微卫星标记及其在实验动物中的应用

2005年8月第15卷　第4期
中国比较医学杂志
CHINESE JOURNA L OF COMPARATIVE ME DICINE August ,2005
V ol.15　N o.4
综述与专论
微卫星标记及其在实验动物中的应用
宋国华,刘田福
(山西医科大学实验动物中心,太原　030001)
【摘要】　微卫星序列广泛存在于各类真核基因组中,是一种简单序列重复(simple sequence repeats ,SSR )。

由于它具有多态性高、结果稳定可靠等特点,因此是一种十分理想的分子标记,在遗传图谱构建、数量性状位点(QT L )定位、标记辅助选择、遗传多样性评估、遗传监测等领域都有着重要的应用价值。

【关键词】　微卫星重复;动物,实验
【中图分类号】Q95-331 【文献标识码】A 【文章编号】167127856(2005)0420244205
Application of Microsatellite in Laboratory Animal
S ONG G uo 2hua ,LI U T ian 2fu
(Laboratory Animal Center of Shanxi Medical University ,T aiyuan 030001,China )
【Abstract 】　Microsatellites ,simple sequence repeats (SSR ),are distributed throughout the eukary ote genomes.With
abundant number ,highly polym orphic character ,reliable outcome ,microsatellites are useful tools for gene mapping construction ,localization of quantitative trait loci ,marker assisted selection ,genetic diversity detecting ,genetic m onitoring and others.
【K ey w ords 】　Microsatellite repeats ;Animals ,laboratory
[作者简介]宋国华(1973-),女,硕士,研究方向:实验动物遗传
学。

微卫星(Microsatellite ),又称简单序列重复
(Sim ple sequence repeats ,SSR ),是指以少数几个核苷酸(一般为1～6个)为重复单位组成的简单多次串联重复序列,其长度大多在100bp 以内。

微卫星标记由核心序列和两侧保守的侧翼序列构成。

保守的侧翼序列使微卫星特异地定位于染色体某一区域,核心序列重复数的差异则形成微卫星的高度多态性。

微卫星上不同长度的等位基因按简单的孟德尔方式遗传,由于微卫星具有高度的多态性,在基因组中含量丰富且分布均匀等优点。

这一技术广泛应用于基因定位及克隆、遗传图谱构建、数量性状位点(QT L )定位、遗传质量监测等领域。

本文旨在介绍微卫星标记及其在实验动物中的应用。

1　微卫星序列及其产生机理
根据微卫星的结构,将其分为3类,即完全的
(Perfect )、不完全的(Im perfect )和复合的(C om pound )
微卫星。

完全的微卫星是指由不中断的重复单位构
成的微卫星;不完全的微卫星其重复序列中间有3个以下的非重复碱基,两侧不中断的部分重复数大于3;复合的微卫星则指两类或两类以上的串联重复单位由3个连续的非重复碱基分隔开,但不中断的重复单位的重复数不小于5。

关于微卫星的产生机制,普遍认为是DNA 复制过程中滑移,或DNA 复制和修复时滑移链与互补链碱基错配,导致一个或几个重复单位的插入或缺失。

微卫星序列在复制过程中新生链和模板链之间有时会发生局部解链和重新配对。

重新配对时,新生链和模板链偶尔错位而产生错配,DNA 聚合酶在这种错配的DNA 链上继续合成,就会导致新生链的长度发生变化,则可导致微卫星DNA 的长度发生变化。

如果这种错配不被体内的DNA 复制系统正确修复,下一轮复制时就可以产生序列长度突变了双链
DNA 1,2。

错配修复基因超家族属于管家基因,它们
可查出并纠正DNA复制及DNA损伤过程中出现的未配或错配的碱基,控制复制和重组的精确性。

该基因家族的突变将导致突变表型,表现为MI增加以及活性基因的高突变[2]。

微卫星多态性是微卫星不稳定性的表现。

微卫星多态性表现于同一微卫星位点在不同个体之间以及同一个体的正常组织与某些异常组织之间,微卫星位点的重复单位的数目不同。

微卫星序列基本重复单位的长度与序列的突变率成正相关,并且这种相关性不是简单的线性关系。

微卫星序列基本重复单位的长度也与序列的突变频率有关。

离体复制时,二碱基微卫星序列的突变序列的突变频率显著高于三碱基微卫星序列[2,3]。

有关体内的情况,目前尚有较大的争议,由于研究方法不同得出的结论各不相同[4,5]。

微卫星的功能目前尚不甚明了,但已发现微卫星能参与遗传物质的结构改变,基因调控及细胞分化等过程,有自身特异性结合蛋白,还能直接编码蛋白质,是一种非常活跃的碱基序列[6]。

2　微卫星标记的优点和缺点
211　优点　用微卫星作为遗传标记与其他分子标记(包括和小卫星DNA等)相比具有如下优点: 21111　分布广泛:微卫星广泛分布于真核生物基因组中,不仅存在于内含子或非编码区,也存在于编码区及染色体上的其它任一区域,大约每隔10～50kb 就存在一个微卫星。

例如,猪基因组中存在着相对分子质量约(65～100)×103拷贝的二核苷酸重复单位ACΠTG,平均每隔(30～50)kb就有一个[7]。

它的这一特点为在整个基因组中定位更多的基因提供了极大的方便。

这是其他方法所远远不及的。

小卫星DNA作为遗传标记,虽然也具有重复单位种类多、重复次数有高度个体特异性、多态信息量(polym orphic in formation content,PIC)大(0.7～0.9)等优点,但与微卫星DNA相比最大的缺点是小卫星DNA一般只分布在染色体着丝粒或端粒区城(而微卫星DNA则均匀分布在整个基因组中)[8]。

因而,利用小卫星DNA只能检测有限个位点。

小卫星DNA尚且如此,RF LP和RAPD则更是望尘莫及了。

21112　微卫星DNA具有丰富的多态性:微卫星DNA本身重复单位数的变异是形成微卫星位点多态性的基础。

这一特点也是RF LP和RAPD不能相比的。

对于RF LP来说,它主要是由于碱基突变导致限制性酶切位点的丢失或获得,所以大多数RF LP 表现为二态性,杂合率低于50%,所提供的信息含量低,多态信息含量仅为012左右。

而RAPD仅表现出显性遗传,故不能直接区分杂合子和纯合子。

而微卫星标记遵循孟德尔遗传法则,呈共显性遗传,因此能很好地区分纯合子与杂合子。

就多态性的丰富程度来说,只有小卫星DNA可与微卫星DNA相比,这两者互相补充,将可满足基因连锁分析中对高多态性遗传标记的需要。

在不同的个体中,微卫星重复单位数目的变异非常大,由此而造成了高度的长度多态性,并使其具有较高的信息。

Edwards等估计微卫星位点的突变率在10-4～5×10-6之间[9]。

因此,微卫星具有较高的多态性但其突变率却低于10-4,这在二者之间便有了一个很好的平衡。

21113　等位基因与基因型检测方法简便:一个高度多态序列的等位基因小于500bp并且变动范围窄,则可以用PCR结合凝胶电泳法检测,因而微卫星序列就很好地符合了上述标准。

微卫星PCR扩增所需样本量极少,并且由于微卫星序列较短,即使降解的DNA也可能包含足够用来扩增的微卫星序列。

随着高效精确的基因分型自动化技术的发展,微卫星基因型检测将会更加快捷方便。

目前,微卫星位点的检测一般采用以互补于两个侧翼序列的寡核苷酸(约20nt)作为引物通过PCR扩增,然后再用测序凝胶分离检测其结果[10]。

一个位点的检测一般可在24h完成,且可同时进行多位点的检测。

21114　中性标记:在多数情况下,微卫星标记没有任何表型效应,因而不存在对动物个体的有害或次级效应。

212　微卫星的缺陷
由于在不同物种中微卫星侧翼序列有所不同,针对不同物种,尤其是一些珍稀物种,往往需要进行费时费力的特异性引物设计。

目前针对微卫星的研究普遍是基于等位基因之间只存在重复单位数目差异的假设,通过使用与重复序列两端的侧翼序列配对的引物进行PCR扩增,再经电泳分离不同等位基因。

但是,该方法没有真实反映出微卫星位点在DNA序列上的变异。

一些研究显示微卫星位点在序列上也存在许多变异。

例如Cliss on等[11]发现在不同灵长类物种之间,微卫星重复序列两端的侧翼序列可以发生插入或缺失,而且多为几个相邻碱基同时发生。

而G arza等[12]也发现微卫星的重复单位序列存在不足。

这些结果反映出微卫星进化的复杂
性,从而可能出现同源异型(微卫星重复序列相同,但PCR产物长度不同)或者是异源同型(微卫星重复序列不同.但PCR产物长度相同)。

因此,单纯使用PCR产物片段进行研究可能得出错误结果。

此外,PCR扩增受到许多因素的影响,使一些等位基因无法被扩增出来。

比如发生在引物3’端配对碱基的突变可以严重影响PCR效率[13]。

这些没有被扩增的等位基因称为“无效基因”(null a11ele)。

无效基因的存在会影响亲子鉴定的正确性。

为了避免由此引起的错误,对那些已经知道存在无效基因的位点,最好只使用父母双方都是杂合、而且两个杂合等位基因都能被扩增的数据。

3　微卫星标记在实验动物研究中的应用
311　遗传图谱构建
微卫星因其上述特点和优点而成为目前构建完整遗传连锁图谱时的首选标记,利用微卫星DNA标记,可以进行遗传连锁分析,构建遗传图谱。

在陆地许多生物中,包括人、大鼠、牛、羊等动物的基于微卫星DNA的连锁图谱已逐渐发展起来。

基本思路是,以微卫星为基础,在基因组中每隔一定距离找一个多态微卫星标记,当这些标记达到一定饱和度时(平均间隔不大于20厘摩并覆盖90%以上基因组),便可据此绘制出一个基本的遗传图谱。

Dietrich等[14]在1992年构建了由317个SS LP基因座组成的413厘摩(1cM即106bp左右)小鼠遗传图谱,1996年该研究所小组发表的小鼠基因组遗传图谱中,包含了6580个高信息容量的简单重复序列多态性标记物,平均间隔为012cM,大大高于该研究组在1994年报道的4006个微卫星基因座的遗传图(平均间隔111cM)的精度,该图的建立标志小鼠遗传图已经完成。

截止1999年已发现7377个微卫星多态性引物[15,16]。

小鼠遗传图谱的建立对于基因分析和基因操作,构建具有排列有序的克隆基因图谱,以及研究哺乳动物的基因进化、人类疾病的小鼠模型具有重要意义。

在最近版的猪遗传连锁图谱上微卫星标记共计1042个,总长度为228612cM,标记间平均距离为2123cM[17]。

1992年Craw ford等发表了第一张用微卫星标记构建的绵羊遗传连锁图谱,当时所使用的微卫星标记很少。

1998年de G ortari等发表了绵羊的第二代遗传连锁图谱,其上共有标记519个,其中504个为微卫星,常染色体图谱总长度为3063cM,标记间距为614cM[18]。

这种高密度遗传连锁图谱的建成为基因定位、物理图谱的构建及基因的位置克隆(P ositional cloning)奠定了基础。

312　数量性状位点(QT L)定位
QT L定位就是以一定饱和度的遗传连锁图谱为基础,通过连锁分析,确定动物QT L在图谱上的位置与特定标记间的遗传距离。

QT L定位已成为目前动物遗传育种研究领域的一个热点课题,其中基因组扫描(G enome scanning)是QT L定位的主要方法之一,即以已经构建的遗传连锁图谱为基础,利用连锁分析的原理分析基因组中大量散在分布的多态性标记(多数为微卫星标记)与数量性状变异的连锁关系,进而借助这些标记跟踪对数量性状表型有影响的功能基因在染色体上的位置及其效应,从而找到QT L[19]。

Anderss on等率先在一个由欧洲野公猪与大白猪建立的资源家系中发现猪4号染色体微卫星S0001～S0107区域存在脂肪沉积和背膘厚的QT L[20]。

胡晓湘等采用微卫星标记,对中国农业大学鸡资源群进行了全基因组扫描,寻找影响鸡重要经济性状的染色体区段,探索一条通过DNA分子标记辅助选择进行动物分子育种的途径,并为构建高密度的遗传图谱,为将来能够进行以图谱为基础(map based)的基因奠定基础[21]。

313　标记辅助选择
借助微卫星进行标记辅助选择(Marker assisted selection,M AS)具有广阔的应用前景。

M AS的一个应用是有利基因的转移。

在传统的回交育种过程中,随着有利基因的引入,与有利基因连锁的不利基因(或染色体片段)也会随之导入,成为连锁累赘。

然而利用与目的基因紧密连锁的微卫星标记,就可以直接选择在目的基因附近发生重组的个体,从而避免或显著减少连锁累赘,提高选择效率。

M AS的另一应用是基因的累加。

动物有许多基因的表型是相同的,在这种情况下,经典的遗传育种研究就无法区别不同的基因,因而无法鉴定一个性状是受单个基因还是多个具有相同表型的基因共同控制。

借助微卫星标记,先在不同亲本中将基因定位,然后通过杂交或回交将不同的基因转移至一个品种中,通过检测与不同基因连锁的微卫星标记的基因型来判断个体是否含有某个或几个基因,以帮助选择[22]。

314　遗传多样性评估
动物遗传多样性一般指品种内个体在DNA水平上的差异。

通过对遗传多样性的评估,可了解动
物品种的遗传结构、生活背景,分析其进化的历史和潜力,以及探讨品种濒危的原因和现状,提出合理的保种措施。

为此,利用微卫星标记,检测个体基因型,统计群体中的微卫星位点等位基因的数目和频率,结合分子遗传学和数量分类学原理,计算各个品种的遗传变异程度、生存稳定性,初步评估品种的遗传多样性及品种间的亲缘关系与分化关系。

李亮等对四川地方乌骨鸡5个群体(四川山地乌骨鸡白羽系、黑羽系;黄忠鸡场山地乌骨鸡;黄忠鸡场山地乌骨鸡绿壳蛋系;石棉草科乌骨鸡)的遗传多样性进行了检测,发现四川5个乌骨鸡群体遗传多样性比较丰富,群体平均杂合度为015383到016659,5个群体间的遗传距离有一定的差异[23]。

樊斌等用27个微卫星基因座测得湖北省3个主要地方猪种通城猪、清平猪和阳新猪的平均PIC(polym orphic in formation content)分别为017489、016987、016273,这可能和三种小型猪的近交程度较高有关[24]。

由于近交分化,群体中不断淘汰不利基因,纯化有利基因,使群体基因型趋于纯合,并且在长期的封闭繁殖中没有外来血缘加入,而导致了遗传基因多样性的低水平。

目前,微卫星DNA标记技术已成为检测物种遗传多样性的一个重要手段,在国外这一技术已应用于牛、羊、马,小麦、水稻等重要的评估和管理。

严格来说,对物种多样性水平的检测同物种遗传结构分析是紧密相连的,对物种多样性水平的评估可以说是遗传结构研究的继续深入。

只有掌握了物种的多样性水平和群体的遗传结构,才能制定有效的保护策略和措施。

微卫星作为理想的遗传标记,在研究动物遗传多样性和建立遗传谱系中,已经得到了广泛的应用,推动了保护遗传学的发展。

315　遗传监测
实验动物质量对医学生物学研究中动物实验结果的准确性、重复性及科学性有重要影响。

随着生物医学科学的发展,对实验动物和实验材料的标准化要求越来越高。

实验动物遗传监测是评定和保证实验动物质量必不可少的措施。

预先了解实验材料的遗传背景,对于实验结果的准确性、科学性和可重复性提供可靠的保证。

目前在实验动物遗传监测中常用的方法主要是利用动物的免疫标志、生化标志、形态特征等进行表型监测,存在明显的局限性。

张树辉等报道C3H、C57、BA LBΠc、DBA、T A2、T739、B615、BAC BΠC-nu-nu和SCI D等9种实验室常用近交系小鼠D3Mit22、D7Nds1、D11Mit12、D12Nds2、D15Mit3、D16Mit4基因座表现为显著多态性;T739、B615和T A2的遗传背景相似,其相似系数分别为90%和95%;并且表明所检测的小鼠符合近交要求,筛选出的引物能典型地反映9个近交系小鼠的品系特异性和遗传背景[25]。

李瑞生等选取7条染色体上的微卫星位点合成了10对引物,对SHR 、SHRSP、LEW、RCS、F344和WKY6个品系的8个近交系大鼠群体进行了多态性分析,结果表明不同品系个体间具有多态性,不同一地区同一品系的不同个体之间也存在一定的差异[26]。

选择微卫星DNA 重复序列设计引物,进行锚定PCR扩增,重复性高,可比性强,在DNA水平上,利用DNA多态性检测种系或种系间差异,要比其他标记更稳定。

微卫星标记在人类基因组多样性研究及动物多态性检测中起着愈来愈来重要的作用,因此成为目前最为重要以及广泛应用的DNA多态性标记。

此外,微卫星标记还可应用于疾病的基因诊断、性别控制、保护遗传学等方面。

相信随着人们对微卫星标记技术的改进、统计方法和检验手段的日趋完善,它必将成为实验动物遗传育种研究领域的一种强有力的工具,发挥其更大的作用。

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〔收稿日期〕2004203211
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