刺五加的心肌保护作用及其机制的研究

刺五加的心肌保护作用及其机制的研究
作者：黄伟李桂霞解岩戚汉平
来源：《中国医药导报》2011年第32期
[摘要] 目的：研究刺五加对急性心肌缺血大鼠的心肌保护作用及可能机制。

方法：将40
只雄性Wistar大鼠随机分为假手术组，模型组，刺五加高、中、低剂量（100、50、25
mg/kg）组，每组各8只。

采用结扎大鼠左冠状动脉前降支制备急性心肌梗死模型，观察刺五加对心肌缺血的保护作用；采用原位末端脱氧核糖核酸转移酶介导的d-UTP缺口末端标记（TUNEL）法检测刺五加对心肌缺血大鼠心肌细胞凋亡的影响；采用激光扫描共聚焦技术检测刺五加对细胞内游离钙离子浓度的变化。

结果：高剂量刺五加可缩小心肌梗死面积（P＜0.05），改善缺血心肌的心功能，减少缺血心肌细胞凋亡（P＜0.05），对60 mmol/L KCl诱导的缺血细胞内游离钙离子浓度的升高有明显抑制作用（P＜0.05）。

结论：刺五加对大鼠心肌缺血具有保护作用，其机制可能是通过下调细胞内游离钙离子浓度，抑制了心肌细胞凋亡。

[关键词] 刺五加；心肌梗死；共聚焦；游离钙离子
[中图分类号] R542.2 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2011）11（b）-023-03
Analysis of the myocardial protection effects and mechanism of Acanthopanax Senticosus
HUANG Wei, LI Guixia, XIE Yan, QI Hanping
Department of Pharmacology, Daqing Campus of Harbin Medical University, Heilongjiang Province, Daqing 163319, China
[Abstract] Objective: To investigate the protective effect of Acanthopanax Senticosus against myocardial ischemia and detect the possible mechanisms. Methods: 40 cases of male Wistar rats were divided into sham group, model group, low dose, middle dose and high dose Acanthopanax Senticosus group (100, 50, 25 mg/kg), each of 8 cases. The protective effects of Acanthopanax Senticosus on myocardial ischemia were observed by models of acute myocardial infarction which were operated with permanent ligation of left anterior descending coronary artery in rats. Myocardium apoptosis was measured by TUNEL. Laser scanning confocal microscopy was utilized to assay the effect of Acanthopanax Senticosus on intracellular calcium concentration. Results: In the high dose Acanthopanax Senticosus group, infarct size of myocardium decreased (P＜0.05), heart function of ischemic myocardium improved (P＜0.05), apoptosis of ischemia cardiac myocytes was inhibited (P ＜0.05), and intracellular calcium concentration decreased markedly which was induced by 60
mmol/L KCl (P＜0.05). Conclusion: Acanthopanax Senticosus possesses protective effect on myocardial ischemia of rats. The possible mechanisms of myocardial ischemia are due to the decrease of intracellular calcium concentration and the inhibition of cardiac myocytes apoptosis.
[Key words] Acanthopanax Senticosus; Myocardial infarction; Confocal; Intracellular calcium concentration
刺五加（Acanthopanax Senticosus， AS）是一种传统中药，具有抗氧化和清除自由基的作用，广泛应用于风湿病、高血压、胃溃疡、肝炎以及缺血性心脏病[1-2]。

有研究表明，AS能防止缺血再灌注室性心律失常的发生[3-4]，并有效抑制急性心肌梗死大鼠的心室重构[5]，但对心肌缺血损伤的保护作用及其机制尚不明确。

进一步研究表明，AS能明显减少脑出血后神经细胞凋亡，提高Bcl-2表达水平，降低Bax表达水平，保护出血后神经细胞[6]，而其对心肌缺血损伤细胞的凋亡相关机制尚未见报道。

基于上述研究，本实验提出了AS对心肌缺血具有保护作用的机制可能与降低细胞内钙离子浓度和抑制缺血心肌细胞凋亡相关的假设，这将为进一步临床用药提供理论依据。

1 材料和方法
1.1 实验动物
雄性Wistar大鼠，体重180~250 g，40只，由哈尔滨医科大学实验动物中心提供。

1.2 药品和试剂
刺五加注射液（黑龙江乌苏里江制药有限公司，中国），羟乙基哌嗪乙硫磺酸（Sigma公司，美国），胶原酶Ⅱ（Sigma公司，美国），EGTA（Sigma公司，美国），牛血清白蛋白（Sigma公司，美国），Fluo-3/AM（Sigma公司，美国），TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（Roche公司，德国）。

1.3 方法
1.3.1 心肌缺血模型的制备[7] 戊巴比妥钠40 mg/kg麻醉固定雄性Wistar大鼠，记录标准Ⅱ导联心电图。

沿胸骨左缘3~4肋间开胸，挤出心脏，在左冠状动脉前降支距左心耳下缘2 mm 处穿线，15 min后取心电图正常鼠随机分为5组，每组8只，其中，假手术组，冠状动脉下穿线不结扎；模型组，结扎左冠状动脉前降支，模型制作成功大鼠以心电图ST段明显抬高，结扎线以下心肌变暗为缺血标志；高、中、低剂量（100、50、25 mg/kg）AS组，舌下静注AS 注射液30 min，结扎左冠状动脉前降支；假手术组与模型组注射同等剂量的生理盐水。

1.3.2 血流动力学测定结扎6 h后，戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉大鼠，分离右侧颈总动脉，插入测压导管，并连接BL-420型多导生理仪，再将导管插入左心室。

监测左心室舒张末压、左心室收缩压、左室内压上升（下降）最大速率。

1.3.3 心肌梗死面积测定结扎6 h后取出大鼠心脏左室，将心肌均匀横切成5片，放入
1%TTC磷酸缓冲液中，37℃水浴，避光染色10 min。

心肌颜色白色为缺血区，红色为非缺血区，以缺血区心肌占左室质量比作为梗死面积百分率。

1.3.4 凋亡指数检测采用TUNEL法检测心肌细胞凋亡指数，按照试剂盒步骤操作，缺血心肌阳性细胞以双染确定，以阳性核染细胞数占总细胞核数之比计算凋亡指数。

1.3.5 细胞内游离钙离子浓度测定[8] 戊巴比妥钠麻醉后快速取出大鼠心脏，用充氧的冷台氏液冲洗，经主动脉接于Langendorff管离体灌流装置上，正常台氏液（NaCl 126 mmol/L，KCl 5.4 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，NaH2PO4 0.33 mmol/L，MgCl2 1.0 mmol/L，CaCl2 1.8 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L，用NaOH调pH为7.4）灌流15 min左右，直至将血液冲洗干净，接着用无钙台氏液继续灌流，最后用含胶原酶Ⅱ（0.2 mg/mL）和BSA（0.2 mg/mL）的无钙台氏液进行循环消化，当心脏变软，将其放入装有5 ml KB液（谷氨酸70 mmol/L，牛磺酸15 mmol/L，KCl 30 mmol/L，KH2PO4 10 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，MgCl2 0.5 mmol/L，葡萄糖10 mmol/L，EGTA 0.5 mmol/L，用KOH调pH为7.4）的试管中，置于4℃冰箱稳定1~2 h备用。

取稳定好的细胞用10 μmol/L Fluo-3/AM和0.03% Pluronic F-127在37℃恒温水浴中孵育45 min，然后用正常台氏液洗涤2次去除细胞外Fluo-3/AM。

应用激光扫描共聚焦显微镜在氩离子激发波长为488 nm，发射波长为530 nm，物镜（40×）下实时监测细胞内[Ca2+]i浓度的变化，在Time series程序下对细胞XY平面进行扫描，计算细胞XY平面内平均荧光强度（fluorescent intensity，FI），以FI代表细胞内[Ca2+]i浓度，正常细胞[Ca2+]i浓度以F0表示，增加的[Ca2+]i浓度用FI/F0表示。

1.4 统计学分析
采用SPSS 10.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用方差分析，多组间的两两比较采用LSD-t检验，以P
2 结果
2.1 刺五加对心肌缺血大鼠血流动力学的影响
与模型组相比，高剂量AS组能显著提高心肌梗死大鼠的左心室收缩压（P
2.2 刺五加对缺血大鼠心肌梗死面积的影响
与假手术组比较，模型组大鼠心肌梗死面积明显增大（P
2.3 刺五加对急性心肌缺血大鼠心肌细胞凋亡的影响
假手术组仅发现少量心肌细胞凋亡，心肌细胞核呈蓝色，模型组可见大量心肌细胞凋亡，凋亡的心肌细胞核呈深浅不一的棕褐色（图1，见封三）。

与模型组比较，高剂量AS组心肌细胞凋亡明显减少（P
2.4 刺五加对KCl介导的大鼠心肌细胞[Ca2+]i浓度的影响
正常细胞[Ca2+]i浓度较低，为绿色；缺血细胞[Ca2+]i浓度较正常细胞升高，为蓝绿色；缺血细胞中加入60 mmol/L KCl，[Ca2+]i浓度显著升高，荧光强度增大；当高剂量AS组细胞加入KCl后，荧光强度值升高，但升高的幅度明显低于缺血+KCl组（图3，见封三）。

与正常细胞比较，缺血细胞[Ca2+]i浓度显著增高（P
3 讨论
急性心肌梗死首先会导致心肌细胞的损伤[9]，持续的心肌缺血会导致心衰并伴随心律失常，容易引起死亡。

急性心肌缺血的治疗核心是保护心肌和降低死亡率。

AS被用于治疗脑缺血、冠心病有一定的疗效，而有关其对心肌的保护作用和机制尚未明确。

本实验通过建立心肌缺血模型，研究AS的心肌保护作用及可能机制。

本实验研究结果显示，AS能缩小左冠状动脉前降支结扎大鼠的心肌梗死范围，这是一个最可靠的心肌保护指标，从而说明在大鼠模型中AS有心肌保护作用。

AS能提高心肌梗死大鼠的左心室收缩压，升高左室内压上升（下降）最大速率，降低左心室舒张末期压，说明AS 具有改善缺血心肌心功能的作用。

AS对心肌有保护作用，但其对心肌缺血的保护机制尚未明确。

缺血能导致细胞凋亡，并引发基因反应[10]。

本实验结果显示，AS对心肌缺血所引发的心肌细胞凋亡具有明显的抑制作用，说明AS对缺血心肌的保护作用部分可能是由于减少了心肌细胞的凋亡所引起的。

[Ca2+]i浓度升高能导致细胞异常，比如收缩功能障碍和细胞凋亡[11]。

本研究共聚焦结果显示，AS可以降低由KCl介导的缺血心肌细胞[Ca2+]i浓度，说明其心肌保护作用可能与减少心肌缺血时的细胞内钙超载有关。

综上所述，AS对大鼠心肌缺血具有保护作用，其机制可能是通过下调心肌细胞内[Ca2+]i 浓度，抑制了心肌细胞凋亡而实现的。

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（收稿日期：2011-06-30）。