酶联免疫吸附法检测饲料中黄曲霉毒素B1

酶联免疫吸附法检测饲料中黄曲霉毒素B1
苟双
【摘要】黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉的次级代谢物,具有强烈的致癌、致畸和致突变的作用,危害性很强.为了解绵阳市仔(乳)猪饲料中黄曲霉毒素B1污染情况,制定防治和保护措施提供依据,利用酶联免疫吸附ELISA原理对20个品牌(品种)仔猪饲料进行检测,结果显示总体情况良好,但仍有隐患.
【期刊名称】《饲料博览》
【年(卷),期】2013(000)007
【总页数】3页(P51-53)
【关键词】饲料;仔猪;黄曲霉毒素;酶联免疫吸附
【作者】苟双
【作者单位】四川省绵阳市饲料质量监督所,四川绵阳 621000
【正文语种】中文
【中图分类】S816;S823
黄曲霉毒素B1（AFB1）分布广泛，是毒性、危害巨大的天然毒素，黄曲霉毒素（AF）在高剂量时能够导致急性死亡，长时间、低剂量地摄入AF会导致慢性中毒[1-2]。

AF会破坏猪的消化酶活性，阻碍其对基本营养物的吸收，降低饲料转化效率，造成猪体消化机能紊乱，食欲减退、营养不良、贫血、免疫抑制、增重减缓和生长发育停滞，AFB1超标导致仔猪生产性能下降[3-6]。

1 试验材料与方法
1.1 试验仪器与试剂
主要仪器与试剂包括上海三科仪器有限公司生产的318MC型酶标仪、苏微微生物研究有限公司生产的AFB1酶联免疫定量测试盒、粉碎机、80-2台式低速离心机、往复式振荡器、恒温箱、恒温水浴锅、微量移液器、125 mL分液漏斗、100 mL
具塞锥形瓶、8 cm短柄漏斗、15 mL和2 mL离心管、分析纯甲醇、甲醇水（1∶1）等。

1.2 试验样品
检测样品由绵阳市畜牧兽医部门10月提供的在15个乡（镇）饲料销售门市、养
殖场抽取的20个仔（乳）猪饲料样品，涉及20个品牌（品种）饲料，类型有配
合饲料和浓缩饲料，样品均在保质期内，覆盖面广，有很强代表性。

1.3 试验方法
1.3.1 待测样品液的制备
按照GB/T 20195-2006进行试样的制备，颗粒饲料取80.0～100.0 g样品粉碎成粉末状。

称取配合饲料5.0 g于100 mL具塞三角瓶中，准确加入甲醇水（1∶1）溶液25.0 mL，振荡15 min过滤，弃去1/4初液后收集样品提取液。

浓缩饲料称取10.0 g于100 mL具塞三角瓶中，准确加入甲醇水（1∶1）50.0 mL溶液，振
荡15 min过滤，弃去1/4初液后收集滤液。

吸取10.0 mL滤液于125 mL分液
漏斗中，加入三氯甲烷20 mL，加塞轻摇3 min，静置分层，放出下层三氯甲烷层，经盛有5 g预先用三氯甲烷湿润的无水Na2SO4的快速定性滤纸过滤于100 mL蒸发皿中，再加三氯甲烷5 mL冲洗过滤，最后再用少量三氯甲烷洗涤过滤器，洗液并于蒸发皿中，65℃水浴通风挥干。

冷却后准确加入甲醇水（1∶1）10.0 mL，将蒸发皿中凝结物充分溶解后提取为样品提取液。

待全部样品液制成后，分别用A 试剂将样品提取得进行适当稀释，即成待测样液。

1.3.2 试剂的制备
将测试盒于室温放置30 min平衡，首先对酶标抗原进行稀释，配制成酶标抗原溶液，再取浓缩洗涤液3 mL进行10倍稀释待用。

1.3.3 测定方法
设定1号孔为调零孔，2～7号孔为AFB1标准液对照孔，其余为样品孔。

按照试
剂盒要求对反应板进行两次洗板后，依次加入配制好的标准溶液与待测样液各50 μL。

1号孔加入酶标抗原稀释液，其余加入酶标抗原溶液50 μL试剂，轻摇混匀，加反应盖膜后放入37℃恒温培养箱温育30 min。

取出反应板5次洗板后加入显
色剂，轻摇混匀放入恒温培养箱温育15 min显色。

取出反应板后加入终止液50
μL，摇匀后用酶标测定仪在450 nm波长处测定各孔的吸光度A值。

设横坐标为
系列标准浓度的常用对数值（LgC），纵坐标为各系列标准液吸光度A值与标准
液吸光度A0值的比值（A/A0%）绘制标准曲线，得到线性公式见式1。

由此得到相应样品的浓度C的对数值lgC，求其反对数，得到待测样品的AFB1浓度C，AFB1计算见式2。

式中，C为待测样液中AFB1含量（μg·mL-1）、V为样品提取液体积（mL）、
M为样品质量（g）、D为样品稀释倍数。

2 试验结果
AFB1的检测结果见附表。

附表 AFB1的检测结果注：*为品牌或品种替代号。

编号样品名称06-2012-05
06-2012-08 06-2012-09 06-2012-13 06-2012-14 06-2012-16 06-2012-17
06-2012-21 06-2012-24 06-2012-26 06-2012-27 06-2012-28 06-2012-29
06-2012-30 06-2012-31 06-2012-33 06-2012-35 06-2012-36 06-2012-38
06-2012-39*2仔猪后期配合料*9乳猪浓缩料*乳猪配合料*乳猪配合料*乳猪浓缩
料*小猪配合料*01仔猪浓缩料*688乳仔猪浓缩料*仔猪浓缩料*土小猪配合料*02
小猪配合料*乳猪配合料*仔猪配合料*600乳猪浓缩料*08乳猪浓缩料*仔猪浓缩料*乳猪配合料*仔猪浓缩料*乳猪浓缩料*08乳猪浓缩料检测结果/μg·kg-1 70.08
1.22 4.77 1.32 3.29 4.19 4.21 6.86
2.31 2.21 5.11
3.21
4.99 3.59 3.11 4.17
3.10 6.21
4.45 4.11允许含量/μg·kg-
1≤10≤10≤10≤10≤10≤10≤10≤10≤10≤10≤10≤10≤10≤10≤10≤10≤10≤10≤10≤10判定结果不合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合格合
格合格合格合格合格合格合格
从附表可知，06-2012-05样品的AFB1含量为70.08 μg·kg-1，按照中华人民共和国[饲料卫生标准]GB/T 13078-2001中关于仔猪配合饲料及浓缩饲料AFB1≤10 μg·kg-1g的强制标准判定，06-2012-05号样品AFB1超标，超标幅度＞700%，判定为不合格，其余19个样品（品牌）AFB1含量均＜10 μg·kg-1，判定为合格。

3 讨论
本次检测的20个品牌（品种）乳（仔）猪饲料是绵阳市畜牧兽医部门在限定时间段内从15个乡镇的饲料门市或养殖场中抽取，包括9个配合饲料和11个浓缩饲料，其中四川省绵阳市企业生产品牌有9个，其他地市品牌有11个，基本覆盖了这些乡（镇）销售、使用的仔猪饲料品牌，具有很强的代表性。

结果显示95%的样品AFB1含量符合中华人民共和国[饲料卫生标准]GB/T13078-2001对AFB1的限量要求，传统优质品牌企业生产的仔（乳）猪饲料AFB1含量
普遍很低，反映出优秀企业的品控管理良好。

同时也发现1个样品AFB1含量严
重超标，通过调查发现该企业内部品控不严，特别是近期原料价格较高，为控制成本，采购了一些本地产高水分玉米原料生产仔猪饲料，导致该批饲料产品AFB1超标。

对此辖区行政管理部门已调查处理，要求相关企业整改。

[参考文献]
【相关文献】
[1]Mishra H N,Chitrangada D.A review on biological control and metabolism of aflatoxin[J].Rev Food Sci Nutr,2003,43（3）:245-264.
[2]史莹华,姚惠霞,张伟毅,等.黄曲霉毒素对猪生长性能及内脏器官的影响[J].中国兽医学报,2011（2）:249-252.
[3]马文奎.黄曲霉毒素对猪的危害及综合防治[J].中国畜禽种业,2009（5）:67-68.
[4]张玲,陈代文,雷晓娅,等.自然霉变玉米及添加甘露寡糖对断奶仔猪肝脏结构与功能的影响[J].中国畜牧杂志,2012（11）:36-41.
[5]鲍蕾.黄曲霉毒素的生物积累及其检测技术质量控制标准体系研究[D].青岛:中国海洋大学,2009.
[6]许艳丽.产黄曲霉毒素菌株的检测方法及产毒条件的研究[D].青岛:中国海洋大学,2008.。