母细胞的成熟与凋亡是一个世纪来生物学家和生殖学家共同研究的焦点，虽然目前有多种学说，但卵母细胞的发育成熟机制至今为止仍是不解之谜。

研究卵母细胞的成熟机制和调控成熟的因素对人类的生殖健康具有重要意义。

1.卵母细胞发育与成熟:近年来随着辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）中体外受精-胚胎移植技术和体外未成熟卵母细胞培养技术的应用，为研究卵母细胞成熟机制，进一步探索人类生殖奥秘提供实验室研究条件.
1.1卵母细胞成熟:卵母细胞成熟包括核成熟、胞浆成熟和膜成熟。

从胎儿期到青春期，始基卵泡以固有的速率募集发育为次级卵泡，并持续发育进入生长池内，其发生机制不清。

有研究报道Kit ligand是由颗粒细胞（GC）产生，作用于卵泡膜间质细胞（theca interna cells, TICS）上的c-Kit受体，在无促性腺激素的状态下，单独刺激静止卵泡进入生长发育期。

在卵子成熟的过程中，缝隙连接、cAMP、钙离子、细胞周期蛋白和各种生长因子以及脂类均参与了此过程[1]。

次级卵泡发育成为直径
2.0mm的窦卵泡(antral growth phase)约需要60天,此时颗粒细胞逐渐增生并分泌卵泡液,当窦卵泡发育，直径达到2mm后,颗粒细胞数目明显增加,对垂体分泌卵泡雌激素（FSH）的敏感性增加并依赖其继续发育,直径2～18mm,颗粒细胞数量最终增达160倍,需要25天,后15天相当于月经周期的卵泡期. FSH激活颗粒细胞中细胞色素P450芳香化酶,进而促进E2的合成及分泌,E2反过来通过使FSH受体增加,又加强FSH的生物学作用,同时卵泡膜细胞合成并分泌的其他激素也影响卵泡的发育生长。

1.2调控卵母细胞成熟得因子与激素:当卵母细胞周边的颗粒细胞内开始分泌出粘蛋白形成边透明带（zona pellucida），进一步表达促卵泡生成素、雌二醇、孕激素等甾体激素受体。

颗粒细胞间及与卵母细胞间的缝隙连接（gap junction），是维持细胞间营养及小分子物质交换、信息的传递主要通路。

目前认为卵泡的发育过程中受诸多因子和激素、蛋白的调控。

这些因子和激素与其他与血浆相近的成分物质形成了卵泡液，通过
不同的信号通路调节卵母细胞的发育成熟与凋亡.其中雌激素是调节卵母细胞的主要激素，由卵泡膜和颗粒细胞分泌；雌激素反馈性促进颗粒细胞的增殖。

颗粒细胞合成的17β-雌二醇，通过一些类固醇合成酶，抑制卵泡膜细胞中雄激素合成，而卵泡膜细胞产生的雄激素则诱导颗粒细胞的闭锁。

研究表明卵母细胞的发育依赖卵泡液内各种激素和生长因子的变化[2]。

因此研究影响卵母细胞赖以生存的卵泡液对揭示卵母细胞发育成熟机制具有重要意义。

1.3卵泡直径与卵母细胞成熟度的关系:然而卵母细胞成熟以及受精后的发育潜能与卵泡直径息息相关[3,4]，有报道HCG日卵泡直径大小与卵母细胞成熟度、正常受精率以及受精后的胚胎质量和临床妊娠率相关。

根据以往研究表明，卵泡直径到达14mm可以作为影响卵母细胞生长、成熟和发育潜能的界定值[5]。

1.4卵母细胞成熟的分子机制:卵母细胞离开卵泡环境,在体外能够自发成熟，表明卵母细胞体内减数分裂的抑制是由于卵泡中含有抑制成熟的物质。

这些物质称为卵母细胞成熟抑制因子（OMI）。

据推断卵泡液中抑制成熟的因子可能包括一些低分子量的热稳定多肽、环酰苷酸或卵巢固醇类物质。

Yang 等人认为糖皮质激素可以抑制生发泡的破裂，从而抑制了卵母细胞的减数分裂，但是糖皮质激素对细胞质的成熟没有影响。

这种抑制作用可以使大量卵母细胞在同一时期发育，这样为同时获得大量成熟的卵母细胞提供可能性，使体外受精或核移植等胚胎生物技术简便可行[6]。

次黄嘌呤在无卵丘细胞猪卵母细胞减数分裂的恢复过程中有抑制作用，在去除次黄嘌呤后，卵母细胞很快出现生发泡破裂，并且到达 MII期，这一过程比没有用次黄嘌呤处理的对照组要快。

在介质中添加放线菌酮和嘌呤霉素也得到了相似的结果[7]。

卵母细胞从G2-M 期的转变，细胞进行一系列的复杂的过程,包括生发泡破裂，染色体浓缩，细胞骨架重组以及发育到MII期。

这些都要求细胞质激酶的激活，这种激酶的活性成分主要为Cyclin B、p34、cdc2，又把他们叫做促成熟因子（MPF）。

MPF 是调节卵母细胞成熟的一个重要因子，可以用组蛋白H1激酶活性来衡量。

总之,卵母细胞成熟与凋亡的细胞分子机制目前仍不清，卵母细胞成熟的调控是由多因素调控的复杂过程，虽然已有大量研究报道，许多生殖激素、生长因子都对卵母
细胞体外成熟的质量产生影响，但具体单一因素对卵母细胞成熟的调控作用无统一的理论阐述。

2.激素对卵母细胞成熟的调控
激素是调节卵母细胞的生长、成熟及凋亡，主要作用于卵母细胞核。

FSH促使颗粒
细胞分泌雌激素(E
2)增加，而E
2
又直接作用于卵母细胞，调控卵母细胞发育成熟。

LH峰
激发了从卵母细胞第一次减数分裂的重新启动到卵母细胞生长发育排出第一极体至成
熟的过程。

雌激素是调控卵母细胞发育成熟过程的重要内分泌激素。

排卵前卵泡中存在大量的甾体激素抑制了其他卵母细胞的发育成熟[8]。

体外研究证实细胞在甾体激素中暴露几分钟，各种信号转导途径通过雌激素受体的作用就会快速激活、离子通道打开。

研究证明，雌激素参与调节大量的生物学过程，在鱼类卵母细胞成熟的研究中，发
现体外培养液E
2
浓度越高，卵母细胞中可检测到的cAMP含量越多，即抑制细胞分裂[9]；同样高浓度雌激素可引发小鼠卵母细胞的凋亡[10]。

既往研究证明,雌激素生物效应，主要通过雌激素受体（estrogen receptor ERα，ERβ）和相关γ蛋白结合，调节特异性靶基因的转录而发挥基因型效应[11]。

2.1基因性雌激素效应: 卵泡产生的雌激素可对卵泡本身的发育产生影响。

雌激素可促进垂体切除大鼠的颗粒细胞的增殖。

FSH在卵泡成熟及颗粒细胞发育过程中是必需的，雌激素可促进FSH受体（FSHR）mRNA的表达。

体外实验表明，雌激素与LH和FSH协同作用，可改变颗粒细胞的基因表达及分化。

ERα、ERβ、ERαβ及芳香化酶基因敲除小鼠为研究雌激素对卵泡发育的影响提供了理想的动物模型。

将雌性小鼠的芳香化酶基因敲除后，血浆内未见芳香化酶，虽然此时小鼠的血浆内睾酮、FSH和LH的含量均很高，但这些小鼠不能合成雌激素，结果导致卵巢内的卵泡不能进行正常发育，这些小鼠为不育小鼠，卵泡发育停滞在有腔卵泡阶段，卵巢内未见黄体。

在6周龄的芳香化酶基因敲除小鼠卵巢内含有大量的有腔卵泡，但这些卵泡呈现卵泡闭锁的结构相，卵细胞核发生固缩，胞质内含有大量的脂滴，随着年龄的增长，卵巢间质大量的发生融合，形态异常的卵泡数量逐渐增多，卵泡内出现类似于睾丸支持细胞的细胞，饲料中存在的一些植物性雌激素可延缓这类细胞出现的时间。

到16～18周龄
时，卵巢内几乎见不到腔前卵泡，大部分卵泡发育停滞在原卵泡阶段，这些异常卵泡的结构类似于睾丸曲精小管，内部填充有支持细胞样体细胞，这些细胞是由颗粒细胞转化或再分化而来，具有支持细胞的结构特点，如细胞呈不规则的柱状、细胞侧面有许多锥形突起、细胞核位于细胞的基底部、细胞核内可见多个核仁等，核内染色质的分布也与睾丸内的支持细胞类似。

当给这些小鼠补充外源性雌激素时，这些芳香化酶基因敲除雌性小鼠的雄性表型逐渐丧失，卵巢逐渐恢复其正常的卵泡发育过程。

对狒狒的研究也表明，在妊娠晚期，应用芳香化酶抑制剂，可使雌性狒狒胎儿的卵泡发育发生改变，注射外源性雌激素，可使卵泡发育异常的狒狒胎儿恢复正常的卵泡发育。

在6周龄的芳香化酶基因敲除小鼠卵巢的间质内也可见一些结构类似于睾丸间质细胞的细胞，随着年龄的增长，这类细胞的数量逐渐增多。

2.2 雌激素受体效应：雌激素受体(estrogen receptor, ER)是依赖配体活化转录因子的核受体家族成员之一，参与靶细胞的增殖和分化。

雌激素受体可能通过基因组和非基因组两种机制发挥作用。

传统的雌激素效应是作为转录因子通过雌激素受体（estrogen receptor ERα，ERβ）和雌激素受体相关蛋白γ调节特异性靶基因的转录发挥基因型效应，此过程可持续数小时至数天。

ER活化的经典途径是与雌激素结合后直接作用于靶基因上游的雌激素受体反应元件(ERE)，从而诱导靶基因转录。

雌激素受体的功能受许多因子调节，包括与之结合的配体、DNA上的顺式元件、募集的辅助调节因子及细胞环境等。

与传统的雌激素核受体不同，新发现的雌激素的细胞膜受体（G protein coupled receptor 30，GPR30）[12]则通过细胞内第二信使途径发挥快速的非基因型效应，同时与抗雌激素表现出明显的亲和力。

G-蛋白偶联受体及其功能研究，是当今生物医药界的研究热点之一，相关研究成果已经获得了2012年度诺贝尔化学奖。

雌激素的生物效应通过雌激素核受体和膜受体发挥作用，激素受体的表达量受雌激素浓度的影响，而雌激素的生物效应则受雌激素受体表达量的影响，通过调节卵巢局部以自分泌和(或)旁分泌的调节卵巢生物学功能[2]，体外受精观察在胚胎培养液中添加适量雌激素，可提高卵母细胞的受精率并增加胚胎的发育潜能，从而提高了囊胚形成率以及临床妊娠率[1]。

理论研究雌激素是通过两种受体即ERα和ERβ而对细胞产生作用的。

在啮齿类，ERβ有两种类型的异构体，即ERβ1和ERβ2，这2种类型的异构体对不同种类的雌激与ER结合后，形成同源或异源二聚体，二聚体发生磷酸化后，使素的亲和力不同。

E
2
与核调控相关的雌激素敏感基因的的启动子活化，其中异源二聚体在雌激素的作用中其主要作用。

在卵巢内，ERα和ERβ均有表达，但ERβ的表达量多于ERα，ER主要在卵泡颗粒细胞内表达。

在大鼠的初级卵泡的颗粒细胞内，ERα和ERβmRNA均有表达，但此时的颗粒细胞内只有ERβ蛋白的表达，而未见ERα蛋白的表达，临近的次级卵泡对初级卵泡ER的表达有重要的作用。

所产生的E
2
在卵泡的卵母细胞内未见ER的表达。

随着卵泡的发育，卵泡颗粒细胞内的ER的表达量逐渐增多，其中E Rβ的表达量显著多于ERα。

在卵巢内，并不是所有卵泡均表达ER，即使在同一卵泡内，也并不是所有的颗粒细胞均表达ER，这可能与卵泡及颗粒细胞所处的功能状态有关。

关于卵泡壁细胞内是否有ER的表达，资料报道不一，一些学者认为，卵泡壁细胞内有ER的表达，另一些学者则认为，卵泡壁细胞内没有ER的表达。

近年来研究发现，雌激素-β受体（ER-β）广泛分布于生殖系统且与卵泡生长密切相关。

Lubahn等在研究小鼠激素受体对生殖功能的影响时，推测ER-β在滤泡生长和成熟中起作用[13]。

Rey等在大鼠卵巢中ER-β mRNA表达的研究中指出, 颗粒细胞中ER-β受促性腺激素的下向调控, 推测卵巢雌激素生理活动可能被ER-β介导[14]。

然而关于ER-β如何介导卵泡成熟及其在不同成熟度卵母细胞中的表达模式尚不清楚。

雌激素受体基因敲除实验表明，ERα和ERβ对小鼠的正常生殖过程都是必需的。

关于ERα和ERβ各自在雌激素信号转导过程中所起的作用，以及二者之间的相互作用，目前还不十分清楚。

同时敲除雌激素受体ERα和ERβ基因后，卵巢内的卵泡虽然可以产生雌激素，但由于此时雌激素受体不表达，雌激素信号不能通过受体转导，导致这些小鼠卵巢内的卵泡不能正常发育，卵泡不能发育到排卵阶段，最终导致小鼠无生育能力。

最新研究提示雌激素受体（ER）的形式在不同物种的繁殖过程中的具体作用仍然是清楚的。

ERα在卵泡发育后期细胞核的表达明显高于颗粒细胞、输卵管和子宫细胞的表达。

ERα在排卵前卵泡的颗粒细胞和晚卵泡期表达量增加4倍，而与53 kDa结合的
ERβ在卵泡膜和颗粒细胞晚卵泡期的表达发生无明显差异。

而在排卵前卵泡膜细胞的表达明显增加［15］。

也有报道雌激素与雌激素受体（ER）亚型诱导卵母细胞发育。

ERα主要分布在卵母细胞的细胞核和卵丘细胞，参与卵母细胞核成熟的调控。

有可能与卵子发生有密切联系，并提出雌激素可能参与了早期阶段卵巢的卵母细胞发育的调节［16］。

Carmeci等在1997年发现一种新型的雌激素膜受体，G蛋白偶联受体30（G protein-coupled estrogen receptor 30，GPR30）。

是一种位于细胞核外的、非基因型作用的雌激素膜受体，与传统雌激素受体没有同源性[17]。

该受体目前在亚细胞水平的定位尚无定论。

有报道其在COS-7 细胞的内质网以及神经元的高尔基复合体均有表达[18]。

2.3 GPR30对卵母细胞成熟的调控: GPR30，也称G蛋白偶联雌激素受体(G protein-coupled estrogen receptor Ⅰ，GPER)，作为ER已被广泛接受。

该受体在哺乳动物的多个系统的组织细胞中有广泛分布，其表达水平与组织类型、发育水平及病理状态密切相关，其作为雌激素膜受体启动的第二信使调控作用在许多细胞模型中都得到了验证[19]。

国内外目前的研究表明 GPR30参与调节细胞的生长，主要通过Ras-MAPK途径、cAMP蛋白激酶A途径以及释放生长因子等途径参与细胞生长、成熟以及凋亡的周期性调节，启动这些途径的因子包括17 β-estradiol (E2)和EGF[20]。

在Filardo等人的研究中，首次报道GPR30在乳腺癌中的作用[21]。

乳癌细胞中GPER1的存在可快速激活ERK，而将外源性的GPR30转染到ERα和GPR30低表达或不表达的MDA-MB-231乳腺癌细胞中，发现雌激素依赖的ERK1/2磷酸化，而其分子水平作用机制与ERα、ERβ介导的传统雌激素效应的作用机制不同。

它通过促使HB-EGF释放而反式激活EGFR，随后快速活化MAPKs和ERK1/2，从而调控乳癌细胞的增殖和分化。

有研究发现，黄体激素和p38抑制剂可增加GPR30的表达量从而抑制细胞生长[22]。

GPR30可反式激活表皮生长因子受体（EGFR），介导E2的增殖，与ERn具有协同作用，参与乳腺癌细胞增殖和分化等行为。

GPR30在不表达ERα，ERβ的雌激素靶器官对雌激素的生理和病理生理反应中起决定性的作用，在肿瘤细胞中参与介导雌激素通过环磷酸腺苷-蛋白激酶A（cAMP-PKA）抑制信号通路来弱化EGFR-MAPK/ERK-1/-2 信号转导，因此GPR30被认为是相关肿瘤及多种良性疾病较为理想的治疗靶点。

这些研究提示，在肿瘤发生过程中，GPR30是雌激素发挥。