miR-876-5p通过靶向FBXO31促进卵巢癌细胞增殖和侵袭的机制

基金项目：陕西省社会发展科技攻关项目（2013JK0830）通信作者：邵莹，E⁃mail ：***************
miR⁃876⁃5p 通过靶向FBXO31促进卵巢癌细胞增殖和
侵袭的机制
尚莹莹，邵莹，邓花娟
（西安国际医学中心医院妇科，陕西西安710010）
【摘要】目的
探究微小RNA （microRNA ，miR ）⁃876⁃5p 通过靶向F⁃box 蛋白31（FBXO31）促进卵巢癌细胞增
殖和侵袭的机制。

方法
对TCGA 数据库中，miR⁃876⁃5p 和FBXO31在卵巢癌患者中的表达特点和与预后的关系
进行分析。

通过双荧光素酶报告验证miR⁃876⁃5p 靶向FBXO31。

将卵巢癌细胞系SKOV⁃3分为4组：对照组、mimic 组、mimic+FBXO31组和FBXO31组。

通过质粒转染技术过表达miR⁃876⁃5p 和（或）FBXO31。

qPCR 和Western blot 检测RNA 或蛋白的表达水平。

分别通过CCK⁃8法、Transwell 实验检测各组的细胞生长和侵袭能力。

通过荷瘤裸鼠实验在体内验证miR⁃876⁃5p 和FBXO31对肿瘤生长的影响。

结果
在TCGA 数据库中，miR⁃876⁃5p 高表达的患
者的生存率显著低于miR⁃876⁃5p 低表达患者（P <0.05）。

卵巢癌患者FBXO31水平显著降低，卵巢癌分期的越高FBXO31水平越低，并且FBXO31高表达卵巢癌患者的生存率显著高于FBXO31低表达（P <0.05）。

miR⁃876⁃5p 直接靶向FBXO31。

过表达miR⁃876⁃5p 抑制FBXO31mRNA 和蛋白的表达水平（P <0.05），过表达FBXO31显著逆转miR⁃876⁃5p 对FBXO31的抑制作用（P <0.05）。

Mimic 组的细胞活力和细胞迁移能力显著高于对照组（P <0.05），FBXO31组的细胞活力和细胞迁移能力显著低于对照组（P <0.05），并且mimic+FBXO31组的细胞活力和细胞迁移能力显著
低于mimic 组（P <0.05）。

miR⁃876⁃5p 组荷瘤裸鼠的肿瘤体积和质量均显著高于对照组（P <0.05），miR⁃876⁃5p+FBXO31组肿瘤体积和质量显著低于miR⁃876⁃5p 组（P <0.05）。

结论miR⁃876⁃5p 具有促进卵巢癌进展的作用，而
FBXO31可能抑制卵巢癌进展。

miR⁃876⁃5p 直接靶向FBXO31，并且miR⁃876⁃5p 过表达可通过抑制FBXO31促进卵
巢癌细胞生长、侵袭，起到抑制卵巢癌生长的作用。

【关键词】卵巢癌；微小RNA ；miR⁃876⁃5p ；F⁃box 蛋白31
The mechanism of miR ⁃876⁃5p promoting ovarian cancer cell proliferation and invasion by targeting FBXO31
SHANG Ying⁃ying ，SHAO Ying ，DENG Hua⁃juan.Department of Gynecology ，Xi ′an International Medical Center Hospital ，
Xi ′an 710010，China
Corresponding author ：SHAO Ying ，E⁃mail ：***************
【Abstract 】Objective
To investigate the mechanism of microRNA （miR ）⁃876⁃5p to promote the proliferation and
invasion of ovarian cancer cells by targeting F⁃box protein 31（FBXO31）.Methods
The expression characteristics of miR⁃
876⁃5p and FBXO31in ovarian cancer patients and their relationship with prognosis were analyzed in the TCGA database.
The dual luciferase report verified that miR⁃876⁃5p targets FBXO31.The ovarian cancer cell line SKOV⁃3was divided into four groups ：control group ，mimic group ，mimic+FBXO31group and FBXO31group.MiR⁃876⁃5p and/or FBXO31were overexpressed by plasmid transfection technology.qPCR and Western blot were used to detect the expression level of RNA or
protein.The cell growth and invasion ability of each group were measured by CCK⁃8method and Transwell experiment.The effects of miR ⁃876⁃5p and FBXO31on tumor growth were verified in vivo by tumor ⁃bearing nude mice experiments.Results
In the TCGA database ，the survival rate of patients with high expression of miR⁃876⁃5p was significantly lower
than that of patients with low expression of miR⁃876⁃5p （P <0.05）.Patients with ovarian cancer had significantly lower levels
of FBXO31.The higher the stage of ovarian cancer ，the lower the FBXO31level.And the survival rate of patients with
FBXO31high expression ovarian cancer was significantly higher than that of FBXO31low expression （P <0.05）.The miR⁃
876⁃5p directly targets FBXO31.Overexpression of miR ⁃876⁃5p inhibited the expression levels of FBXO31mRNA and
·论著·
protein（P<0.05），Overexpression of FBXO31significantly reversed the inhibitory effect of miR⁃876⁃5p on FBXO31（P< 0.05）.The cell viability and cell migration ability of the mimic group were significantly higher than those of the control group （P<0.05）.The cell viability and cell migration ability of the FBXO31group were significantly lower than those of the control group（P<0.05）.And the cell viability and cell migration ability of mimic+FBXO31group were significantly lower than those of mimic group（P<0.05）.The tumor volume and mass of tumor⁃bearing nude mice in miR⁃876⁃5p group were significantly higher than those in control group（P<0.05）.The tumor volume and mass of miR⁃876⁃5p+FBXO31group were significantly lower than those of miR⁃876⁃5p group（P<0.05）.Conclusion miR⁃876⁃5p can promote the progress of ovarian cancer，and FBXO31 may inhibit the progress of ovarian cancer.miR⁃876⁃5p directly targets FBXO31，and miR⁃876⁃5p overexpression can promote the growth and invasion of ovarian cancer cells by inhibiting FBXO31，which can inhibit the growth of ovarian cancer.
【Key words】Ovarian cancer；MicroRNA；miR⁃876⁃5p；F⁃box protein31
卵巢癌是妇科恶性肿瘤女性的主要死亡原因，尽管新的诊断和治疗方法被不断应用于临床，但卵巢癌的总体预后仍然很差［1］。

TCGA是美国国家癌症研究所和基因组研究所共同建立的一个数据库，其通过高通量基因组分析技术分析了各个肿瘤患者miRNA以及基因的表达水平，是帮助寻找肿瘤发病机制的有效途径之一［2］。

F⁃box蛋白31（F⁃box protein31，FBXO31）基因位于人类
16q24.3染色体上，已被确定为是多种人类癌症中的抑癌基因，包括胃癌、食管癌等［3⁃4］。

最新有研究发现了在卵巢癌中F⁃box基因过度甲基化以及F⁃box家族蛋白缺失，这提示在卵巢癌中，FBXO31也发挥着抑癌作用［5］。

但是关于FBXO31在卵巢癌中的作用尚不清楚。

微小RNA（microRNA，miRNA）可通过碱基配对的方式特异性的与靶基因的信使RNA结合（message RNA，mRNA），从而转录后水平上调节基因的表达从而参与肿瘤的发展［6］。

miR⁃876⁃5p是一种新发现的与肿瘤相关的miRNA，研究显示miR⁃876⁃5p具有乳腺癌进展的作用［7］，也有研究显示miR⁃876⁃5p具有促癌作用［8］，并且程文等［9］的研究也发现了在膀胱尿路上皮癌中，miR⁃876⁃5p 水平显著上调。

这提示在不同肿瘤中，miR⁃876⁃5p 的作用可能不同，但是miR⁃876⁃5p在卵巢癌中的作用机制尚不清楚。

本次研究通过生物信息学分析TCGA数据库中miR⁃876⁃5p和FBXO31在卵巢奥中的表达特点或与预后的关系，并通过体外实验验证了miR⁃876⁃5p通过靶向FBXO31在卵巢癌细胞中的调控作用，现报道如下。

1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物雄性BALB/C小鼠购自西安交
通大学实验动物中心。

本次研究符合动物实验伦理规定。

1.1.2主要材料和仪器人卵巢癌细胞系SKOV⁃3购自（ATCC公司，美国）；DMEM培养基（Invitrogen 公司，美国），miR⁃876⁃5p类似物（mimic）、FBXO31过表达质粒以及阴性对照（negative control，NC）由Thermo Fisher公司（美国）设计和合成，Lipofectamine2000（Invitrogen公司），荧光素酶报告试剂盒和1000System检测仪（Promega公司，美国），细胞计数试剂盒⁃8（Cell Counting Kit⁃8，CCK⁃8）试剂盒和结晶紫染色试剂盒（Beyotime生物技术研究所，中国），Transwell小室（Becton Dickinson 公司，美国），PCR引物由Genewiz公司（中国）设计和合成，Trizol试剂（Invitrogen公司，美国），逆转录cDNA试剂盒和SYBR Green PCR Master Mix qPCR 试剂盒（Roche公司，瑞士），ABI7500PCR检测系统（Life technology公司，美国），FBXO31、GAPDH 抗体（Abcam公司，美国），PVDF膜（Bio⁃Rad公司，美国）；倒置显微镜（Olympus IX71，Tokyo，Japan），等。

1.2方法
1.2.1生物信息学分析通过工具网站GEPIA和Kaplan⁃Meier Plotter分析TCGA数据库中，miR⁃876⁃5p和FBXO31在卵巢癌患者中的表达特点和与预后的关系，对miR⁃876⁃5p和FBXO31与卵巢癌的关系进行初步分析。

1.2.2miR⁃876⁃5p靶向FBXO31位点预测和验证通过工具网站starbase（http：//starbase.sysu. /index.php）预测miR⁃876⁃5p靶向FBXO31的结合位点，然后通过双荧光素酶报告验证。

将野生型FBXO31（FBXO31⁃wt）或突变的FBXO31（FBXO31⁃mut）以及miR⁃876⁃5p mimic克隆到pMIR⁃REPORT荧光素酶载体中。

将SKOV⁃3细胞
接种在6孔板中，然后使用Lipofectamine2000用两种载体转染24h。

使用荧光素酶报告检测仪评估荧光素酶活性。

1.2.3细胞培养、分组和转染将SKOV⁃3细胞系根据参考文献在DMEM培养基中培养。

将细胞分为4组，即对照组、mimic组、mimic+FBXO31组和FBXO31组。

使用Lipofectamine2000试剂盒进行瞬时转染，其中mimic组和mimic+FBXO31组组通过转染miR⁃876⁃5p mimic质粒以过表达miR⁃876⁃5p，mimic+FBXO31组和FBXO31组转染FBXO31质粒过表达FBXO31。

在转染24h后收集细胞进行后续实验。

1.2.4qPCR检测miR⁃876⁃5p和FBXO31mRNA通过Trizol获得细胞中总RNA并检测浓度和纯度。

使用cDNA试剂盒将1μg RNA逆转录合成cDNA （42℃下60min，70℃下5min，然后4℃保存）。

使用SYBR Green PCR Master Mix进行qPCR实验（在95℃/10min，40个循环，94℃/15s，60℃/1min，60℃/1min，4℃保存）。

比较循环阈值（ΔΔCt）用于分析RNA的表达。

GAPDH和U6表达用于标准化计算FBXO31mRNA和miR⁃876⁃5p。

1.2.5Western blot检测FBXO31蛋白将细胞或组织裂解后收集总蛋白，并检测蛋白纯度和浓度。

使用10%的SDS⁃PAGE进行电泳实验分离蛋白，90V电压下进行120min。

然后使用PVDF膜转膜并在室温下用5%无脂牛奶封闭2h。

分别加FBXO31和GAPDH抗体（稀释1∶1000）室温震荡2h，后在4℃孵育过夜，加入二抗（稀释1∶5000），孵育3h。

通过Quantity One软件分析条带的灰度值并计算目标蛋白质的表达量。

1.2.6CCK⁃8检测细胞生长将2×104个细胞接种于96孔板，在培养第24h、48h和72h加入10μL CCK⁃8试剂并在37℃下培养，通过酶标仪450nm 处的光密度计算相对细胞活力。

1.2.7Transwell检测细胞侵袭能力在Transwell 小室的上室接种细胞（3×104个），在Transwell小室的底室加入DMEM完全培养基，孵育48h使上室的细胞侵入底室。

孵育后洗去未侵入的细胞，然后将入侵的细胞用20％甲醇固定并用0.2％结晶紫染色。

在倒置显微镜下计数每场侵入底室的细胞数目。

1.2.8荷瘤裸鼠实验将9只BALB/c裸鼠随机分为3组，即对照组、miR⁃876⁃5p组和miR⁃876⁃5p+FBXO31组，每组3只。

分别制备NC转染的、miR⁃876⁃5p mimic转染的和miR⁃876⁃5p+FBXO31转染的SKOV⁃3细胞系。

分别将3组细胞组制成0.2 mL的细胞悬液（6×106个），分别皮下注射到相对应组别的裸鼠中。

当对照组小鼠瘤体生长至约1000mm3时处死小鼠，取出瘤体检测肿瘤体积和质量。

然后通过qPCR检测肿瘤中miR⁃876⁃5p的水平，通过Western blot检测FBXO31蛋白的表达。

1.3统计学分析
所有实验设立3个复孔。

数据以均数±标准差（x±s）表示；统计分析使用SPSS19软件，进行单因素方差分析，两两比较使用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果
2.1miR⁃876⁃5p和FBXO31在卵巢癌患者中的表达特点和与预后的关系在TCGA数据库中，根据Kaplan⁃Meier Plotter分析结果，miR⁃876⁃5p高表达的患者的生存率显著低于miR⁃876⁃5p低表达患者（P<0.05）（图1）。

并且TCGA数据库中，GEPIA 分析结果显示卵巢癌患者FBXO31水平显著降低，卵巢癌分期的越高FBXO31水平越低，并且FBXO31高表达卵巢癌患者的生存率显著高于FBXO31低表达（P<0.05）（图2）。

2.2miR⁃876⁃5p靶向FBXO31
首先我们通过Starbase预测了miR⁃876⁃5p靶向FBXO31的结合位点（图3）。

然后通过双荧光霉素实验结果验证了同时转染miR⁃876⁃5p mimic 图1Kaplan⁃Meier Plotter分析TCGA数据库中不同miR⁃876⁃5p 水平卵巢癌患者生存曲线
050100150
生存时间（月）
Expression
low high
.
.
2
.
4
.
6
.
8
1
.
生
存
率
（
P
r
o
b
a
b
i
l
i
t
y
）
hsa⁃mir⁃876
HR=1.83（1.45⁃2.31）
logrank P=2.9e⁃07
和FBXO31⁃wt 的细胞的荧光酶素活性显著降低（P <0.05）（表1），说明miR ⁃876⁃5p 直接靶向FBXO31。

2.3
各组miR⁃876⁃5p 和FBXO31表达水平比较
Mimic 组和mimic+FBXO31组的miR⁃876⁃5p 水
平显著高于对照组（P <0.05），FBXO31组的FBXO31mRNA 和蛋白显著高于对照组（P <0.05），说明转染实验成功。

Mimic 组的FBXO31mRNA
和蛋白的水平显著低于对照作用（P <0.05），mimic+FBXO31组的FBXO31mRNA 和蛋白的水平
显著高于mimic （P <0.05），过表达FBXO31可阻断过表达miR⁃876⁃5p 对FBXO31的抑制作用（表2）。

2.4
各组细胞活力比较
在培养后48h 和72h ，mimic 组的细胞活力显
著高于对照组（P <0.05），FBXO31组的细胞活力显著低于对照组（P <0.05），并且mimic+FBXO31组的细胞活力显著低于mimic 组（P <0.05），过表达FBXO31会部分逆转miR⁃876⁃5p 对细胞生长的促
进作用（表3）。

图2GEPIA 分析TCGA 数据库中FBXO31在卵巢癌患者中的表达特点和与预后的关系
12
3456
12345
0.0
0.20.40.60.8
1.0
P e r c e n t s u r v i v a l
F value=5.95Pr （>F ）=0.00283
OV
num （T ）=426；num （N ）=88
Months
50
100
150
Stage ⅡStageⅢStageⅣ
Disease Free Survival
Low FBXO31TPM
High FBXO31TPM Logrank p=0.042HR （high ）=0.76p （HR ）=0.044n （high ）=289n （low ）=289
表1
双荧光素酶报告结果（相对荧光强度）
NC 组
Mimic 组
FBXO31⁃wt 组1.00±0.09
0.34±0.05*#FBXO31⁃mut 组1.05±0.11
0.98±0.16
注：*与NC 组比较，P <0.05；#
与FBXO31⁃mut 组比较，P <0.05
图3网站预测miR⁃876⁃5p 直接靶向FBXO31的结合
位点
表2
各组SKOV⁃3细胞中miR⁃876⁃5p 、FBXO31mRNA
和蛋白表的相对达水平比较（x±s ）
组别对照组
Mimic 组
Mimic+FBXO31组FBXO31组
miR⁃876⁃5p 1.00±0.097.05±0.69*6.73±0.72#1.07±0.11
*
FBXO31mRNA 1.00±0.07
0.32±0.05*2.54±0.25#8.42±0.71
*
FBXO31protein 1.00±0.10
0.47±0.06*1.59±0.17#3.51±0.33
*
注：*与对照组比较，P <0.05；#与mimic 组比较，P <0.05
表3
各组相对细胞活力比较（x±s ）
组别对照组Mimic 组
Mimic+FBXO31组FBXO31组
24h
100.00±2.14103.57±3.10100.95±3.4698.25±2.5448h
100.00±2.08
110.35±3.16*101.59±2.74#93.67±2.58*
72h
100.00±2.24
119.94±2.96*102.87±3.28#85.52±2.54*
注：*与对照组比较，P <0.05；#
与mimic 组比较，P <0.05
2.5
各组细胞侵袭能力比较
Mimic 组的细胞侵袭能力［（61.37±3.09）个］显
著高于对照组［（36.57±3.24）个］（P <0.05），FBXO31组的细胞侵袭能力［（18.86±3.17）个］显著低于对照组（P <0.05），并且mimic+FBXO31组的细胞侵袭能力［（37.49±3.18）个］显著低于mimic 组
（P <0.05），过表达FBXO31会部分逆转miR⁃876⁃5p 对细胞侵袭的促进作用（图4）。

2.6
各组小鼠肿瘤体积和质量比较
miR⁃876⁃5p 组荷瘤裸鼠的肿瘤体积和质量均显著高于对照组（P <0.05），miR⁃876⁃5p+FBXO31组
肿瘤体积和质量显著低于miR⁃876⁃5p 组（P <0.05）
（图5和表4）。

3讨论
卵巢癌妇科最常见的肿瘤之一，尽管许多早期卵巢癌的新生物标志物被发现，化学疗法、放射疗法、靶向疗法和免疫疗法在治疗广泛应由于卵巢癌的治疗，但由于肿瘤的转移、复发和获得性耐药，卵巢癌的5年总生存率仍然很差，调查限制超过75%的卵巢癌患者在确诊时已经处于疾病晚期，卵巢癌患者的总体5年生存率小于30%［1］。

探究卵巢癌发生、进展的分子机制，是提高早期的临床诊断，并探索卵巢癌的新治疗策略和靶标的重要手段。

近些年来，关于miRNA 在肿瘤中的作用被广泛发现，miRNA 水平的异常与卵巢癌的临床特征和恶性潜能的改变有关。

MiRNA 可通过碱基配对的方式与靶基因mRNA 的3’非翻译区相结合，从而mRNA 降解和转录抑制，转录后的水平上抑制
靶基因的表达［10］。

但是miRNA 种类繁多，从中寻找一种有意义的miRNA 难度较大，生物信息学和
人类基因组学的发展在一定程度上解决了这一问题，TCGA 数据库收录了全球30多种肿瘤的标本，并通过基因探针的方式对人类基因组转录水平进行了检测，然后通过生物信息学方法分析不同基因的表达特点［11］。

新近研究发现miR⁃876⁃5p 在胶质瘤、乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌等中均具有重要作用［12⁃14］。

为初步探究miR⁃876⁃5p 在卵巢癌中的
作用，我们通过生存分析发现高水平的miR⁃876⁃
5p 与卵巢癌患者的不良预后有关，提示在卵巢癌
中miR⁃876⁃5p 具有促癌作用。

然后我们通过体外
实验证实了过表达miR⁃876⁃5p 可促进卵巢癌细胞系SKOV⁃3的生长和侵袭，这提示了miR⁃876⁃5p 具有促进卵巢癌进展的作用。

miR876⁃5p 可通过抑制其靶基因EV71的水平参与对感染的调节［15］。

MiR⁃876可以通过靶向Hedgehog 信号的调控颅骨发育［16］。

我们分析在卵巢癌中，miR⁃876⁃5p 也通过靶向调节基因的表达调节细胞的生长和侵袭。

为进一步研究miR⁃876⁃5p 对卵巢癌的调节机制，我们通过双荧光素酶报告验证了miR⁃876⁃5p 靶向抑制FBXO31的表达，过表达FBXO31会逆转miR⁃876⁃5p 对FBXO31的抑制作用。

此外，我们也通过生物信息学分析了TCGA 数据库中FBXO31与卵巢癌的关系，结果显示GEPIA 分析结果显示卵巢癌患者FBXO31水平显著降低，卵巢癌分期的越高FBXO31水平越低，并且FBXO31高表达卵巢癌患者的生存率显著高于FBXO31低表达，提示FBXO31在卵巢癌中具有抑癌作用。

FBXO31属于F⁃box 家族，参与Skp1⁃Cullin⁃F⁃box （SCF ）泛素E3连接酶复合物的形成，从而介导泛素依赖性蛋白酶体降解途径并调节信号转导。

FBXO31在细胞周期进程、中心体稳定性和有丝分裂中发挥重要作用。

FBXO31最初被认为是候选的肿瘤抑制因子，研究发现在乳腺癌中FBXO31表达下降，并
图4
各组细胞的侵袭能力（Transwell 检测，×200） A.对照组；B.mimic 组；C.mimic+FBXO31组；D.FBXO31组
A
B C D
图5荷瘤裸鼠实验检测miR⁃876⁃5p 和FBXO31对肿瘤
生长的作用
对照组
miR⁃876⁃5p 组
miR⁃876⁃5p+FBXO31组
表4
各组小鼠肿瘤体积和质量比较（x±s ）
组别对照组
miR⁃876⁃5p group
miR⁃876⁃5p+FBXO31group
肿瘤体积（mm 3）1167.84±197.541504.43±218.32*1186.49±201.78#
肿瘤质量（mg ）647.41±89.58834.81±138.41*658.50±91.42#
注：*与对照组比较，P <0.05；#
与mimic 组比较，P <0.05
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（收稿日期：2020⁃06⁃08）
且乳腺癌细胞中FBXO31的异位表达抑制集落形成和细胞增殖，并可诱导细胞衰老和G1期细胞周期阻滞［17］。

体外实验证实了FBXO31有调节乳腺癌细胞周期和抑制增殖的作用，并且FBXO31的表达水平收到miR⁃210的靶向调控［18］。

Zhang 等［19］的研究也显示了FBXO31的表达水平收到
miR⁃17and miR⁃20a的靶向调节，从而在胃癌中发挥抑癌作用。

本次研究结果显示过表达FBXO31会抑制卵巢癌细胞系SKOV⁃3的生长和侵袭，并且阻断了miR⁃876⁃5p对细胞生长和侵袭的促进作用。

并且通过体内实验验证了过表达miR⁃876⁃5p 会促进荷瘤裸鼠模型肿瘤的生长，而过表达FBXO31会阻断miR⁃876⁃5p对肿瘤生长的促进作用，这进一步提示了miR⁃876⁃5p通过FBXO31发挥对卵巢癌的促进作用。

综上所述，miR⁃876⁃5p具有促进卵巢癌进展的作用，而FBXO31可能抑制卵巢癌进展。

miR⁃876⁃5p直接靶向FBXO31，并且miR⁃876⁃5p过表达可通过抑制FBXO31促进卵巢癌细胞生长、侵袭，起到抑制卵巢癌生长的作用。

但是关于miR⁃876⁃5p在卵巢癌中临床意义和与预后的价值值得进一步研究，并且FBXO31基因的作用机制仍需要进一步研究。