水稻香味基因的研究进展

中国稻米水稻香味基因的研究进展
唐傲邵高能胡培松
（中国水稻研究所，浙江杭州310006）
香味是水稻重要的食味品质性状，具有独特香味特性的稻米倍受广大消费者的欢迎和育种工作者的重视。

来自印度和巴基斯坦的巴斯马蒂香米和来自泰国的茉莉香米尤其得到人们的认可，而且香米在市场上的价格也都高于非香稻米，因此，香稻育种已成为现代水稻育种的重要内容之一。

明确水稻香味遗传的分子及生物化学机理也有利于香稻新品种的选育。

许多研究者对香米的香气成分进行分析，研究表明有上百种挥发性的物质在香米中被检测出来，但多数研究表明，2-乙酰-1-吡咯啉（2-acetyl-1-pyrrolin，2AP）是稻米香气的主要成分[1-5]。

而关于水稻香味的遗传，不同研究者对其遗传模式存在着不同看法[6-9]。

这种对香味遗传模式报道的不一致性，有可能是因为环境等因素对香稻香味性状表达的影响，或是因为没有统一的标准来鉴定香稻的香味以及对香味的定量分析存在一定的难度，亦可能是供试香稻品种不同产生香味类型的不同，导致香味基因的来源与性质存在重大差别。

尽管如此，当前学者们的研究倾向于这样一个结论，即水稻香味遗传是受隐性单基因控制[10-12]。

近些年来，水稻香味基因的研究取得了很大的进展，一个控制水稻香味的基因已被克隆，同时结合其它物种香味合成途径的研究结果，使得水稻香味基因生物化学途径的研究也得到了阶段性的突破，但是控制香味的基因数目、香味产生的系统生化途径及香味基因在育种上的应用等还有待进一步的研究。

本文希望通过阐述近年来水稻香味基因的研究进展，对水稻香味基因的遗传、分子生物化学以及分子育种有所助益。

1水稻香味基因的定位与克隆
当前，分子标记已被广泛地应用于水稻香味基因的研究中，使水稻香味基因的研究更加准确和深入，同时还有助于水稻香味基因的定位、克隆以及分子标记
辅助选择等。

Ahn等（1992）[6]首先利用限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）标记将控制香味的隐性基因定位在第8染色体上，与RFLP 标记RG28的遗传距离为4.5cM。

Lorieux等（1996）[13]利用RFLP、随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）、序列标记位点（sequence-tagged site，STS）以及同工酶等4种标记，结合气相色谱对挥发性物质2AP的测定，将香味基因定位在第8染色体上RFLP标记RG1和RG28之间。

Jin等（1995-1996）[14-15]以CT9993/KDML105衍生的F2分离群体为研究材料，用RAPD引物扩增出一个与香味基因紧密连锁的产物，经NcoI酶切后发展了RFLP探针jas500，然后对F2分离群体进行检测，证明KDML105的香味遗传受一对隐性基因控制并将控制香味的基因aro定位在第8染色体上。

Dong等（2001）[16-17]利用RFLP分子标记以及初级三体对Della和三个日本地方香稻品种Kabashiko、Shiroikichi、Henroyori进行了遗传分析和基因定位，认为这四个品种的香味基因等位且均由隐性单基因控制，并将其定位于第8染色体上。

Wanchana 等（2005）[18]主要通过简单序列重复区间（inter-simple sequence repeats，ISSR）标记和细菌人工染色体（bacte－rial artificial chromosome，BAC）克隆的方法，将香味基因fgr定位在第8染色体上遗传距离为2.9cM的两个简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）标记RM223和RM342之间，并进一步找到fgr基因附近的标记10L03_FW和CP04133，两标记间170kb的DNA 序列包含有22个开放阅读框，而对序列的分析显示出了香稻与非香稻的差异就在编码甜菜碱醛脱氢酶的一个基因上。

Bradbury等（2005）[19]对fgr区域的17个基因
摘要：水稻香味是稻米品质的一个重要性状。

近年来，对香稻的研究已经从表型特征特性深入到分子及生物化学水平。

文章阐述了水稻香味基因的研究进展，包括香味基因的定位与克隆、生物化学基础的研究以及育种应用等方面,并对其研究前景进行了展望。

关键词：水稻；香味基因；2-乙酰-1-吡咯啉；甜菜碱醛脱氢酶
专论与研究2009年第4期
收稿日期：2009－04－24
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进行序列测定发现控制甜菜碱醛脱氢酶（BADH2）的基因Badh2在香和非香水稻品种中有明显区别，其中香稻品种在Badh2的编码区第7外显子出现了8bp的缺失和3个SNP，结果导致翻译提前终止，产生无功能截断的BADH2蛋白。

据此，Bradbury等预测Badh2基因可能是控制香味性状的基因。

Chen等（2006）[20]也通过定位群体，将fgr定位于标记L02和标记L06间69kb 区域，同时fgr区域的序列分析显示了三个候选基因，功能互补实验结果显示，转Badh2基因的转基因植株2AP含量较对照有了明显的降低，而其余两个候选基因Cah和Mccc2在转基因前后香味性状基本没有改变，这表明只有Badh2基因和香味性状有关。

Chen等（2008）[21]还发现了Badh2基因中的另外一个等位基因，即第2外显子7bp的缺失，并将非香的Badh2基因转化到第2外显子变异的香稻品种中，发现转基因植株的2AP含量显著下降，结果表明该位点的缺失同样导致水稻香味的产生。

与此同时，多个学者还对控制香味基因的不同位点进行了探索和研究。

Amarawathi等（2008）[11]对巴斯马蒂香米香味基因开展数量性状座位研究。

在第3、第4和第8染色体检测到控制香味的3个座位，而第4染色体上的数量性状座位可能与水稻第4染色体上存在的与Badh2基因同源的Badh1有关。

Bourgis等（2008）[12]在badh2基因的启动子区域发现MITE（miniature interspersed transposable element）结构，即12bp碱基的变化（8bp缺失和4bp插入），在所有研究的香型水稻品种中都表现为缺失，而有些并没有归类为香稻的品种也出现了缺失，这有待进一步的研究。

同时，Fitzger－ald等[22]也在对464份材料的分析之后得出相似结论，并不是所有的香稻都含有Badh2编码区第7外显子上的缺失，而有些非香稻中却发现了这个缺失。

Prathepha （2008）[23]通过研究亚洲普通野生稻（Oryza rufipogon Griff.）自然群体同样发现有具有8bp缺失的个体，从而得出这样一种假设：野生稻中存在香味基因，而栽培香稻中这个性状的出现则是由于人们在驯化过程中对性状的选择所产生的。

2水稻香味基因的作用机理与生化基础
近些年来，随着分子生物学的发展，对水稻香味的研究也取得了较大的进展，控制水稻香味的一个基因已被克隆。

Chen等（2008）[21]研究结果表明，水稻的香味主要受第八染色体上的Badh2基因控制，水稻中完整的Badh2基因编码503个氨基酸的BADH2蛋白具有
很高的甜菜碱醛脱氢酶活性，在香稻中由于基因内部核苷酸的变异，导致了该蛋白功能的缺失，从而导致了香味。

在非香水稻品种中，该基因存在三种不同长度Badh2转录本，通过转基因研究发现只有预测的全长1509bp组成的Badh2基因才能显著降低2AP的含量，其它的二种N端缺少330bp和417bp的转录本可能不翻译相应的蛋白或翻译的蛋白没有正常的功能。

对BADH2蛋白亚细胞定位发现，该蛋白主要在细胞质中得到表达，细胞核中没有检测到相关蛋白信号，而对其三维结构预测发现，该蛋白与人类的基因组中的线粒体乙醛脱氢酶表现出高度的一致性，该蛋白主要包含三个结构域，即NAD结合域、寡聚化结构域及底物结合域。

该蛋白的失活导致香味的产生可以看出甜菜碱醛脱氢酶可能在2AP合成过程中起到抑制作用[21]，或者它所参与的是2AP的分解过程[24]，或它在一个竞争性使用2AP合成前体物质的旁路中起作用[19]，到目前为止还没有得出一致的结论。

许多学者对2AP产生的生化途径进行了相关研究。

Yoshihashi等[25]认为L-脯氨酸是2AP合成的前体物质之一，通过放射性元素示踪显示它提供2AP的氮源，但不提供碳源（乙酰基团），从L-脯氨酸的分子结构来看，它并不是2AP合成的直接前体，可能要经历若干的代谢步骤才能转化为直接前体。

Schieberle等（1990）[26]在研究酵母2AP合成时发现2AP是从脯氨酸和鸟氨酸合成的，从鸟氨酸合成2AP时通过γ-氨基丁醛（γ-Aminobutyraldehyde，GABald）和1-吡咯啉（Δ1-P）作为中间体。

而Trossat等（1997）[24]研究结果表明，甜菜碱醛脱氢酶不仅能够氧化甜菜醛（Betald），而且也催化与甜菜醛结构相似的其它底物，如3-氨基丙醛（A－Pald）、γ-氨基丁醛（GABald）、二甲基硫丙醛（DMSPald）等，其中，GABald与2AP的前体物质Δ1-P之间存在着动态的平衡。

Chen等（2008）[21]也报道了BADH2具有催化这些醛的功能。

另一方面，GABald可以转化成γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric acid，GABA），而GABA的含量在香稻中比非香稻中要少很多（Yoshihashi未发表），这可能在香稻品种中，由于Badh2基因引起的BADH2功能缺失导致GABald的积累，从而该物质转向2AP生物合成方向，而非香稻品种则表现相反，因此GABald 对于调节2AP的生物合成起重要的作用。

许多学者还发现腐胺在快速生长的植物组织中的含量较高，而且可以在二胺氧化酶的作用下转化为2AP形成的前体物质GABald，这就间接地证明腐胺（Putrescine）也是香味合成的前体物[27-28]。

Lorieux等
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（1996）[13]认为，叶尖中所含的2AP含量明显高于叶片基部，嫩叶所含的2AP含量也明显高于老叶，这与Kakkar等（2000）[27]和Sebela等（2000）[28]研究结果相吻合。

迄今为止水稻中BADH蛋白的功能以及2AP代谢机制还没有彻底搞清楚，但目前的研究结果将有利于研究蛋白质的功能、阐明2AP合成及相关的次生代谢机理。

3水稻香味基因的应用与展望
近年，国内外对优质香米的消费需求越来越大，香稻的研究及优质香稻的选育也越来越受到科学家的重视。

了解香稻亲本的特征特性及亲本间的亲缘关系，选择合适的供体亲本，是选育优质香稻新品种的前提与基础。

利用与香味基因紧密连锁的分子标记进行分子标记辅助选择已被广泛应用。

Garland等（2000）[29]利用Kyeema（香稻）和Doongara（非香稻）衍生群体，根据第8染色体上RG28标记相邻区域开发出基于PCR技术的多态性分子标记，通过毛细管电泳来辨别单碱基对的差异，可以在fgr座位上区分香味和非香味的等位基因。

为了提高可靠性，Cordeiro等（2002）[30]利用与Gar－land相同的定位群体设计了一个包含（AT）40且在双亲间表现多态性的微卫星标记SCU015RM，这个与fgr基因连锁更加紧密的标记可以更好的用于鉴定后代是否具有香味基因。

Jin等（2003）[31]通过对香与非香稻品种第8染色体含14个基因超过60kb特定区域的序列比对，发现一个与水稻香味基因连锁单核苷酸多态性（C/ T）标记RSP04，这对香味基因的筛选又提供了一条新的途径。

Bradbury等（2005）[32]认为香稻的香味是由于第8染色体上编码甜菜碱醛脱氢酶基因中第7外显子上8碱基缺失和3单核苷酸多态性所引起，通过等位基因特异性扩增，可以很好的区别香味和无香味的水稻品种。

Shi等（2008）[33]报道了某些品种还存在第2外显子上的7个碱基缺失，同时也开发了功能标记用于鉴别香味等位基因。

Bradbury等[32]和Shi等[33]都是在香味基因内部设计特异性引物，提高了香味基因选择的准确性。

因此通过对香味基因开展的标记辅助选择对香稻亲本材料的鉴定、品种的选育都具有十分重要的意义。

水稻中突变的Badh2基因编码的蛋白失去了甜菜碱脱氢酶的功能，但却表现出了香味这一优良的品质性状，这是基因表达功能丧失而产生有利性状的例子，在其它作物种也有类似的报道[34-35]。

通过已被克隆的香味基因转到普通水稻中，将会是今后研究的主要方向，这将克服传统香稻品种产量较低，易感病虫害，且对土壤及其它多种因素过于敏感等缺陷。

一个泰国研究小组通过反义RNA或RNAi（RNA干扰）技术而获得了含香味的水稻品种[36]，我国育种家为了培育高产优质的香稻品种，在选育杂交香稻品种上做了大量工作，并成功选育出了一系列不育系、恢复系与杂交新品种，其中很多品种已通过审定，并在生产中得到推广[37-42]。

甜菜碱被认为是对细胞质渗透压起调节作用的一种物质，它可以使得植物在各种胁迫作用下正常的生长，包括盐碱地和干旱的环境，而在水稻中完整的Badh2基因编码503个氨基酸的BADH2蛋白具有很高的甜菜碱醛脱氢酶活性，因此该基因可能与非香稻的渗透压调节相关。

但是由于突变而造成的Badh2基因的功能缺失并没有给某些香稻品种的生长带来负面影响，泰国香稻品种“Khao Dawk Mali105”在干旱区域仍然生长良好。

这有可能意味着存在其它编码甜菜碱脱氢酶的基因，从而实现对高盐、干旱环境的耐受力。

通过对水稻基因组的研究调查发现，另外至少还存在3个可能编码甜菜碱醛脱氢酶的基因，2个位于第7号染色体上，1个位于第4号染色体上。

其中第4号染色体上的Badh1基因与大麦、高粱中的Badh1基因具有很高的同源性[19，43]，该基因与水稻的香味有何关系还有待研究。

Badh2基因在水稻中的表达谱与大麦中的也相似，据报道，大麦中存在两种BADH同工酶，两者均能在高盐、干旱以及脱落酸（ABA）的诱导作用下，实现高水平的表达[44]，而这些Badh基因在耐胁迫方面以及与2AP合成的关系还需要更进一步研究。

参考文献
[1]Buttery R G，Ling L C，Juliano B O，et al．Cooked rice aroma and
2-acetyl-1-pyrroline[J]．J Agric Food Chem，1983，31（4）：823-826．
[2]Widjaja R，Craske J D，Wootton M．Comparative studies on volatile
components of non-fragrant and fragrant rice[J]．J Sci Food Agric，1996，70（2）：151-161．
[3]Grimm C C，Bergman C，Delgado J T，et al．Screening for2-acetyl-
1-pyrroline in the headspace of rice using SPME/GC-MS[J]．J A－gric Food Chem，2001，49（1）：245-249．
[4]Mahatheeranont S，Keawsa-Ard S，Dumri K.Quantification of the
rice aroma compound,2-acetyl-1-pyrroline,in uncooked Khao Dawk Mali105brown rice[J]．J Agric Food Chem，2001，49（2）：773-779．
[5]Jezussek M，Juliano B O，Schieberle P．Comparison of key aroma
compounds in cooked brown rice varieties based on aroma extract dilution analyses[J]．J Agric Food Chem，2002，50（5）：1101-1105．[6]Ahn S N，Bollich C N，Tanksely S D．RFLP tagging of a gene for
aroma in rice[J]．Theor App1Genet，1992，84（7-8）：825-828．
3
··
[7]Dhulappanavr C V．Inheritance of scent in rice[J]．Euphytica，
1976，25（1）：659-662．
[8]Tomar J B，Prassad S C．Genetic analysis of aroma in rice land race
[J]．Oryza，1997，34（3）：191-195．
[9]TsuzuKi E，Shimokawa E．Inheritance of aroma in rice[J]．Euphyti－
ca，1990，46（2）：157-159．
[10]Sun S X，Gao F Y，Lu X J，et al．Genetic analysis and gene fine
mapping of aroma in rice（Oryza sativa L.Cyperales,Poaceae）[J]．Genet Mol Biol，2008，31（2）：532-538．
[11]Amarawathi Y，Singh R，Singh A K，et al．Mapping of quantitative
trait loci for basmati quality traits in rice（Oryza sativa L.）[J].Mol Breeding，2008，21（1）：49-65．
[12]Bourgis F，Guyot R，Gherbi H，et al．Characterization of the major
fragance gene from an aromatic japonica rice and analysis of its di－versity in Asian cultivated rice[J]．Theor Appl Genet，2008，117（3）:353-368．
[13]Lorieux M，Petrov M，Huang N，et al．Aroma in rice：genetic anal－
ysis of a quantitative trait[J]．Theor Appl Genet，1996，93（7）：1145-1151．
[14]Jin Q S，Qin B Q，Yan W C，e．Tagging of a gene for aroma in
rice by RAPD and RFLP（I）[J]．Acta Agric Zhejiangensis，1995，7（6）：439-442．
[15]Jin Q S，Qin B Q，Yan W C，et al．Tagging of a gene for aroma in
rice by RAPD and RFLP（II）[J]．Acta Agric Zhejiangensis，1996，8（1）：19-23．
[16]Dong Y J，Tsuzuki E，Terao H，et al．Inheritance of aroma and i－
dentification of RFLP makers linked to aroma genes in two rice cultivars（Oryza sativa L.）[J]．Bull Fac Agric，2001，48（1-2）：59-65．
[17]Dong Y J，Tsuzuki E，Terao H．Trisomic genetic analysis of aroma
in three Japanese native rice varieties（Oryza sativa L.）[J]．Eu－phytica，2001，117（3）：191-196．
[18]Wanchana S，Kamolsukyungyoung W，Ruengphayak S，et al．A
rapid construction of a physical contig across a4.5cM region for rice grain aroma facilitates marker enrichment for positional cloning[J]．Sci Asia，2005，31：299-306．
[19]Bradbury L M T，Fitzgerald T L，Henry R J，et al．The gene for fra－
grance in rice[J]．Plant Biotechnol J，2005，3（3）：363-370．
[20]Chen S H，Wu J，Yang Y，et al．The fgr gene responsible for rice
fragrance was restricted within69kb[J]．Plant Sci，2006，171：505-514．
[21]Chen S H，Yang Y，Shi W W，et al．Badh2，Encoding betaine
aldehyde dehydrogenase，inhibits the biosynthesis of2-acetyl-1-pyrroline，a major component in rice fragrance[J]．Plant Cell，2008，20（7）：1850-1861．
[22]Fitzgerald M A，Sackville Hamilton N R，Calingacion M N，et al．Is
there a second fragrance gene in rice?[J]．Plant Biotechnol J．2008，6（4）:416-423．
[23]Prathepha P．The fragrance（fgr）gene in natural populations of
wild rice（Oryza rufipogon Griff.）[J]．Genet Resour Crop Ev，DOI
10.1007/s10722-008-9337-7．
[24]Trossat C，Rathinasabapathi B，Hanson A D．Transgenically ex－
pressed betaine aldehyde dehydrogenase efficiently catalyzes oxida－tion of dimethylsulfoniopropionaldehyde and omega-aminoaldehy－des[J]．Plant Physiol，1997，113（4）：1457-1461．
[25]Yoshihashi T，Hong N T T，Inatomi H．Precursors of2-acety-1-
pyrroline，a potent flavor compound of an aromatic rice variety[J]．J Agric Food Chem，2002，50（7）：2001-2004．
[26]Schieberle P．The role of free amino acids present in yeast as pre－
cursors of the odorants2-acetyl-1-pyrroline and2-acetyltetrahy－dropyridine in wheat bred crust[J]．Z Lebensm Unters Forsch，1990，191（3）：206-209．
[27]Kakkar RK，Nagar PK，Ahuja PS，et al．Polyamines and plant mor－
phogenesis[J]．Biol Plantarum，2000，43（1）：1-11．
[28]Sebela M，Brauner F，RadováA，et al．Characterisation of a homo－
geneous plant aminoaldehyde dehydrogenase[J]．Biochim Biophys Acta，2000，1480（1-2）：329-341．
[29]Garland S，Lewin L，Blakeney A，et al．PCR-based molecular
markers for the fragrance gene in rice（Oryza satlva L.）[J]．Theor Appl Genet，2001，101（3）：364-371．
[30]Cordeiro G M，Christopher M J，Henry R J，et al．Identification of
microsatellite markers for fragrance in rice by analysis of the rice genome sequence[J]．Mol Breeding，2002，9（4）：245-250．
[31]Jin Q S，Waters D，Cordeiro G M，et al．A single nucleotide poly－
morphism（SNP）marker linked to the fragrance gene in rice（Oryza sativa L.）[J]．Plant sci，2003，165（2）：359-364．
[32]Bradbury L M T，Henry R J，Jin Q S，et al．A Perfect Marker for
Fragrance Genotyping in Rice[J]．Mol Breeding，2005，16（4）：279-283．
[33]Shi W W，Yang Y，Chen S H，et al．Discovery of a new fragrance
allele and the development of functional markers for the breeding of fragrant rice varieties[J]．Mol Breeding，2008，22（2）：185-192．[34]Piffanelli P，Ramsay L，Waugh R，et al．A barley cultivation-asso－
ciated polymorphism conveys resistance to powdery mildew[J]．Na－ture，2004，430（7002）：887-891．
[35]Sasaki A，Ashikari M，Ueguchi-Tanaka M，et al．Green revolution：
a mutant gibberellin-synthesis gene in rice[J]．Nature，2002，416
（6882）：701-702．
[36]Vanavichit A，Tragoonrung S，Toojinda T，et al．National Science
&Technology Development Agency，Klong Luang，Phathumthani （Thailand）．Transgenic rice plants with reduced expression of Os2AP and elevated levels of2-acetyl-1-pyrroline：US，7319181 [OL]．2008-1-15．/web/patents/patog/ week03/OG/classification/classGroup_80.htm．
[37]况浩池，曾正明，刘国民，等．优质、香型籼三系不育系泸香91A
的特征特性和高产繁殖技术[J]．中国稻米，2007（4）：28-29．[38]黄庭旭，江文清，游晴如，等．籼型香稻恢复系大粒香-15的选育
与利用[J]．福建农业学报，2006，21（2）：83-88．
[39]刘光春，陆贤军，任光俊，等．杂交香稻新组合川香优425的选
育与栽培技术[J]．中国稻米，2008（2）：42-43．
[40]袁亚章．香稻新品种“新香优906”[J]．云南农业科技，2006（1）：
43-44．
[41]黄庭旭，谢华安，游晴如，等．优质高产杂交香稻新组合“宜优
673”的选育与应用[J]．江西农业学报，2006，18（4）：6-9．
[42]江青山，林纲，赵德明，等．香型优质不育系宜香1A的特征特
性与利用[J].中国稻米，2008（2）：35-37．
[43]Bradbury LM，Gillies SA，Brushett DJ，et al．Inactivation of an
aminoaldehyde dehydrogenase is responsible for fragrance in rice [J]．Plant Mol Biol，2008，68（4-5）：439-449．
[44]Nakamura T，Nomura M，Mori H，et al．An isozyme of betaine
aldehyde dehydrogenase in barley[J]．Plant Cell Physiol，2001，42（10）：1088-1092．
4··。