稳心颗粒对心肌梗死大鼠模型心肌脂肪化及E6AP、CEBPα表达影响

ʌ实验研究ɔ
稳心颗粒对心肌梗死大鼠模型心肌脂肪化
及E6AP㊁C/EBPα表达影响❋庞㊀延1,卢健棋1ә,朱智德2,王庆高1,温志浩1,梁逸强1,林㊀浩2,唐梅玲1,
许志亮2
(1.广西中医药大学第一附属医院,南宁㊀530023;2.广西中医药大学,南宁㊀530000)
㊀㊀摘要:目的:通过观察稳心颗粒对大鼠心肌细胞诱导分化成前脂肪细胞E相关蛋白(E6assiociated Protein,E6AP)㊁转录因子CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBPα)表达的影响,探讨稳心颗粒对心肌脂肪化作用机制㊂方法:将大鼠心肌细胞诱导分化成前脂肪细胞,分成空白组㊁E6AP腺病毒组㊁E6AP封闭组㊁E6AP过表达组㊁胺碘酮组㊁稳心颗粒组,相应组别给予腺病毒感染及含药血清处理培养,采用RT-PCR和免疫组化检测各组E6AP㊁C/EBPα表达,同时通过油红染色对比各组前脂肪细胞脂肪化情况㊂结果: E6AP过表达组E6AP表达明显高于各组而C/EBPα表达显著低于各组,E6AP与C/EBPα表达具有负性调节关系,稳心颗粒组E6AP表达显著高于胺碘酮组但C/EBPα表达2组无明显差异,E6AP封闭组油红染色程度最深而E6AP过表达组染色明显减少,胺碘酮组和稳心颗粒组染色程度相对于空白组有较为明显的减少㊂结论:稳心颗粒可能通过上调E6AP和抑制C/EBPα表达抑制心肌脂肪化㊂
㊀㊀关键词:稳心颗粒;心肌细胞;脂肪化;E6AP;C/EBPα
㊀㊀中图分类号:R285.5㊀㊀文献标识码:B㊀㊀文章编号:1006-3250(2021)01-0061-04
Effects of Wenxin Granule on myocardial adiposis and expression of E6AP and
C/EBPαin rats with myocardial infarction
PANG Yan1,LU Jian-qi1ә,ZHU Zhi-de2,WANG Qing-gao1,WEN Zhi-hao1,LIANG Yi-qiang1,LIN Hao2,
TANG Mei-ling2,XU Zhi-liang2
(1.The First Affiliated Hospital of Guangxi University of Traditional Chinese Medicine,Nanning,530023,China;
2.Guangxi University of Traditional Chinese Medicine,Guangxi Nanning,530000,China)
㊀㊀Abstract:Objective To observe the effect of Wenxin Granule on the expression of E-related protein(E6assiociated Protein,E6AP)and enhancer-binding protein(C/EBPα)of preadipocytes induced by rat cardiomyocytes,and to explore the mechanism of Wenxin Granule on myocardial adipogenesis.Methods Rat cardiomyocytes were induced to differentiate into preadipocytes and divided into blank group,E6AP adenovirus group,E6AP blocking group,E6AP overexpression group,amiodarone group,and Wenxin granule group.And the corresponding groups were given adenovirus infection and drug-containing Serum-treated cultures were used to detect the expression of E6AP and C/EBPαin each group by RT-PCR and immunohistochemistry.At the same time,the fat metaplasia of preadipocytes in each group was compared by oil red staining.Results The expression of E6AP in the E6AP over-expression group was significantly higher than that in each group and the expression of C/EBPαwas significantly lower than that in each group.The expression of E6AP and C/EBPαhad a negative regulatory relationship.The expression of E6AP in Wenxin Granule Group was significantly higher than the amiodarone group,but there was no significant difference in C/EBPαexpression between the two groups.The degree of oil red staining was the deepest in the E6AP blocking group,while the staining in the E6AP overexpression group was significantly reduced.And compared with the blank group,the degree of staining in the amiodarone group and Wenxin Granule group has a more obvious reduction.Conclusion Wenxin Granule may inhibit myocardial adipogenesis by up-regulating E6AP and inhibiting the expression of C/EBPα.
㊀㊀Key words:Wenxin Granule;Cardiomyocyte;Adipose;E6AP;C/EBPα
❋基金项目:国家地区科学基金项目(81560760)-E6AP负性调节心肌内脂肪化生对大鼠心肌梗死后室性心动过速的影响及稳心颗粒的调节作用
作者简介:庞㊀延(1990-),男,广西玉林人,医师,硕士研究生,从事心血管疾病的中西医临床与研究㊂
ә通讯作者:卢健棋(1963-),男,广西平南人,教授,主任医师,硕士研究生导师,从事心血管疾病的中西医结合临床与研究,Tel:139****7839,E-mail:lujianqi666@㊂㊀㊀据报告显示,中国心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)死亡率已赶超肿瘤等其他疾病居于榜首,尤其是急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)在CVD中死亡率最高[1]㊂虽然目前经皮冠状动脉腔内成形术等技术得到快速发展, AMI死亡率有所下降,但AMI后恶性心律失常仍然是引起死亡的重要因素㊂研究提示[2],接近90%的AMI有不同程度的心律失常,且发现约有32%的患
者出现室性心律失常,其中室性心动过速(ventricular tachycardia,VT)约占75%㊂转录因子CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBPs)是脂肪细胞分化中的重要转录因子,E6AP(E6assiociated Protein)是细胞编码的一种泛素蛋白连接酶㊂Pooja Pal等团队[3]研究首次证实,E6AP能够通过降低C/EBPα的转录水平抑制心肌脂肪化,从而降低AMI后VT发生㊂西药在AMI后VT预防及终止疗效得到肯定,但因其副作用等因素在临床应用上仍存在一定的顾虑与限制㊂中医药治疗具有多靶点㊁副作用小等特点㊂既往研究表明,稳心颗粒联合西药治疗能够降低AMI患者血脂水平和降低室性期前收缩㊁非持续性室性心动过速等室性心律失常发生率,优于单用西药治疗[4]㊂本研究通过观察稳心颗粒对心肌梗死模型大鼠心肌脂肪化及E6AP㊁C/ EBPα表达影响,探讨稳心颗粒对心肌脂肪化作用机制,以期为稳心颗粒在预防和降低AMI后VT发生提供一定的科学依据㊂
1㊀材料与方法
1.1㊀实验动物
清洁级健康雄性SD大鼠12只,1~3d龄,购自上海西普尔必凯实验动物有限公司,实验动物许可证:SCXK(沪)2013-0016㊂
1.2㊀主要药物㊁试剂和仪器
稳心颗粒(山东步长制药股份有限公司,国药准字Z10950026,药物组成:党参㊁黄精㊁三七㊁琥珀㊁甘松);胺碘酮(杭州赛诺菲民生健康药业有限公司,国药准字H33020581产品规格0.2g,批准日期2018-04-16);戊巴比妥钠(上海新亚药业有限公司,货号H31020502);牛血清白蛋白(Solarbio,货号A8020);胶原酶I(Gbico,货号17100-017);FBS (Gbico,货号10099148);高糖DMEM/F12液体培养基(Gbico,货号C11330500BT);胰酶(Solarbio,货号T1350);牛胰岛素(上海源叶生物科技有限公司,货号11070-73-8);E6AP一抗(santa cruz,sc-166689); C/EBPα一抗(santa cruz,sc-365318);鼠二抗(抗E6AP)(Jackson,315-035-003);鼠二抗(抗C/ EBPα)(赛默飞,62-6820);DLK蛋白一抗(Santa Cruz Biotechnology,货号sc-376755);荧光二抗:Goat anti-Mouse IgG(H+L)(molecular probes,货号Catalog#A-21206);Trizol(Takara,Cat:9109)SYBR Green mix(诺维赞,Cat:Q111-01);E6AP过表达和干扰腺病毒NC浓缩液㊁腺病毒OE初液㊁腺病毒Ube3a-3#初液均由上海锐赛生物技术有限公司提供;二氧化碳细胞培养箱(Thermo Scientific,型号Midi40);共聚焦显微镜(厂家ZEISS,型号LSM710);荧光定量PCR仪(Bio-Rad,型号: 575BR);双垂直电泳仪(北京六一,型号DYCZ-25D),半干转膜仪(Bio-Rad,型号Yrdimes+ELITE200)㊂
2㊀方法
2.1㊀大鼠前脂肪细胞的原代分离及培养
无菌状态下取1~3d龄雄性SD健康大鼠,经戊巴比妥钠麻醉,取大鼠颈㊁背部的皮下脂肪组织剪成小块,加消化液(DMEM/F12+20g/L牛血清白蛋白,临用时加1g/L的胶原酶I)37ħ消化30~50 min,过筛并收集滤液至离心管离心弃上清,加入DMEM/F12培养液清洗再离心然后加含10%FBS 的DMEM/F12吹打混匀,制成单细胞悬液,即获得大鼠前体脂肪细胞㊂采用的前脂肪细胞基础培养基含10ml FBS㊁89ml高糖DMEM/F12液体培养基㊁1 ml青链霉素混合液,一定条件下培养2~3d换液1次㊂细胞贴壁呈梭形㊁透亮,胞质内无脂滴,长满80%时进行传代,二氧化碳培养箱中培养㊂
2.2㊀大鼠心肌细胞的原代分离及培养
无菌状态下取1~3d龄SD健康雄性大鼠,经戊巴比妥钠麻醉后迅速开胸取出心脏,置于4ħ二氮嗪强化Celsior液中保存㊂剪去除主动脉的一切血管及脂肪,将心脏迅速悬吊在灌流装置上,循环灌洗心脏3次,待心肌软化剪下心室肌组织,在酶液里浸泡切成碎片,置入离心管内振荡10min37ħ,用尼龙网过滤去上清液,加入酶液继续离心振摇,直到心肌组织充分消化获取心肌细胞,二氧化碳培养箱中培养㊂
2.3㊀病毒转染
细胞密度达到30%进行感染,感染前弃去原培养基,加入新鲜的培养基,再分别加腺病毒NC 浓缩液(10μl)㊁腺病毒OE初液(100μl)㊁腺病毒Ube3a-3#初液(100μl)混匀,放入CO2培养箱中,感染8h/过夜进行换液,在孔板中加入新鲜的完全培养基,感染24h观察荧光,感染48h/72h使荧光率达到50%以上,持续培养使细胞密度融合到100%进行诱导,诱导2d后重复1次,再继续培养4d㊂
2.4㊀分组及前脂肪细胞诱导分化
无药血清组(空白组)给予大鼠MI后的无药血清;E6AP腺病毒组给予E6AP腺病毒转染的大鼠MI后的无药血清;E6AP封闭组采用RNAi技术封闭E6AP,给予MI后的无药血清;E6AP过表达组采用转染野生型E6AP,使其过表达并给予MI后的无药血清;胺碘酮组给予MI后的含胺碘酮血清10%;稳心颗粒组给予MI后的含稳心颗粒血清10%㊂各组置于10%FBS的高糖DMEM培养基中,并与同来源的小鼠心肌细胞共培养,各组均加细胞诱导分化培养基Ⅰ(含10ml FBS㊁89ml DMEM/F12液体培养基㊁1ml青链霉素混合液㊁牛胰岛素1mg/L㊁IBM ˑ0.5mmol/L㊁DEˑ1.0μmol/L),2d后换成诱导分化培养基Ⅱ(含10ml FBS㊁89ml DMEM/F12液体
培养基㊁1ml青链霉素混合液㊁牛胰岛素1mg/L),继续培养2d,随后换为基础培养基,1~2d换液1次,继续培养4d㊂
2.5㊀油红O染色
弃去培养液,10%甲醛PBS固定,0.35%油红O 母液(含0.35g油红㊁100ml异丙醇)与去离子水3ʒ2混合,滤纸过滤,静置数分钟,取上层液对细胞进行染色10min,去离子水冲洗后显微镜下观察并拍照㊂
2.6㊀荧光定量(PCR)检测C/EBPα㊁E6AP的mRNA表达
提取总RNA,扩增mRNA,再逆转录为cDNA,荧光定量PCR法检测C/EBPα㊁E6AP mRNA表达㊂引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列:E6AP:上游AGGGGACGTGGACACAA ATC,下游TGGATCCACTCGAGGACCTT,片段长度: 127bp;C/EBPα:上游GTCGGTGGATAAGAACAGC AACG,下游AGGCGGTCATTGTCACTGGTC,片段长度:144bp;Atcb(内参):上游GCTATGTTGCCCTA GACTTCGA,下游GATGCCACAGGATTCCATACC,片段长度:173bp㊂采用2-әәCt法进行各基因表达的相对定量㊂
2.7㊀统计学方法
采用SPSS17.0统计学软件进行统计分析,计量结果以均数ʃ标准差( xʃs)表示,多样本间比较采用单因素方差分析,2组间比较采用Newman-keuls 检验,检验水准以α=0.05或0.01,P<0.05,P< 0.01,为差异有统计学意义㊂
3㊀结果
3.1㊀各组前脂肪细胞C/EBPα㊁E6AP的mRNA表达结果
表1示,E6AP过表达组E6AP表达明显高于各组,除E6AP过表达组以外,稳心颗粒组E6AP表达明显高于各组(P<0.05),胺碘酮组E6AP表达明显高于空白组和E6AP腺病毒组㊁E6AP封闭组(P< 0.05);由此表同组E6AP与C/EBPα表达趋势可以看出,E6AP与C/EBPα表达成负性关系,但C/ EBPα表达中胺碘酮组与稳心颗粒组比较差异无统计学意义(P>0.05)㊂
表1㊀各组脂肪细胞C/EBPα和E6AP基因mRNA
相对表达量比较( xʃs)
组别鼠数E6AP C/EBPα
空白组8 1.00ʃ0.06 1.00ʃ0.07
E6AP腺病毒组8 1.08ʃ0.090.91ʃ0.31
E6AP封闭组80.13ʃ0.01a 3.36ʃ0.08aB E6AP过表达组87.95ʃ0.64AbC0.33ʃ0.13abC 胺碘酮组8 2.55ʃ0.77ABCD0.68ʃ0.14aCd 稳心颗粒组8 3.68ʃ0.38ABCDE0.53ʃ0.13AbC ㊀㊀注:与空白组比较:a P<0.05,A P<0.01;与E6AP腺病毒组比较:b P<0.05,B P<0.01;与E6AP封闭组比较:C P<0.01;与E6AP过表达组比较:d P<0.05;与胺碘酮组比较:E P<0.01
3.2㊀各组前脂肪细胞油红染色结果
图1示,油红染色的是脂肪颗粒,红染越多说明细胞内积累脂肪越多分化越明显㊂由油红染色结果可知,E6AP封闭组油红染色程度最深,而E6AP过表达组染色最浅,胺碘酮组和稳心颗粒组染色程度相对于空白组有较为明显的减少㊂
图1㊀各组前脂肪细胞油红染色结果(放大200倍)
㊀㊀3.3㊀各组前脂肪细胞C/EBPα㊁E6AP的蛋白表达结果
表2图2示,E6AP过表达组E6AP表达明显高于空白组和E6AP腺病毒组㊁E6AP封闭组(P< 0.05),其腺病毒转染有效;稳心颗粒组E6AP蛋白表达明显高于胺碘酮组(P<0.05),但C/EBPα表达中,胺碘酮组与稳心颗粒组比较差异无统计学意义(P>0.05)㊂
4㊀讨论
急性心肌梗死是一种冠状动脉急性㊁持续性缺
注:1:空白组;2:E6AP腺病毒组;3:E6AP封闭组;
4:E6AP过表达组5:胺碘酮组;6:稳心颗粒组
图2㊀各组前脂肪细胞C/EBPα㊁E6AP蛋白Western Blot结果血缺氧引起心肌坏死的临床综合征㊂Katia Orvin等团队[5]研究7669例AMI患者发现,伴有室性心律失常发生率为3.8%(早期(ɤ48h)2.1%,晚期(ȡ48h)1.7%),出现快速室性心律失常患者住院率及1年死亡率显著高于非快速室性心律失常患者㊂以往研究认为[6-7],AMI后VT发生主要与梗死心肌纤维化㊁存活心肌细胞和胶原沉积等瘢痕区域形成了折返性VT底层基质改变心电电传导密切相关,而心肌脂肪化是瘢痕介导VT的底层基质,提示心肌脂肪化在影响AMI后VT发生重要地位㊂综上所述,预防和降低VT发生在降低AMI死亡风险中具有重大意义㊂Pooja Pal团队[3]已证实,E6AP能够通过降低C/EBPα的转录能力和心肌脂肪化从而AMI后VT发生,提示上调E6AP抑制C/EBPα转录可能是预防和降低AMI发生VT的重要靶点㊂
表2㊀各组脂肪细胞C/EBPα和E6AP蛋白相对表达量比较( xʃs)组别鼠数E6AP C/EBPα
空白组80.46ʃ0.020.44ʃ0.04
E6AP腺病毒组80.448ʃ0.040.43ʃ0.03 E6AP封闭组80.29ʃ0.02AB0.84ʃ0.04AB E6AP过表达组80.65ʃ0.03ABC0.18ʃ0.00ABC 胺碘酮组80.52ʃ0.01ABCD0.27ʃ0.01ABCD 稳心颗粒组80.58ʃ0.01ABCDe0.29ʃ0.01ABCD ㊀㊀注:与空白组比较:A P<0.01;与E6AP腺病毒组比较:B P<0.01;与E6AP封闭组比较:C P<0.01;与E6AP过表达组比较:D P<0.01;与胺碘酮组比较:e P<0.05
心梗后心律失常属于中医学 胸痹 怔忡 惊悸 等范畴㊂结合众多医家对本病的认识,认为本病多为本虚标实,以气血阴阳亏虚为本,瘀血㊁痰浊㊁寒凝㊁气滞等多种因素为标[8]㊂稳心颗粒以党参为君补中益气;黄精益气养阴为臣;三七㊁琥珀活血化瘀㊁镇静安神为佐药;甘松理气加强活血为使药,共奏安神定悸㊁益气养阴㊁活血祛瘀功效,临床常用于治疗心律失常㊂研究提示[9-11],稳心颗粒在治疗心梗后室性心律失常具有良好疗效,得到多名国内著名专家认可并成为共识,可能与稳心颗粒能够改善冠脉供血,改善微循环延缓心室重构和抑制钠通道及L-钙通道,稳定心肌膜电位等机制有关㊂胺碘酮作为III类广谱抗心律失常药物,能够有效抑制心房及心肌传导纤维的快钠离子内流,降低心肌细胞自律性和传导速度,发挥抗心律失常作用㊂但胺碘酮具有扩张外周血管降低血压㊁影响甲状腺功能等副作用,临床应用存在一定缺陷[12]㊂
本研究结果提示,稳心颗粒组和胺碘酮组都能明显上调前脂肪细胞E6AP表达和抑制C/EBPα表达㊂结合各组前脂肪细胞油红染色结果可知,E6AP 水平上调能够抑制前脂肪细胞分化,这与C/EBPα表达对前脂肪细胞的分化作用相反㊂由此可推测,胺碘酮和稳心颗粒可能通过上调E6AP水平及负性调节C/EBPα表达抑制心肌细胞脂肪化,但结果显示稳心颗粒E6APmRNA及蛋白表达明显高于胺碘酮组,但在C/EBPα表达中2组无明显差异㊂考虑本研究所检测基因较单一,其检测基因所涉及上游下游相关因子和相关通路影响尚不明确,其是否存在多通路多蛋白参与E6AP调控尚不得知,且细胞离开复杂的体内内环境调控,研究结果不能完全反映药物在体内的影响,未来仍需进行多通路㊁多蛋白组学的研究,同时对干预药物最佳浓度及安全性进行探索,进一步实施体内试验进行疗效验证㊂
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收稿日期:2020-03-27。