分子生物学(杨洋)第三章-dna的复制-the replication of dna(1)
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这种闭合形式可以使引入的核苷酸与催化性的金属离子密 切接触，从而促进催化反应
手指域还与模板区结合，使模板的磷酸二酯键骨架 在活性部位后立即产生约90度的回折。此弯曲 仅使催化位点上引物后的第一个模板碱基暴露
Fingers （手指）
模板上的弯折
Thumb（拇指）
模板
模板碱基
引物
Palm （手掌）
DNA Polymerase-thumb domain（拇指域）
Dedicated to the structure of DNA and the processes that propagate, maintain and alter it from one cell generation to the next
CHAPTER 3: The replication of DNA (DNA的复制）
2. The polymerization site:
1. (1) binds to two metal ions（Mg2+, Zn2+) that alter the chemical environment around the catalytic site and lead to the catalysis（结合2个二价金属离子，可以改变 正确碱基配对的dNTP和3’-羟基周围的化学环境）
校正作用可以纠正这种错误dna合成的校正是通过核酸酶去除不正确碱基配对的核苷酸来实mismatcheddnmpproofreadingexonuclease校正外切核酸酶dnapolymerasedna聚合酶的一部分当发生不正确的核苷酸被添加到引物链时校正外切核酸酶可将此核苷酸从引物链的3端去给了dna聚合酶第二次添加正确核苷酸的机会1dna合成缓慢或无dna合成错配的最后一个碱基对外切核酸酶活性位点重新进行dna合成无需dna脱离聚合酶即可进行校正引物模板接头从dna聚合酶活性位点滑动到外切核酸酶活性位点当聚合酶把不正确核苷酸掺入dna后dna合成速率降低引物3端与dna聚合酶活性位点的亲和力减弱错配后引物的3端与校正外切核酸酶活性位点的亲和力增加与此位点结合后错配核苷酸即被除去当不正确的碱基对被去除后正确配对的引物模板接头又滑回到dna聚合酶活性位点校正外切核酸酶极大地增加了dna合成的精确度从每添加10个核苷酸插入1个错误碱基降低到每添加10但是仍然高于细胞中观察到的实际突变概率
1.2 DNA is synthesized by extending the 3’ end of the primer (DNA通过引物3’端的延伸进行合成）
DNA合成由掺入dNTP 的-磷酸的亲核攻击 引发，导致引物3’端 延伸一个核苷酸，并
释放一个焦磷酸
1.3 Hydrolysis of pyrophosphate (PPi) is the driving force for DNA synthesis （焦磷酸水解是DNA合成的驱动力）
Not directly involved in catalysis
Interacts with the synthesized DNA （与 最新合成的DNA相互作用）
maintain correct position of the primer and the active site（维持引物及活性部 位的正确位置）
Recognition of different dNTP by monitoring the ability of incoming dNTP in forming A-T and G-C base pairs（DNA聚合 酶监视引入核苷酸形成A-T或G-C碱基对的能力，而不是检测进入 活性位点的是何种核苷酸）
每个DNA聚合酶都有其特征性的延伸能力，范围从每次结 合后时仅几个核苷酸到5000多个碱基
The rate of DNA synthesis is closely related to the polymerase processivity, because the rate-limiting step is the initial binding of polymerase to the primer-template junction （聚合酶与引物-模板接头的最初结合是限速步 骤，一旦结合后核苷酸的添加就非常迅速了）
3. The Specialization of DNA Polymerases（DNA聚合 酶的特化）
4. The Replication Fork（复制叉） 5. DNA Synthesis at the Replication Fork（复制叉上的
DNA合成） 6. Initiation of DNA Replication（复制的起始） 7. Binding and Unwinding（n（复制的终止）
仅仅依靠碱基配对的几何学和碱基间互补性的系统，无法达到细 胞内观察到的极高的DNA合成精确度（约每添加1010个碱基 对产生一个错误）
影响DNA聚合酶精确度的主要因素是碱基偶然变换成“错误”的 互变异构体（亚氨基或者烯醇）
碱基的这种变构体使不正确的碱基对可以位于催化中正确的位置。 校正作用可以纠正这种错误
Welcome to My Molecular Biology
Yang YaCngl（a杨ss洋 教授）
Huazhong University of Science and Technology
Molecular Biology of the Gene, 5/E --- Watson et al. (2004)
给了DNA聚合酶第二次添加正确核苷酸的机会
1.DNA合成缓慢或 无DNA合成
2. 错配核苷酸的去除 错配后引物的3‘端 与校正外切核酸酶 活性位点的亲和力 增加，与此位点结合后 错配核苷酸即被除去 3. 重新进行DNA合成 当不正确的碱基对 被去除后，正确配对的 引物-模板接头又滑回 到DNA聚合酶活性位点
2. The mechanism of DNA Polymerase
(Pol) （DNA聚合酶的作用机制）
2.1 DNA Pol use a single active site to catalyze DNA synthesis
（DNA聚合酶用一个活性位点催化DNA的 合成）
A single site to catalyze the addition of any of the four dNTPs （DNA聚合酶用一个活性位点来催化任意4种脱氧核苷三磷酸的添加）
2. (2) Monitors the accuracy of base-pairing for the most recently added nucleotides (检查最新加入的碱基配对的 准确性，错误配对使催化活性显著降低，使引物-模板接头 从聚合酶活性位点上脱离下来，并结合到聚合酶上的一个 独立的具有校对功能的核酸酶的活性位点上）
不正确的A-A碱基配对使引入核苷酸的-磷酸错位，极大地降低了 催化速率，导致DNA聚合酶优先添加正确配对的dNTP
Distinguishing between rNTP and dNTP by steric exclusion of rNTPs from the active site
(空间位阻阻止DNA聚合酶催化反应使用rNTP---核糖核苷三磷酸）
Part I: Chemistry and Genetics Part II: Maintenance of the Genome Part III: Expression of the Genome Part IV: Regulation Part V: Methods
Part II: Maintenance of the Genome
The first part describes the basic chemistry of DNA synthesis and the function of the DNA polymerase
1. The Chemistry of DNA Synthesis
1. 1 DNA synthesis requires deoxynucleoside triphosphates and a primer:template junction
maintain a strong association between DNA Pol and its substrate（维持DNA 聚合酶与其底物之间的紧密连接）
2.3 DNA Pol are processive enzymes（ DNA聚合酶是一种延伸酶）
DNA合成的速度主要取决于DNA聚合酶的延伸能力（催化 是快速的，每秒添加1000个核苷酸）
Processivity（延伸能力） is a characteristic of enzymes that operate on polymeric substrates（酶 处理多聚体底物的一种特性）
The processivity of DNA Pol is the average number of nucleotides added each time the enzyme binds a primer:template junction （ DNA聚合酶的延伸能力 定义为每次酶与引物-模板接头结合时所添加核苷酸的平 均数）
2. （DNA合成需要脱氧核苷三磷酸和引物模板接头）
DNA合成必须具备的两个关键底物： 1. 四种脱氧核苷三磷酸-dATP, dGTP, dCTP, dTTP 2. 2. 引物-模板接头（ primer:template junction）
退火引物
2‘-脱氧核糖核苷三磷酸 DNA的生长末端
模板链
Substrates required for DNA synthesis
高延伸性的聚合酶与一个完全非延伸性的酶相比， 其DNA合成的整体速率可高出1000倍
假设的非延伸性DNA聚合酶
延伸性DNA聚合酶
添加1个dNTP 然后释放下来
延伸性的DNA聚合酶与 模板结合一次，就能 添加很多dNTP
2.4 Exonucleases proofread newly synthesized DNA（外切核酸酶负责校正 新合成的DNA)
只有在形成正确碱基对的情况下，引物的3‘-羟基和在最佳催化位置上 的引入核苷三磷酸的-磷酸才能发生催化反应
Incorrect base pair dramatically lowers the rate of catalysis（错 误核苷酸掺入的速率是碱基配对正确时掺入速率的1/10000）
Distinguishing different dNTPs: kinetic selectivity
DNA聚合酶对核糖核苷三磷酸与脱氧核糖核苷三磷酸显示出令人惊异 的分辨能力
虽然细胞中rNTP比dNTP浓度要高10倍，但它们掺入的速率却是 dNTP的1/1000
2.2 DNA Pol resemble a hand that
grips the primer-template junction (DNA聚合酶像手掌一样握住引物-模板接头）
3. 3. Exonuclease site/proof reading site（校对功能，外切 核酸酶活性位点）
DNA Polymerase-finger domain（手指域）
Binds to the incoming dNTP, encloses the correct paired dNTP to the position for catalysis（手指域中 的几个残基可以和引入的dNTP结合，一旦形成正确的 碱基配对后，手指域即发生移动，包围住dNTP）
Fingers （手指）
Thumb（拇指）
Palm （手掌）
DNA聚合酶的3个结构域：拇指，手指，手掌
DNA Polymerase-palm domain(手掌域）
1. Contains two catalytic sites, one for addition of dNTPs and one for removal of the mispaired dNTP.
DNA合成的校正是通过核酸酶去除不正确碱基配对的核苷酸来实 现的
The mismatched dNMP is removed by proofreading exonuclease（校正外切核酸酶）, a part of the DNA polymerase（DNA聚合酶的一部分）
当发生不正确的核苷酸被添加到引物链时，校 正外切核酸酶可将此核苷酸从引物链的3‘端去 除
The revised central dogma
基
DNA repair
因
组
的
保
基
持
RNA processing
因 组
的
Translation 表 达
Outline
1. The Chemistry of DNA Synthesis(DNA合成的化学基 础）
2. The Mechanism of DNA Polymerase（DNA聚合酶的 作用机制）
手指域还与模板区结合，使模板的磷酸二酯键骨架 在活性部位后立即产生约90度的回折。此弯曲 仅使催化位点上引物后的第一个模板碱基暴露
Fingers （手指）
模板上的弯折
Thumb（拇指）
模板
模板碱基
引物
Palm （手掌）
DNA Polymerase-thumb domain（拇指域）
Dedicated to the structure of DNA and the processes that propagate, maintain and alter it from one cell generation to the next
CHAPTER 3: The replication of DNA (DNA的复制）
2. The polymerization site:
1. (1) binds to two metal ions（Mg2+, Zn2+) that alter the chemical environment around the catalytic site and lead to the catalysis（结合2个二价金属离子，可以改变 正确碱基配对的dNTP和3’-羟基周围的化学环境）
校正作用可以纠正这种错误dna合成的校正是通过核酸酶去除不正确碱基配对的核苷酸来实mismatcheddnmpproofreadingexonuclease校正外切核酸酶dnapolymerasedna聚合酶的一部分当发生不正确的核苷酸被添加到引物链时校正外切核酸酶可将此核苷酸从引物链的3端去给了dna聚合酶第二次添加正确核苷酸的机会1dna合成缓慢或无dna合成错配的最后一个碱基对外切核酸酶活性位点重新进行dna合成无需dna脱离聚合酶即可进行校正引物模板接头从dna聚合酶活性位点滑动到外切核酸酶活性位点当聚合酶把不正确核苷酸掺入dna后dna合成速率降低引物3端与dna聚合酶活性位点的亲和力减弱错配后引物的3端与校正外切核酸酶活性位点的亲和力增加与此位点结合后错配核苷酸即被除去当不正确的碱基对被去除后正确配对的引物模板接头又滑回到dna聚合酶活性位点校正外切核酸酶极大地增加了dna合成的精确度从每添加10个核苷酸插入1个错误碱基降低到每添加10但是仍然高于细胞中观察到的实际突变概率
1.2 DNA is synthesized by extending the 3’ end of the primer (DNA通过引物3’端的延伸进行合成）
DNA合成由掺入dNTP 的-磷酸的亲核攻击 引发，导致引物3’端 延伸一个核苷酸，并
释放一个焦磷酸
1.3 Hydrolysis of pyrophosphate (PPi) is the driving force for DNA synthesis （焦磷酸水解是DNA合成的驱动力）
Not directly involved in catalysis
Interacts with the synthesized DNA （与 最新合成的DNA相互作用）
maintain correct position of the primer and the active site（维持引物及活性部 位的正确位置）
Recognition of different dNTP by monitoring the ability of incoming dNTP in forming A-T and G-C base pairs（DNA聚合 酶监视引入核苷酸形成A-T或G-C碱基对的能力，而不是检测进入 活性位点的是何种核苷酸）
每个DNA聚合酶都有其特征性的延伸能力，范围从每次结 合后时仅几个核苷酸到5000多个碱基
The rate of DNA synthesis is closely related to the polymerase processivity, because the rate-limiting step is the initial binding of polymerase to the primer-template junction （聚合酶与引物-模板接头的最初结合是限速步 骤，一旦结合后核苷酸的添加就非常迅速了）
3. The Specialization of DNA Polymerases（DNA聚合 酶的特化）
4. The Replication Fork（复制叉） 5. DNA Synthesis at the Replication Fork（复制叉上的
DNA合成） 6. Initiation of DNA Replication（复制的起始） 7. Binding and Unwinding（n（复制的终止）
仅仅依靠碱基配对的几何学和碱基间互补性的系统，无法达到细 胞内观察到的极高的DNA合成精确度（约每添加1010个碱基 对产生一个错误）
影响DNA聚合酶精确度的主要因素是碱基偶然变换成“错误”的 互变异构体（亚氨基或者烯醇）
碱基的这种变构体使不正确的碱基对可以位于催化中正确的位置。 校正作用可以纠正这种错误
Welcome to My Molecular Biology
Yang YaCngl（a杨ss洋 教授）
Huazhong University of Science and Technology
Molecular Biology of the Gene, 5/E --- Watson et al. (2004)
给了DNA聚合酶第二次添加正确核苷酸的机会
1.DNA合成缓慢或 无DNA合成
2. 错配核苷酸的去除 错配后引物的3‘端 与校正外切核酸酶 活性位点的亲和力 增加，与此位点结合后 错配核苷酸即被除去 3. 重新进行DNA合成 当不正确的碱基对 被去除后，正确配对的 引物-模板接头又滑回 到DNA聚合酶活性位点
2. The mechanism of DNA Polymerase
(Pol) （DNA聚合酶的作用机制）
2.1 DNA Pol use a single active site to catalyze DNA synthesis
（DNA聚合酶用一个活性位点催化DNA的 合成）
A single site to catalyze the addition of any of the four dNTPs （DNA聚合酶用一个活性位点来催化任意4种脱氧核苷三磷酸的添加）
2. (2) Monitors the accuracy of base-pairing for the most recently added nucleotides (检查最新加入的碱基配对的 准确性，错误配对使催化活性显著降低，使引物-模板接头 从聚合酶活性位点上脱离下来，并结合到聚合酶上的一个 独立的具有校对功能的核酸酶的活性位点上）
不正确的A-A碱基配对使引入核苷酸的-磷酸错位，极大地降低了 催化速率，导致DNA聚合酶优先添加正确配对的dNTP
Distinguishing between rNTP and dNTP by steric exclusion of rNTPs from the active site
(空间位阻阻止DNA聚合酶催化反应使用rNTP---核糖核苷三磷酸）
Part I: Chemistry and Genetics Part II: Maintenance of the Genome Part III: Expression of the Genome Part IV: Regulation Part V: Methods
Part II: Maintenance of the Genome
The first part describes the basic chemistry of DNA synthesis and the function of the DNA polymerase
1. The Chemistry of DNA Synthesis
1. 1 DNA synthesis requires deoxynucleoside triphosphates and a primer:template junction
maintain a strong association between DNA Pol and its substrate（维持DNA 聚合酶与其底物之间的紧密连接）
2.3 DNA Pol are processive enzymes（ DNA聚合酶是一种延伸酶）
DNA合成的速度主要取决于DNA聚合酶的延伸能力（催化 是快速的，每秒添加1000个核苷酸）
Processivity（延伸能力） is a characteristic of enzymes that operate on polymeric substrates（酶 处理多聚体底物的一种特性）
The processivity of DNA Pol is the average number of nucleotides added each time the enzyme binds a primer:template junction （ DNA聚合酶的延伸能力 定义为每次酶与引物-模板接头结合时所添加核苷酸的平 均数）
2. （DNA合成需要脱氧核苷三磷酸和引物模板接头）
DNA合成必须具备的两个关键底物： 1. 四种脱氧核苷三磷酸-dATP, dGTP, dCTP, dTTP 2. 2. 引物-模板接头（ primer:template junction）
退火引物
2‘-脱氧核糖核苷三磷酸 DNA的生长末端
模板链
Substrates required for DNA synthesis
高延伸性的聚合酶与一个完全非延伸性的酶相比， 其DNA合成的整体速率可高出1000倍
假设的非延伸性DNA聚合酶
延伸性DNA聚合酶
添加1个dNTP 然后释放下来
延伸性的DNA聚合酶与 模板结合一次，就能 添加很多dNTP
2.4 Exonucleases proofread newly synthesized DNA（外切核酸酶负责校正 新合成的DNA)
只有在形成正确碱基对的情况下，引物的3‘-羟基和在最佳催化位置上 的引入核苷三磷酸的-磷酸才能发生催化反应
Incorrect base pair dramatically lowers the rate of catalysis（错 误核苷酸掺入的速率是碱基配对正确时掺入速率的1/10000）
Distinguishing different dNTPs: kinetic selectivity
DNA聚合酶对核糖核苷三磷酸与脱氧核糖核苷三磷酸显示出令人惊异 的分辨能力
虽然细胞中rNTP比dNTP浓度要高10倍，但它们掺入的速率却是 dNTP的1/1000
2.2 DNA Pol resemble a hand that
grips the primer-template junction (DNA聚合酶像手掌一样握住引物-模板接头）
3. 3. Exonuclease site/proof reading site（校对功能，外切 核酸酶活性位点）
DNA Polymerase-finger domain（手指域）
Binds to the incoming dNTP, encloses the correct paired dNTP to the position for catalysis（手指域中 的几个残基可以和引入的dNTP结合，一旦形成正确的 碱基配对后，手指域即发生移动，包围住dNTP）
Fingers （手指）
Thumb（拇指）
Palm （手掌）
DNA聚合酶的3个结构域：拇指，手指，手掌
DNA Polymerase-palm domain(手掌域）
1. Contains two catalytic sites, one for addition of dNTPs and one for removal of the mispaired dNTP.
DNA合成的校正是通过核酸酶去除不正确碱基配对的核苷酸来实 现的
The mismatched dNMP is removed by proofreading exonuclease（校正外切核酸酶）, a part of the DNA polymerase（DNA聚合酶的一部分）
当发生不正确的核苷酸被添加到引物链时，校 正外切核酸酶可将此核苷酸从引物链的3‘端去 除
The revised central dogma
基
DNA repair
因
组
的
保
基
持
RNA processing
因 组
的
Translation 表 达
Outline
1. The Chemistry of DNA Synthesis(DNA合成的化学基 础）
2. The Mechanism of DNA Polymerase（DNA聚合酶的 作用机制）