液相芯片技术在国内的发展现状

液相芯片技术在国内的发展现状
从20世纪90年代开始生物芯片已在全球进行应用，其最初用于基因序列分析、基因表达谱和基因突变体的检测等，主要用于基因分析，故又称为基因芯片或DNA芯片。

而随着其被广泛应用于免疫反应、受体结合等领域，出现了蛋白芯片、细胞芯片和组织芯片等[1-2]各种生物芯片。

液相芯片是在20世纪90代中期发展起来的，又被称为xMAP技术，集流式细胞技术、激光、数字信号处理系统和传统化学技术为一体的，具有新型通量大、灵活性好，灵敏度高、动力学范围广等优点[3-4]。

1原理
1.1 Luminex液相芯片的技术原理Luminex液相芯片技术是基于多种标记有不同荧光染料的聚苯乙烯微球，微球直径一般为 5.6 um，微球主要有4种：MicroPlex微球，SeroMap微球、xTAG微球和MagPlex微球。

（4种微球原理基本相同，而SeroMap微球是专门为血清学设计的，它可以减少血清中不同抗体与微球的非特异性结合。

在临床诊断中主要应用Luminex液相芯片技术用于检测肿瘤指标、细胞因子及其它一些蛋白质物质，因此主要是应用SeroMap微球进行检测。

）在液相系统中，为了区分不同的探针，每一种固定有探针的微球都有一個独特的色彩编号，或称荧光编码。

不同的颜色微球在激光作用下发出的荧光均不相同，利用这些微球可以分别标记上不同的探针分子。

检测时先后加样品和报告分子与标记微球反应，样品中的目的分子（待检测的抗原或抗体）能够与探针和报告分子特异性结合，使交联探针的微球携带上报告分子藻红蛋白，随后仪器对微球进行检测和结果分析。

Luminex检测系统采用微流技术使微球快速单列通过检测通道，并使用红色和绿色两种激光分别对单个微球上的分类荧光和报告分子上的报告荧光进行检测。

红色激光可将微球分类，从而鉴定各个不同的反应类型（即定性）；绿色激光可确定微球上结合的报告分子的数量，从而确定微球结合的目的分子的数量（定量）。

1.2液相芯片的技术优势
1.2.1高通量、高速度、操作方便分析荧光速度最高可达5000～15000个/s；可对同一样本中的多种不同目的分子同时进行实时、定性、定量分析，时间不到3 h。

其孵育时间比传统的固相检测明显缩短，而ELISA每孔仅只能对一种指标进行检测，虽有自动酶仪，一次也最多只能检测几块板。

采用液相芯片法可以提高检测速度。

同时针对Luminex系统，国内厂家已生产了配套的自动加样仪系统，基本上已实现全自动化检测。

1.2.2高灵敏度液相芯片的微球表面积大于固相表面，固定的包被抗体可达100000个。

提高了检测的灵敏度，检测范围或达3～5个数量级，最低检测浓度可达0.1 pg/mL。

1.2.3特异性强、准确性好因为是采用均相免疫检测，与异相免疫相比实验无需进行洗涤，减少了在操作过程中因洗涤带的的实验结果误差。

在检测时采用了流式激光技术，在测定时是对每个微球进行检测，防止标本中的异抗原（抗体）的干扰。

1.2.4标本用量小由于在同一个反应孔中同时检测多种指标，与其它方法相比明显减少了标本用量，非常适合稀有标本与儿童样本的检测。

2液相芯片技术的应用进展
液相芯片技术是迄今为止被美国食品药品管理局（FDA）惟一批准用于临床诊断的生物芯片技术。

到2005年全球获得FDA认证的液相芯片项目已近200个。

其全球最达的检测平台为美国Luminex公司和荷兰的QIAGEN跨国公司。

而在美国Luminex公司生产的Luminex检测系统上，目前已有国内生产的商品化试剂供应：比如上海透景公司生产的肿瘤标志物检测产品、HPV检测产品。

另外多种研究者根据研究需要自行制备探针微球交联微球，建立反应体系对各种标本进行检测。

目前液相芯片技术应用主要是用于抗原--抗体反应的液相蛋白芯片和用于核酸杂交的液相基因芯片。

在国内的应用主要涉及以下几个领域。

2.1在细胞因子检测方面的应用细胞因子是T细胞产生的一大类能在细胞间传递信息、具有免疫调节和效应功能的蛋白质或小分子多肽。

因此同时检测多种细胞因子可以全面判断机体免疫功能，在疾病的诊断、病程观察及疗效评价方面有重要意义，还能用于研究发病机制与药物作用的机理。

目前临床上常用ELISA法检测细胞因子，这种方法存在一些局限性：一个试剂盒仅能检测一种因子、检测的线性窄，高浓度标本需稀释后才能进行检测。

同时标本用量较大，不利于临床开展，常用于实验研究。

吴容等采用液相芯片法检测了过敏性紫癜患儿血浆中的IL-2、IFN-r、IL-4水平。

在HSP患儿急性期Th1类细胞因子IL-2、IFN-r水平降低，Th2类细胞因子IL-4水平增高。

陈士岭等采用Luminex液相蛋白芯片检测着床窗期子宫内膜和早孕蜕膜基质细胞的细胞因子水平，用Luminex液相蛋白芯片技术检测了从着床窗期子宫内膜到早孕蜕膜表达15种细胞因子的变化，发现其间存在着正相关、负相关或不相关的关系。

为研究胚胎着床和妊娠建立过程中细胞因子网络的复杂性提供了依据，提示它们之间可能存在的相互协同依赖或相互拮抗的关系。

邓元江[5]等采用液相芯片检测了慢性充血性心力衰竭患者血清中细胞因子TNF-α，IL-6，IL-1β及IL-10的水平，在CHF组中血清TNF-α，IL-6的含量均高于正常对照组（P＜0.05或P＜0.01），而IL-10的含量无明显变化。

王成[6]，骆玉霜[7]等分别采用液相芯片检测了青年女性胃癌组织和晚期胃癌患者的ERCC 1、TYMS、TUBB3 mRNA的水平。

ERCC1 mRNA低表达患者使用铂类药物效果明显优于ERCC1高表达者。

TUBB3 编码的β-Tubulin-Ⅲ（3型β微管蛋白）与抗微管化疗药敏感性的关系最密切。

低TUBB3表达水平的肿瘤患者接受紫杉醇类化疗的效果较好，中位生存期较长。

反之，TUBB3高表达的患者的抗微管类化疗药物疗效较差。

TYMS（thymidylate synthetase）基因编码的胸苷酸
合成酶（TS）是嘧啶核苷酸合成的限速酶，是肿瘤生长的重要因子。

低TYMS mRNA水平的肿瘤患者接受氟类化疗的效果较好，中位生存期较长。

李凯军[8]、郑璐玉[9]和王爽[10]等分别检测了泪液、痰湿体质人群和重症手足口病患儿血清中的细胞因子。

显示细胞因子与各种疾病有密切关系。

中山大学的王敏仪硕士采用液相芯片技术检测超排卵患者卵泡液中细胞因子水平。

由于细胞因子检测往往需要几种因子一起测定，同时其含量比较低级，而采用液相芯片技术检测可很好的解决这一问题，上面的研究显示液相芯片技术已成为当前检测细胞因子主流技术。

2.2在肿瘤标志物检测方面的应用肿瘤标志物（Tumor Marker）是反映肿瘤存在的化学类物质。

它们或不存在于正常成人组织而仅见于胚胎组织，或在肿瘤组织中的含量大大超过在正常组织里的含量，它们的存在或量变可以提示肿瘤的性质，借以了解肿瘤的组织发生、细胞分化、细胞功能，以帮助肿瘤的诊断、分类、预后判断以及治疗指导。

目前临床上检测肿瘤标记物主要用于肿瘤的早期诊断、治疗、监测及预后判断。

而现在常用的血清肿瘤标志物的检测主要采用放射免疫分析、ELISA及最近十几年开展起来的化学发光与时间分辨荧光技术等，但这些方法存在缺陷，①由于采用的是异相免疫测定，对实验结果存在一定的误差，②每次实验仅能检测一种肿瘤标志物。

而液相芯片的出现可以弥补这方面的缺陷。

但其与化学发光相比自动化程度有待提高。

梁惠仪，彭娟，李明[11]等采用液体芯片技术测定人体血清CEA、AFP、NSE 和tPSA，其建立的人血清CEA+AFP+tPSA+NSE的液相芯片检测方法，可在2～3 h内联合定量测定1～2 uL人血清中的CEA、AFP、NSE、tPSA水平，该方法操作簡单、快速、灵活、灵敏度高（达到pg级）、重复性好（CV<14%）、检测范围广（3～5个数量级），与采用CLIA方法所测得值的相关性良好。

在血清肿瘤标志物的检测方面还有：彭娟、陈玮、陈玮、杨洋等分别对采用液相芯片技术联合检测人血清CEA、AFP和NSE、联合测定人血清CEA、AFP和tPSA、联合测定人血清CEA、AFP和HBsAg及甲胎蛋白的液相芯片法检测等进行了方法学评价。

结果显示采用液相芯片技术在检测血清肿瘤标志物方面具有快速（2～3 h）、灵敏度好、重复性好等优点；与化学发光法相比具有良好的相关性。

和化学发光法一样成为临床检测肿瘤标志物的常规方法。

在其他肿瘤应用方面：娄加陶[12]、郑召玲[13]、刘晓燕与胡摇沁[14]、邓小梅等分别采用液相芯片技术检测了肺癌、妇科肿瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌、宫颈癌中相关的癌基因。

同时采用液相芯片技术对肿瘤用药的检测提供了支撑。

2.3在病原体检测方面的应用在病原体的检测方面国内主要采用液相芯片法检测细菌的耐药基因如王清[15]和夏成静等分别建立了采用液相芯片快速检测结核耐药基因和常见细菌大环内酯类和β-内酰胺酶类耐药基因的方法。

周林甫等采用液相芯片技术检测了隐球菌性与病毒性脑炎患者脑脊液中相关细胞因子，为临床治疗提供方向。

江苏大学朱虹硕士与广东医学院夏成静硕士分别采用液相芯片技术研究了幽门螺杆菌相关蛋白基因与临床常见细菌大环内酯类和β内酰胺酶类耐药基因。

为临床的药物治疗提供一种新的检测方法，为临床的苛养菌的药物敏感试验提供了一种新的方法。

在病毒感染的疾病方面：汪毅、刘利军、刘红艳等采用液相芯片技术分别检
测了乙肝DNA、抗体和HBV变异株，分别从蛋白质和核酸水平对乙型肝炎病毒进行了检测；而罗光成[16]等采用液相芯片技术检测了乙型肝炎患者体内的细胞因子与疾患的关系。

邓小梅、刘思瑶[17]、刘敏等采用液相芯片法对HPV病毒感染的疾病进行了相关检测，为预防宫颈癌的发生提供了一种早期诊断依据。

针对新型病毒领域，液相芯片技术的应用也有报道，如夏骏等采用液相芯片技术设计针对禽流感病毒H5N1亚型的检测方法。

随着相关研究的不断开展，在病原学方面用以前检测手段不能进行检测的领域，现在采用液相芯片技术进行检测均可取得令人较满意的结果。

2.4在基因检测方面的应用自从人类基因组工程研究以来，各种由于基因突变引起疾病越来越引起人们的注意。

而由于单个核苷酸改变引起DNA序列的多态性是人类遗传变异中最常见的一种，特别是随着生态污染的加重，这种生物突变更是成为一种常态。

因此单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）的检测已经成为一个热门的研究课题。

常用的技术手段包括：DNA分子杂交、引物延伸、等位基因特异的寡核苷酸连接反应、侧翼探针切割反应以及基于这些方法的变通技术，这些方法检测都比较繁烦，实验中的误差比较大，不能作为常规使用。

而液相芯片技术的出现，只需要在扩增的基础上，对扩增产物采用液相芯片进行分析即可，实验变得简单，易掌握、结果稳定可靠。

在国内有多人，从各个方向对此进行了研究：郑丽霞[18]等采用液相芯片技术检测了非小细胞肺癌患者的EGFR基因突变，发现采用液相芯片法相对于原先的PAGE银染显色，自动化程度显著提高，检测过程只需要约30 rain，可同步检测占90%以上的EGFR基因2种关键突变类型，灵敏度可达10个拷贝（0.1%），接近EGFR基因突变的检测极限0.05%。

王欢、俞永康[19]、刘思瑶、汪栋、孙凯、袁定芬等分别从男性不育、食管鳞癌、非小细胞癌、尖锐湿疣等方面采用液相芯片技术对相关基因突变进行了研究。

娄加陶[20]等则详细研究了液态芯片与PCR-LDR对K-ras基因分型的关系；作者通过研究发现液相芯片技术检测灵敏度为10%～20%，高于传统测序法的1%。

平均CV值<1%，表现出很好的重复性。

从100例NSCLC患者组织样本中共检出5例突变，其中3例为Glyl2Val突变，2例为Glyl2Asp突变。

而钟键等通过采用液相芯片法检测人HLA相关基因从而为肾移植术后监测提供了依据。

除了上述应用以外，液相芯片技术还可用于激素、炎症因子中医症型[21]、中枢神经系统性疾病、及自身抗体、研究酶/底物与分析蛋白表达等方面。

3结论
近年来，液相芯片技术作为一种新检测技术进展迅速。

液态芯片以其高通量、准确、快速、灵敏、特异性、多重检测、操作简便等显著性优点成为一种新型的大规模生物检测平台。

特别是Luminex系统，现在已有国产化商品试剂；同时研发、配备了自动化的加样、孵育平台，使实验更加自动化、结果更准确。

但与化学发光比，每批标本均需定标是其明显缺陷，而随着商品化试剂的开发，同时其样品处理平台的进一步完善，可以逐步改变这种状况，使其成为一种常规使用的高效、高质和廉价的实验室检测平台，具有广阔的发展及应用前景。

参考文献：
[1]Hong Chien-chong.Chang Po-hsiang.Lin Chih-chung，et al. A disposable microfluidic biochip with on-chip molecularly imprinted biosensors for optical detection of anesthetic propofol [J].Biosens Bioelectron，2010，25（09）：2058-2064.
[2]Mandon CA.Heyries KA.Blum LJ ，et al.Polyshrink based microfluidic chips and protein microarrays [J]. Biosens Bioelectron，2011，26（04）：1218-1224.
[3]Livingston AD.Campbell CJ.Wagner EK ，et al.Biochip sensors for the rapid and sensitive detection viral disease[J]. Genome Biol，2005，6（06）：112-115.
[4]Linkov F.Yurkovetsky Z.Lokshin A. Hormones as biomarkers：practical guide to utilizing Luminex technologies for biomarker research [J].Methods Mol Biol，2009，520：129-141.
[5]鄧元江，梁伟雄，陈云波，等.慢性充血性心力衰竭患者血清细胞因子TNF-α，IL-6，IL-1β及IL-10的液相芯片检测[J].广东医学，2006，，27（9）：1326-1327.
[6]王成，张成武.青年女性胃癌组织中ERCC 1、TYMS、TUBB3 mRNA的表达及意义[J].山东医药，2013，53（13）：67-68
[7]骆玉霜，格日力，沈存芳，等.晚期胃癌患者ERCC1 TUBB3 TYMS 三基因联合检测指导的DCF 方案个体化化疗的研究[J].中国肿瘤临床，2012，39（22）：1787-1791.
[8]李凯军，吴开力.液相芯片技术及其在泪液细胞因子检测中的应用.眼科学报，2010，25（1）：4-10.
[9]郑璐玉，杨玲玲，李玲孺，等.液相芯片技术检测痰湿体质人群TNF-α、IL-6、CRP 及MCP-1的表达研究[J].中国中西医结合杂志，2013 ，33 （7）：920-923.
[10]王爽，赵艳，张欣，等. 重症手足口病患儿血清细胞因子检测分析[J].北京医学，2012，34（3）：185-188.
[11]梁惠仪，彭娟，李明，等.液体芯片技术定量测定人体血清CEA、AFP、NSE和tPSA[J]，分子诊断与治疗杂志，2010，2（4）：266-271.
[12]娄加陶，薛剑，吴传勇，等.新型高通量肺癌相关基因甲基化检测方法的建立[J].中华医学捡验杂志，2010，33（6）：548-553.
[13]郑召玲，娄阁.液相芯片技术在妇科肿瘤中的应用[J].国际肿瘤学杂志，2013，40（3）：228-231.
[14]胡摇沁，石摇园，侯英勇，等.乳腺癌中PIK3CA基因突变与HER2表达及其基因扩增的关系[J].临床与实验病理学杂志，2013，29（5）：477-481.
[15]王清，丁显平，李天俊，等.液相芯片快速检测结核耐药基因方法建立[J].四川大学学报（自然科学版），2012，49（6）：1364-1368.
[16]罗光成，黄云丽，闫惠平，等.HBV相关慢加急性肝衰竭患者血清细胞因子水平与疾病预后的关系研究[J].检验医学，2014，29（1）：26-30.
[17]刘思瑶，丁显平，朱一剑，等.液相芯片技术在人乳头瘤病毒检测和分型中的应用[J].四川大学学报（自然科学版），2007，44（5）：1111-1114.
[18]郑丽霞，何臣，刘明，等.非小细胞肺癌患者外周血EGFR基因突变富集液相芯片检测方法的建立[J].中华捡验医学杂志，2012，35（11）：986-992.
[19]俞永康，官廷华，姜建青.食管鳞癌中多基因表达的层次聚类分析[J].广东医学2013，34（21）：3305-3306.
[20]娄加陶，周妍，吴传勇，等.液态芯片与PCR-LDR对K-ras基因分型初探[J].中华捡验医学杂志，2013，36（8）：704-707.
[21]时小红，徐珊.基于液相生物芯片技术的中医证型标志蛋白研究的新模式[J].国际中医药杂志，2011，33（3）：229-230.。