医学免疫学实验四 小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离及流式染色实验

T细胞表面标志及其亚群
CD3+CD4+CD8-辅助性T细胞（help T cell,Th）
CD3+CD4-CD8+细胞毒性T细胞 细胞毒性 （cytotoxic T cell,Tc or CTL）
CD4+CD25+调节性T细胞（regulatory T cell,Tr or Treg）
B细胞表面标志
胸腺功能： （1）产生T淋巴细胞 （2）产生和分泌胸腺素和激素类物质
免疫细胞分离方法
1. 根据不同免疫细胞表面标志:FACS、 MACS
2. 根据细胞理化性质 ： 1）根据细胞比重差异：自然沉降法、密度梯 度离心法、改变细胞密度法 2）根据细胞黏附特性：B细胞黏附于尼龙棉 3）根据细胞对渗透压变化的敏感度：红细胞 对低渗敏感
部分 SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体，部分 CD分子是B细胞的重要表面标志，其中以SmIg 分子 为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标。
CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和B2细胞 ， B1 细 胞 为 CD19 和 CD5 双 阳 性 ， 而 B2 细 胞 仅 为 CD19阳性，B2细胞为通常所指的B细胞。
脾
脾（spleen ）位于腹腔的左上方，是机体内最大的淋 巴器官，呈扁椭圆形，暗红色、质软而脆。
脾脏功能
脾在正常情况下，只产生淋巴细胞及单核细胞，但在病 态及大失血后可产生各种血细胞。脾主要功能是参与免 疫反应，脾内的巨噬细胞能吞噬和清除衰老的红细胞， 细菌和异物，产生淋巴细胞，及单核细胞，贮存血液。 胚胎时期可造血。脾脏在胚胎时期是一个重要的造血器 官，出生后能产生淋巴细胞和单核细胞。
MACS
磁性微珠是20世纪80年代初以高分子材料和金属离子（如Fe3O4 ）为原料聚合而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高 分子聚合体的固相微粒。
以磁性微珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体 即可制成免疫磁性微珠。
通常有二种分离方式：阳性分离和阴性分离。 基本原理及步骤：首先将抗特异细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠
显微镜下观察，如果细胞被染成蓝色，旋转显 微镜微调节钮，细胞无反光，则为死亡；而细 胞不被染色，晶莹透亮，旋转显微镜调节钮， 细胞明显反光而且有立体感，为活细胞；
计算细胞活力：计数200个细胞中活细胞的百 分率，一般活力应在95%以上。
（四）流式细胞术检测
PE-CD3 T cells
注意事项：
当脾功能亢进时可破坏大量血小板及血细胞。脾有丰富 的血窦，可储存一定量（约200毫升）的血液，在机体 剧烈运动或爬山或突然失血时，脾的平滑肌收缩，放出 储存血液以补充机体的需要。
胸腺（thymus）
胸腺为机体的重要淋巴器官。其功能与免疫紧密相关，分泌胸腺 激素及激素类物质，具内分泌机能的器官。胸腺位于胸腔胸骨后 、纵隔前上方，覆盖在心脏前上方的白色组织。通常小鼠鼠龄越 小，胸腺体积相对越大。
正确抓取小鼠并处死
颈椎脱臼处死小鼠：用拇指和食指用力往下按住 鼠头，另一只手抓住鼠尾，用力稍向后上方一拉 ，使之颈椎脱臼，造成脊髓与脑髓断离
实验步骤：
（一）取小鼠脾脏： 小鼠颈椎脱位处死，置70%乙醇溶
液中浸泡3-5min； 取其后右侧卧位，消毒左侧背腹交
界处皮肤，取脾脏并尽量将去脂肪 及筋膜组织。
➢ 计数时需要遵循一定的方向逐格进行，以免重复或遗漏，对压线 细胞采用数左不数右，数上不数下的原则
镜下有两个以上细胞组成的细胞团，按单个细胞计算，若细胞团10% 以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液
计数池
正面观
支持堤
侧面观
支持堤
计数池
1mm 支持堤
（0.1mm）
细胞计数注意事项
细胞数量明显增大时可适当加大稀释倍数。 充池要一次完成，不能产生气泡或充池不足的现象。 若每个中方格之间相差超过20个以上，要重新充池计
APC-CD19 B cells
小鼠脾脏、胸腺单个核细胞分离 及流式染色实验
实验目的
掌握基本的小鼠解剖技术 了解小鼠的脾脏胸腺等内脏器官 学会免疫细胞分离技术
基本概念
所有参与免疫应答以及与免疫应答相关的单核-巨噬细胞、 DC、各种粒细胞、红细胞、肥大淋巴细胞 细胞、干细胞。
人的红细胞密度为1.093；粒细胞密度为1.092；单个 核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为1.075-1.090
胸腺位于胸腔胸骨后、纵 隔前上方，覆盖在心脏前 上方的白色组织。通常小 鼠鼠龄越小，胸腺体积相 对越大。
小鼠脾脏位于上腹部左后 侧，体积较大，长条形态 ，属于外周免疫器官。外 周血中淋巴细胞可经再循 环驻入脾脏等外周免疫器 官的特定区域，所以富含 各类免疫细胞。
2. 混匀稀释后，取10-20ul加至盖片边缘，使悬液充满盖 片和计数板之间，注意盖片下不要有气泡，计数板中4 大方格细胞总数；
3. 计算：细胞浓度/毫升（个/ml）=平均每个大方格中细 胞数（4个大方格细胞总数÷4）×104×稀释倍数。
乘以104因为计数板中每个大格的体积为：1.0mm（长）×1.0mm （宽）×0.1mm（高）=0.1mm3 而 1ml=1000mm3
（二）制备单个核细胞悬液：
1. 将取出的脾脏置于盛有PBS缓冲液(10ml)的平皿中，然后再 置于尼龙指套中。用针芯轻轻碾磨使单个核细胞通过尼龙指 套悬浮于平皿中；
2. 吸取平皿中细胞悬液置于15ml离心管中，再取5mlPBS冲 洗培养皿后移入15ml离心管。以1500rpm离心5min。弃 去上清，轻轻弹散细胞沉淀,加红细胞裂解液ACK至2-3ml ，轻轻吹打混匀并放置3-4min，以破坏红细胞。然后加 PBS缓冲液至10ml，以1500rpm离心5min；
将荧光标记的单克隆抗体加入PBMC悬液内，使二者特异性结合， 通过流式细胞仪自动检测，既可很快得到T、B细胞及其亚群百分 率和绝对值的有关数据，又能以每秒高达5000个细胞(18×106 细 胞 /h) 的 速 度 分 离 和 收 集 无 菌 的 淋 巴 细 胞 ， 纯 度 可 达 90% ～ 99%，细胞活性亦不受影响，可用于淋巴细胞的各种免疫生物学 功能测定。
NK细胞表面标志
人类细胞表面标志主要以 CD16、CD56来 认定，临床上将CD3-CD56+CD16+淋巴 细胞认定为NK细胞。
流式细胞术(FCM)
流式细胞术(FCM)是一种对处在液流中的单个细胞或其它生物微 粒（如细菌）等进行快速定量分析和分选的技术，它将免疫荧光 与细胞生物学、流体力学、光学和电子计算机等多种学科的高新 技术结合，进行细胞和分子水平的基础理论与临床应用研究。
3. 弃去上清，加PBS缓冲液至10ml，用洗净的尼龙指套过滤 一遍，以除去不能分散的其他组织，1500rpm离心5min；
4. 弃去上清，加PBS缓冲液至10ml，吹打混匀即为小鼠脾脏 单个核细胞悬液。
注意：步骤2以后，尽量在冰上或其他低温环境下进行操作
（三）计算细胞浓度
1. 将上述细胞悬液做10倍的稀释；
上，待它与混合体系中的细胞反应后，利用磁力的作用，使与致 敏结合的细胞与其它物质分离，达到纯化、分离的目的。
密度梯度离心法
Ficoll-Hypaque密度梯度离心法：人外周血单个核细 胞(peripheral blood mononuclear cell PBMC)包 括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形状和比重与其他细 胞不同，利用密度在1.077±0.001g/L之间近于等渗的 Ficoll-Hypaque混合溶液(称为淋巴细胞分层液)作密 度梯度离心时,•各种血液成分将按密度梯度重新分布聚 集。
数。正常范围内，两次红细胞计数相差不得超过5%。 白细胞计数时，各大方格间的细胞数相差不超过10%
。
如微量吸管内壁沾有白细胞稀释液，会使红细胞破坏， 故应先做红细胞计数
稀释液要过滤，试管、计数板均清洁干燥，以免杂质、 微粒等被误认为细胞。
（四）计算细胞活力
50μl细胞悬液+ 50μl的0.2%苔盼兰溶液并混 匀；