番茄蛋白酶抑制剂基因SLPI100的克隆、表达与生物信息学分析

基因组学与应用生物学,2020年，第39卷，第10期，第4656-4663页
研宄报告
Research Report
番茄蛋白酶抑制剂基因从P//如的克隆、表达与生物信息学分析
马宁刘亚荣崔军洪雨慧栾雨时’
大连理工大学生物工程学院，大连，116024
* 通信作者，丨****************.cn
摘要蛋白酶抑制剂(protease inhibitor，PI)在植物系统防御中发挥着关键作用。

为研究番茄P/基因的表达 模式及其编码蛋白的相关性质，本研究从番前中克隆7 —■个P1基因家族的成员，命名 为从P//00(登录号：X P_004249682.1)。

该基因编码区长为285 b p,编码94个氨基酸、蛋白的半衰期30 h、不稳定指数37.5、脂肪族指数丨21.17、平均疏水性0.189、理论等电点9.38、相对分子量10.52 k D、为疏水性蛋 白。

经同源性分析和多序列比对得知该基因具有P I功能结构域，属于马铃薯蛋白酶抑制剂I家族。

q R T-P C R 分析显示S L P//00在番茄根中的表达量最高，其次为叶，推测其在抗土传病害和叶部病害过程中发挥重要功 能；在致病疫霉菌()的侵染下，该基因的相对表达量呈现先升尚后下降的趋势，表明 其在番茄与病原菌互作过程中发挥重要作用。

本研究为番茄P/基因功能的鉴定以及培育抗病工程植株奠定 了基础。

关键词番前CSoZfl/iu.m Zyco/;e m V u m)，蛋白酶抑制剂，克隆，生物彳目息学分析
Cloning, Expression and Bioinformatics Analysis of Tomato Protease Inhibitor Gene SLPIJ00
M a Ning Liu Yarong Cui Jun H o n g Yuhui Luan Yushi*
School of Bioengineering, Dalian University of Technology, Dalian, 116024
* Corresponding author, *****************.cn
DOI: 10.13417/j.gab.039.004656
Abstract Protease inhibitor(PI)plays a key role in plant defense systems.In order to study the related properties and expression patterns of tomato PI gene,this study cloned a m e m b e r of the PI gene family from tomato,named SLPIJ00(GenBank accession number:X P 004249682.1). The length of the coding region of this gene was285 bp, with a predicted protein sequence of94 amino acids,a half-life of30 h,an instability index of37.5, an aliphatic index of 121.17, an average hydrophobicity of 0.189, a theoretical isoelectric point of 9.38, and a relative molecular weight of10.52 k D,a hydrophobic protein.The multi-sequence alignment and protein domain prediction indicated that the protein of this gene had a PI functional domain,belonged to the potato proteinase inhibitor I(Pin I ) family.q R T-P C R analysis showed that tomato SLPI100had the highest expression in roots,followed by leaves, which was presumed to play an important role in the process of resistance to soil-bome diseases and leaf diseases; Under the induction of Phytophthora infestans,the relative expression of this gene increased at f i r s t and then decreased later,indicated that i t played a role in the interaction between tomato and pathogens.This study laid the foundation for further identification of gene functions and cultivation of disease-resistant engineering plants.
K e y w o r d s Tomato(SoUurum lycopersicurn),Protease inhibitor,Cloning,Bioinformatics analysis
基金项目：本研宂由国家自然科学基金项目(31872116)资助
引用格式：Ma N.，Liu Y.R., Cui J.，Hong Y.Y., and Luan Y.S., 2020, Cloning, expression and bioinformatics analysis of tomato protease inhibitor gene Jiyinzuxue Yu Yingyong Shengwuxue (Genomics and Applied Biology)，39(10): 4656-4663 (马宁,刘亚荣，崔军，洪雨慧，栾雨时，2020,番茄蛋白酶抑制剂基因从P//洲的克隆、表达与生物信息学分析，基因组学与应用生物学, 39(10): 4656-4663)
番茄蛋白酶抑制剂基因S /,P //00的克隆、表达与生物信息学分析4657
番®5(So/wium /ycopersiVum )是世界范围内广泛 种植的重要蔬菜作物(Bhattarai et al .，2016)，在其生 长发育过程中常常会受到环境和微生物的影响(Fry ,
2008)。

病原菌的侵染是导致番茄品质下降的重要因 素之一（Cuietal .，2018)。

为了能够健康地生长，植物 体会合成并积累自我保护化合物用于抵抗病原微生 物，这类化合物包括蛋白酶抑制剂(protease inhibitor ,
PI )、几丁质酶、凝集素等(Chen et al ., 2014; Dang and
Van D a m m e , 2015;罗晶晶等，2015)。

P I 是一类分子量较小的蛋白质，根据氨基酸的
同源性和活性位点不同，可以将其分为4类:丝氨酸 蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor , SPI )、半胱氨 酸蛋白酶抑制剂(cysteine protease inhibitor , CPI )、金 属竣肽酶蛋白酶抑制剂(metallo proteinase inhibitor ,
M P I )和天冬氨酸蛋白酶抑制剂(aspartic proteinase in ­hibitor , API ) (Laskowski and Kato , 1980)。

SPI 是 一大
类复杂的植物蛋白，可以特异性地作用于丝氨酸蛋白 酶，是目前研究最广泛的P I 之…。

根据氨基酸组成及
排列顺序、拓扑异构学性质与蛋白酶结合性质等特点，
将S P I 分为4个家族：马铃薯蛋白酶抑制剂Upotato
proteinase inhibitor I ，Pin I )、马铃薯蛋白酶抑制剂 I I (potato proteinase inhibitor II，Pin D )、Kunitz 型蛋白酶
抑制剂(kunitz trypsin inhibitor ，K T I )和 Bowman-Birk 型蛋白酶抑制剂(browman-birk trypsin inhibitor , B B T I ) (Ryan , 2000)。

Pin I 家族是最早被鉴定的植物PI ,主要 存在于马铃裏(So/amtm
(Tunti et al .，2009)、
#^G (S . lycopersicum ) (Moura et al ., 2001; Udalova et
al .，2014)、烟
草
otoa ) (Miller et al .，2000)和
辣椒(Cqwicum f w m u u m ) (Joshi et al .，2014)等前科植 物中。

Pin I 家族含有多个成员且序列保守，但对其研 宄相对薄弱。

Pin I 可在细菌、真菌和线虫等侵害植物时诱导 表达。

据报道，拟南芥(<4ra /uWo /«i .s
在番部
J "香假单抱杆菌 D C 3000
p v .
Tomato D C 3000)的诱导下，Pin I 家族中蒺藜苜蓿PI 4
〇W W c m m c o i u /a proteinase inhibitor 14, MtPi 14)的 表达量较野生型拟南芥显著升高，抗性明显增强
(Sun etal .，2015)。

马铃薯—er <«u m )在抵抗致病疫
霉(P /j 声/)At/iora i V j /K 'i tow )的过程中会产生8 k D 的
Pin I ,能很好地抑制游动孢子的菌丝生长和萌发
(Valuevaetal .，2003)。

番前植株中的S P 丨家族成员K T I 4 可以与液泡酶(S . vacuolar protease 3, S 1V -P E 3)作用来提高果实对灰霉菌cinerea)的抗
病性(W a n g etal .，2017)。

综上所述,Pin I 在植物与病
原物互作过程中发挥了重要作用。

随着P 1研宂工作的开展，人们对其结构、功能、 拓扑异构学性质和同源性等特征都有了初步认识。

但目前己知的P I 家族成员尚少，不同成员间的结构
和性质又存在差异。

目前未检索到番茄S L P //00基
因的相关报道。

本研究前期通过R N A -s e q 技术发现, 番茄在受致病疫霉菌(P .
侵染的不同时期，
基因表达量具有显著变化。

本实验在前期工
作的基础上，通过R T -P C R 技术克隆了番茄蛋白酶 抑制剂基因S L P //00,并进行表达模式以及预测蛋白 的分析，为进一步研究该基因的功能提供参考。

1结果与分析
1.1番茄SL /V 7卯的克隆
采用R T -P C R 方法，获得了番茄S L P //00基因片 段，经琼脂糖凝胶电泳后得到单一条带(图丨)，将其 连接至p M D - I 9T 载体进行测序，结果显示该序列与
数据库中的基因编码序列(coding sequence , C D S )—致，符合预期。

1.2 SLPI 100的氨基酸序列及理化性质分析
本研宄得到的番茄S L P //W
的C D S 长285 b p ，
编码94个氨基酸(图2)。

采用ProtParam 程序预测
S L P 1100蛋白半衰期30 h ;脂肪族指数121.17;平均
疏水性0.189;有8个负电荷的氨基酸残基，包括3个 天冬氨酸(Asp )和5个谷氨酸(Glu );有]丨个正电荷氨 基酸残基，包含8个精氨酸(A r g )和3个赖氨酸(Lys ); 不稳定指数为37.5,表明其是疏水性蛋白质，稳定性 相对较好；理论等电点9.38,说明其为碱性蛋白质； 相对分子量为10.52k D ，化学式是C 474H 783N m 01S )S 。

氨基酸组成中含量最高的是亮氨酸(Leu ),占13.8%，
M
图1
PCR 扩增产物电泳
M: DL2000 DNA Marker; 1: SLPI100
Figure 1 PCR amplification product electropherogram Note: M: DL2000 DNA Marker; 1:
SLPI100
4658 基因组学与应用生物学
1 A T G G A G A A G T T A A C T C T T G T G G T T G T C T T C T T G C T T C T T G C A T C A T T G A T T C A A C C T C T C 1 M E K L T L V V V F L L L A S L I Q P L 61 A C G G C T C A A T C C G G T T G C C C A G G A G TG A G A A A A G A A A C A TG G C C A G A A C TTC TTG G TG TA
21 T
A
Q
S
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C
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V
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L
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121 CCA G CA A G A TTG G CTA G G G A A A TA A TTC A A A A G G A A A A TC C A A G A C TA A C TA A TA TTG G A 41 P A R L A R E I I Q K E N P R L T N I G 181 A A T G T A C A A A A T G G T T C A C C T G T T A C A C A A G A T T T T C G A T G T G A T C G A G T T C G T C T T T T T 61 N
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241 A T T A A T A T T T T G G A T T T T G T C G T A C A A G T T C C T C G A A T T G G T T A A 81
I
N
I
L
D
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V
Q
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R
I
G
*
图2 SLPI100的核苷酸和编码的氨基酸序列 注：下划线:启动子和终止子
Figure 2 The nucleotide and encoded amino acid sequence of SLPI100 Note: Underlined: The promoter and terminator
含量最低的是甲硫氨酸(M e t )和色氨酸(Try ),均占 1.1%〇将SLP I 100氨基酸序歹l j 与番茄基因组数据库 进行B L A S T 比对，发现其注释功能为编码Pin I ,预 测其属于P I 家族成员。

0.2
871 St
7B jl S 68 1_99
100
StPI810(AEH21810.1)StPI811 (AEH21811.1) StPI809(AEH21809.1) StPI593 (XP_015158593.1)-------StPI435(sp|Q41435.1)__1----- TR8(AAA 16881.1)
"981-------- St257(NP_001275257.1)
----------------SIVPE3 (Solyc08g065610.2.1)
99
5
-StPI (DQ822994.1)
SLPI100 (XP_004249682.1)
--------PPI2C1A(AAZ08246.1)
图4 SLPI100与其他Pin 成员的系统进化树
注：StPI810, StPI811，StPI809, StPI593, St257, StPI435, StPI 和
PPI2C1A 为马铃薯 Pin; SLPI100 和 TR8 为番茄 Pin; S1VPE3
为番茄液泡蛋白酶
Figure 4 Phylogenetic tree of SLPI100 and other Pin family mem­bers
Note: StPI810, StPI811, StPI809, StPI593, St257, StPI435, StPI 1.3 SLPI 100的氨基酸序列同源性分析
结构域是蛋白具有特异结构和独立功能的区 域，与生物体各种生理功能有着密切关系。

番茄Pin 1
家族成员SL P I 100和马铃薯、烟草、辣椒Pin [家族 成员之间具有保守结构域。

进一步通过C L U S T A L X 系统的同源性分析和多序列比对，得知番茄SLPI 100 与后三者的序列一致性分别为90.43%、76.60%、 77.66% (图3)。

可见番茄SLPI 100的氨基酸序列与其 他茄科植物的Pin I 具有明显的相似性。

1.4番茄SLPU 00与其它P in 家族成员进化关系
由邻接(neighbor joining , N J )法构建的系统进化 树可见，番茄SLP I 100与马铃薯Pin I 家族成员卩卩1- 2C 1A (potato proteinase inhibitor 2(1!1人 PPI 2C 1A )亲缘关系最近，其次是马铃薯n (S .
proteinase
inhibitor , StPI ),三者具有高度同源性，优先聚为一类;
而其与番茄S P I 裂解相关联的液泡蛋白酶(5.&〇〇/^-
/•■«'c o n vacuolar protease 3, S 1V P E 3)没有优先聚为一类，显示出相对较远的亲缘关系(图4)。

1.5 SLPI 100的空间结构及亲疏水性分析
蛋白质的结构决定功能。

借助H N N M e t h o d s 预
and PPI2C1A for potato Pin; SLPI 100 and TR8 for tomato Pin; S1VPE3 is tomato vacuolar protease
测到SL P I 100的二级结构由40个a -螺旋(42.55%)、
7个伸展链(7.45%)、
6个(3-折叠(6.38%)和41个无 规则卷曲(43.62%)组成(图5)。

采用S W I S S -M O D E L 进行同源建模(P y M O L 视图）
，得到SLPI 100在24~94位间的三级结构模型，其中螺旋部位代表a -螺 旋,键头部位代表(3-折叠，
线型部位代表无规则卷 曲(图6)。

蛋白质的折叠主要由氨基酸的亲、疏水性共同 驱动，折叠时会形成亲水表面及疏水内核，同时跨膜 区域会出现高水平疏水性结构。

因此,通过亲、疏水 性的分析可以反映出蛋白质表面氨基酸的分布情况 和跨膜结构域的特征。

经ProtScale 分析得知番茄
SLPI 100氨基酸残基整体表现为疏水性，与理化性质
分析一致，因此推测其可能为疏水性蛋白(图7)。

1.6 SLPI 100可及性分析
蛋白质的可及性能反映氨基酸残基与溶剂分子 的接触程度，并与其三级结构相关。

采用Swiss -Pdb -
viewer 预测了 SLPI 100的可及性模型（图8),可及性
由弱到强排列为黄色、绿色、蓝色。

因此，可根据氨基
S. lycopersicm S. tuberosm N. tabacum C. annuum
m kl l w fill s qpl aqs cpg k wpel gvpa are iqken Itn ngspvt d rc rvrlf n l d f w pr g
94
949494
图3番茄SLPI100与其他茄科植物的P in 丨多序列比对注:方框内区域表示保守域
Figure 3 Multiple sequence alignment of tomato SLPI 100 with other Solanaceae plants
Note: The area inside the box indicated a conservative field
番茄蛋白酶抑制剂基因洲的克隆、表达与生物信息学分析4659
IlllllllllH Inn；u l l l|h l；n n||"| |||l n n|||||m H m n m n||| | |
10 20 30 40 50 60 70 80 90
A A aa
' -〜一...
10 20 30 40 50 60 70 80 90
图5 SLPI100的二级结构
注:蓝色:(X-螺旋；紫色:无规则卷曲；绿色：P-折叠;红色：伸
展链
Figure 5 Secondary structure of the SLPI100
Note: Blue: a-helix; Purple: Random coil; Green: p-sheets; Red: Extended chain
图6SLPI100的三级结构
Figure 6 Three-dimensional structure of the SLPI100
Position
图7 SLPI 100的亲，疏水性分析
注：分数的正，负分别代表疏，亲水性
Figure 7 Pro-hydrophobicity analysis of SLPI 100
Note: The positive and negative fractions of the scores represent sparse and hydrophilic
酸残基所显示的颜色来判断其可及性的高低，其中黄色表示被溶剂分子接触的可能性最小。

由预测结果可以看出，黄色位点的数量最多，表明S L P I100蛋 白中能够与溶剂分子接触的氨基酸数量最少，推测其可能是疏水性蛋白质。

1.7 S L P/7㈨的启动子元件分析
利用P l a n t C A R E 对S L/V/00 上游 1 000 b p 序列的分析发现，在启动子区域存在响应生物胁迫的元件(T C重复序列，W l-B o x)及响应非生物胁迫(干旱)图8 SLPI 100的可及性
注：黄色：可及性极弱；绿色：可及性弱；蓝色:可及性极强Figure 8 Accessibility of SLPI 100
Note: Yellow: Extremely weak accessibility; Green: weak acces­sibility; Blue: strong accessibility
和植物激素（乙烯)的元件(M B S和E R E)(表1)。

由启动子元件的组成，推测该基因在生物及非生物胁迫中具有重要作用。

1.8番茄中S L P//洲的组织特异性分析
利用q R T-P C R对S L P//00在番茄不同组织中的表达模式分析，结果表明，S L/Y/00在番前根的表达水平明显高于叶，茎的表达水平明显低于叶(图9)。

1.9致病疫霉侵染下番茄中SLPI100的表达特异性分析
利用q R T-P C R对致病疫霉(f*.i r a/estois)侵染后
表1SLP//00的启动子元件分析
Table 1Analysis of the promoter components of SLPI 100
上游启动子元件
Upstream promoter element
功能
Function
CAAT-box, TATA-box核心启动子元件
Core promoter element
MBS干旱响应元件
Drought response element
ERE乙稀响应元件
Ethylene response element ABER脱落酸响应元件
Abscisic acid response element GT1-motif, Box I, GA-motif光响应元件
Light response element
TC-rich repeats, Box W1生物胁迫及病害防御响应元件
Biological stress and disease
defense response element CGTCA-motif, TGACG-motif茉莉酸甲酯响应元件
Methyl jasmonate response element
4660基因组学与应用生物学
根
茎
叶
Root
Stem
L eaf
组织名称
T issue nam e
图9 SLP //洲在不同组织中的表达特性 、注：不同字母表示样本间差异显著(/；<0.05)
Figure 9 Expression characteristics SLP! 100 in different tissues
Note: Different letters indicated significant differences between
samples at p<0.05
不同时间的番茄叶片分析，发现与对照组相比，接菌 处理的番茄S L P //00的相对表达量从3 h 开始显著 增加，12 h 时达到最大,之后表达量开始下降(图10)。

根据从P //00的相对表达量变化趋势，可以初步判 断该基因能够响应番茄和病原菌的互作，表明其可 能参与了番茄早期的抗病防御过程。

2讨论
目前，茄科植物Pi n I 的分布及其功能的研宄比 较广泛(T u r m et a 丨.，2009),其他植物的Pin I 研究也 有诸多报道(W a n g et al ., 2008)，而番茄Pin I 家族中 51^1100未见报道。

卩丨111是广泛存在于生物体内的 蛋白酶活性调节剂，在一系列生理和病理过程中发 挥着重要作用(Finiti et al .，2014)。

本研究从实验室前
@接閑处理
（H 1尤蘭水对照
设染时间(h>
Infection time (h)
图10SLP //洲在致病疫霉侵染下的表达特性
注：不同字母和*分别表示接菌处理和无菌水对照各组内样 本间差异显著(pcO.OS)
Figure 10 Expression characteristics of SLPI100 under P. infestans in­fection
Note: Different letters and * indicated significant difTerences be­tween samples at p<0.05 in the inoculation treatment and sterile water control
期的转录组数据库中获得了 S L P //00基因序列，并
设计了特异性引物，经过克隆以及测序获得C D S 序 列。

将克隆的番茄S L P //O 0基因与G e n B a n k 中已公 布的马铃薯、烟草和辣椒的Pin I 基因通过B l a s t 比对 预测得到同源序列，说明S L P //W
为Pin I 家族成员。

据相关研究报导，水稻(Oryza so /tVa )中Pin I 家 族的O s P 18-l 主要在茎尖分生区表达（W a n g e t a l .，2008);马铃薯(S .
的Pin I 转录本在块茎和
芽中含量丰富，而在其他组织(根，匍匐茎，叶)中含量 $父低(Turrfi et al ., 2009);龙莫(So/araum w n e r i c i m u m )中
P i n 家族的S a P I N 2a ,在茎中表达量较高(Sin a n d C h y e ，
2004)。

而本研宄中的S L P //00在番茄的各组织均有 转录，但在不同组织处的表达水平差异显著，具有明 显的时空特异性，其在根中的表达丰度最高,其次是 叶，最低为茎。

该基因在番茄中的表达与之前在其它 物种中的报道存在差异，推测番茄S L /V /00时空表 达差异与其抗病功能具有关联。

己有实验证明，玉米
在抵抗土传植物病原体-肉桂疫霉(P /iyto -
ctVinrwmwji )时，根部的P I 含量明显增尚（八1-
lardyce et al .，2013)。

PI 是
针对根结线虫狀
Zn .c ogni «a )的植物保护物质，与易感番前相比，具有抗
性基因的番茄在叶和根中具有更高的P i s 活性(11-
dal o v a et al .，2014)。

番前土传病害如尖孢镰刀菌 (f h s o r i u m
o r u m )侵染导致的枯萎病（徐艳辉等，
2008)和叶部病害如致病疫霉(P . )侵染导致
的晚疫病(F r y , 2008)是使植株感病的主要方式，推测 番茄在长期进化过程中，土传病害的高频发生致使 其根部P I 表达量高，用以抵御病原菌的侵染。

因此, 继续深入研究该基因在番茄中的精细表达差异是有 必要的。

有研究显不，虹i i (V 7g 7!.a 中与番前
S i P //00同为一个家族的P 丨，为疏水性蛋白质，并对
四纹S •象(C a //(M 〇6rac/!iw m a c u /aif «)具有抗性(1^1〇11-
teiro Jiinior et al ., 2017);马铃薯（S . /M e r a m m )中的 P I ，受致病疫霉菌(f *.
感染后累积，经鉴定此
类蛋白质是疏水性蛋白质(F e m f t n d e z et al .，2012);烟 草(/V . i a i o c u m )中的Pin I 为疏水性蛋白，能够抵抗马 铃著(Sofonump/iureya)的青枯病(林世峰等,2012)。

与 疏水性弱的P 丨相比，疏水性强的H
的抑制作用专一
性效果更好（Li e t a l .，2002)。

本研究分析证明番前 从/3//00属于疏水蛋白，据此，可以推测在植物体中 发挥抗病功能的P I 多为疏水性蛋白，可能由于疏水 特性更利于蛋白发挥抗病功能。

系统进化分析显示，番茄S L P /W 0与马铃薯Pin
u o l s s a jd x l u 3>l «3y
c
o l s s l >J d x a >3>l l «p C E
:
番茄蛋白酶抑制剂基因从P//00的克隆、表达与生物信息学分析4661
I家族的P P12C1A和S t P l在进化上最近，优先聚为一类;与番茄液泡蛋白酶S1V P E3相对较近。

据报道，番前(S_ /ycopersiciw!)中的液泡蛋白酶S1V P E3,在S P1裂解过程中具有关键作用，可以通过调节S P I的活性，间接地调控植物抵抗灰霉菌(B.cinerea)的侵害(W a n g et al.，2017);马铃薯高抗青枯病二倍体基因型材料(S.p/mreya)中Pin I家族的S t P丨，能够响应植株的抗青枯病反应(Li et al.，2007);此外，马铃薯(S.—e;•綱m)的另一个Pin I家族成员P P I2C1A，能够对金线虫(G/o6od e ra rfwtochie/isi.s)产生一■定的抗性(T u r m et al., 2009)。

因此依据其亲缘关系，推测S L P I100 很可能与S1V P E3、P P I2C1A和 StPI类似，在番前中具有抗病害能力。

根据致病疫霉(P.Z
侵染下番茄S L P I100的表达特异性分析显示，与对照组相比，其相对表达量随着时间的推移呈现显著先上升后下降的趋势，可以初步判断该基因在番茄和致病疫霉菌的互作中能够发挥抗病功能。

Pin I除了可以由生物胁迫诱导，还能够响应机械损伤、干旱、高盐和低温等非生物胁迫。

有研宂表明，f e柄草(B r o c/iypoc^'um r f!:s(a c/iyon.)在受到机械损伤时，Pin I的含量明显上升(M u r etal., 2004)。

水稻
(0.如“）Pi n I家族的O C P丨1可响应干旱胁迫
(H u a n g et al.,2007);而水稻O C P I2可在盐、寒冷和机械损伤诱导下产生(Singh et al.，2009)。

因此,P I在植物抗生物胁迫和非生物胁迫过程中均发挥了重要功能。

对P1开展研究不但可以丰富植物抗生物和非生物胁迫相关理论，而且可以为培育高抗番茄品种奠定基础。

3材料与方法
3.1试验材料
本研究所用番前‘早粉2号’(S. /y c o p e r si c uw ic v. Z a o f e n N o.2)材料和致柄疫霉(P.f'n/estou)菌种 P12103 为本实验室保存。

R N A i s o p l u s试剂、反转录E x 7^酶、D L2000 D N A M a r k e r、p M D-19T 载体、Tris-乙酸(T A E)缓冲液、切胶回收试剂盒、T B G r e e n™P r e m i x E x 7^/™n(Tli R N a s e H Plus)试剂盒、P C R 仪均为T a K a R a公司产品。

引物合成在上海捷瑞生物工程有限公司完成，测序工作在华大基因(北京)公司完成。

3.2番茄SZJV/洲的克隆
根据实验室前期的高通量转录组数据库，得到序列信息。

将序列在番茄基因组数据库(版本：T o m a t o G e n o m e C D S(I T A G release 2.40>)中进行B l a s t比对。

比对正确后采用Prinie r5设计特异性引物，上游引物为F P-5'-C G G G A T C C A T G G A G A A G T
T A A C T C T T G T-3’,下游引物为R P-5’- C G A G C T C T
T A A C C A A T T C G A G G A A-3'。

利用致病疫霉接种3 d 的番茄叶片提取R N A,用反转录试剂盒进行c D N A 合成。

用上述c D N A和特异性引物进行P C R,反应体系和条件如下：预变性94°C 5 m i n;变性94°C 30s,退火48.1 °C 30 s,延伸72°C 30 s,共35个循环；再延伸72 °C 7 m i n;4°C孵育。

扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测后，回收连接P M D-19T载体，转化大肠杆菌D H5a感受态细胞(C o h e n et al., 1972),并送至华大基因(北京)公司测序。

3.3生物信息学分析
由N C B I数据库下载S L P I100的同源序列；通过G e n B a n k中O R F F i n d e r在线分析工具查找该基因的O R F;在番茄基因组数据库中，获得与番茄S i P//00 序列相似基因的注释功能;利用P r o t P a r a m在线程序分析氨基酸的一级结构及理化性质；核苷酸序列的分析和翻译采用D N A M A N6.0软件进行；蛋白质的亲疏水性分析采用P r o t S c a l e程序完成；应用H N N M e t h o d s在线软件分析蛋白质二级结构；多重序列比对及系统发育树构建利用C L U S T A L X 1.81和M E G A X软件;利用软件S w i s s-P d b v i e w e r4.0.l预测蛋白质的可及性模型：采用P l a n t C A R E在线软件针对S/J3//㈨进行启动子元件分析(Lescot et al.，2002)，选取在番前基因组上该基因的A T G起始密码子上游1000 b p 序列。

在用上述软件分析时均使用默认参数。

从番茄和马铃薯的P i n中分别选取其家族2个成员和8个 成员，采用M E G A X将S L P I100与其他P i n序列比对后，应用邻接(neighbor joining,N j)法构建系统进化树,B o o t s t r a p自检重复丨000次。

使用S W I S S-M O D E L 程序，预测第24〜94位区域的三级结构模型，利用P y M O L视图软件进行同源建模。

3.4番茄中S L P I100的组织特异性分析
从5叶期的健康番茄幼苗的根、茎和叶片分别提取R N A,反转录后，采用T B G r e e n™P r e m i x E x 7^™U(Tli R N a s e H Plus)试剂盒进行S Y B R探针法q R T-P C R,分析S L P//W在不同组织中的表达水平。

使用番茄A ct in (登录号：U60478.1)作为内参基因进行q R T-P C R分析实验。

上下游引物由北京华大公司合成(表 2)<=q R T-P C R 反应体系如下：T B G r e e n P r e m i x E x Taq D(Tli R N a s e H Plus) 10|jl L, P C R F o r w a r d P r i m e r
4662基因组学与应用生物学
(10 p,m o l/L) 0.8 j ul L.P C R R e v e r s e P r i m e r(10 (jimol/L)
0.8 |x L，R O X R e f e r e n c e D y e n 0.4 |x L，c D N A 2 j x L,
d d H20 6 |x L。

反应条件为：预变性95°C 30 s;P C R反 应951：5 5,601348，共40个循环。

溶解曲线温度区间为50°C〜95°C,每30 s升高0.5°C;并在升温后进行荧光采集，设置在每个循环延伸结束之后。

每对引物和模板组合在同一次反应中都设置3次独立重复，选用3株进行生物学重复，采用法计算基
因的相对表达量，使用S P S S软件对结果进行单因素方差分析。

3.5番茄在致病疫霉侵染下S L P//洲的表达特异性分析
将保存的致病疫霉菌种接种于燕麦培养基中央，置于20°C的培养箱中，黑暗条件下培养两周左右。

向培养致病疫霉菌的平板中加入5~6m L的无菌水，用接种环轻轻刮下培养基表面的菌丝和孢子，用 双层无菌纱布过滤菌丝及培养基，将上述液体转移至50 m L三角瓶中，调整菌液的终浓度为lxlO6个孢子/m L，并放在4°C冰箱1〜2 h以诱导孢子游动。

将制备好的致病疫霉孢子悬浮液喷洒5叶期的番茄幼苗叶片，于18°C左右，相对湿度90%的条件下，黑暗条件下放置24h后见光，对照组使用等量的无菌水代替。

在处理后0、31611、丨211、2411、4811、7211和9611收取番茄叶片，使用液氮充分研磨提取R N A,经反转录得到c D N A，应用q R T-P C R技术检测番茄在致病疫霉侵染下S L P I100的表达模式，实验设置3次生物学重复，采用法计算基因的相对表达量，使用S P S S软件对结果进行单因素方差分析。

作者贡献
马宁是本研究的实验设计和研究的执行人，负 责实验操作、生物信息学预测、数据分析和论文撰写;刘亚荣主要负责图片的制作和修改;崔军和洪雨慧参与研究辅助分析；栾雨时指导课题设计、提供试验条件。

全体作者都阅读并同意最终的文本。

表2q R T-P C R引物序列
Table 2 Primer sequences in qRT-PCR
基因名称引物名称引物序列(5’_3’）
Gene name Primer name Primer sequences (5'-3')
Ac t in Actin-FP
Actin-RP SLPI100100-QFP
100-QRP TGTGTTGGACTCTGGTGATGGTGT
ATCCAAACGAAGAATGGCATGCGG
GTGGTTGTCTTCTTGCTTCTTG
CAAGAAGTTCTGGCCATGTTTC
致谢
本研宄由国家自然科学基金项目(31872116)资助。

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