发酵工程课件第六章

操纵子是指基因组DNA分子的一个片段，这个片断 由启动子、调节基因、操纵基因和结构基因组成。 诱导型操纵子：效应物存在导致基因表达。 阻遏型操纵子：效应物存在导致基因表达的关闭。 乳糖操纵子
乳糖操纵子的诱导机制PFra bibliotekRP O
z
y
a
半乳糖苷酶
半乳糖苷渗透酶 半乳糖苷转乙酰基酶
2、酶活性的调节（细调） 一定数量的酶，通过其分子构象或分子结构的改变来调 节其催化反应的速率。酶活调节的影响因素包括：底物和产 物的性质和浓度、压力、pH、离子强度、辅助因子以及其 他酶的存在等等。特点是反应快速。 ① 酶活性的激活（activation） 前体激活：代谢途径中后面的酶促反应，可被该途径中较 前面的一个中间产物所促进。 代谢中间产物的反馈激活：代谢中间产物对该代谢途径的 前面的酶起激活作用。
如：二次生长现象。在启动序列上游有两个位点，RNA聚合酶的结合位
点和cAMP-CAP结合位点。当没有葡萄糖及cAMP浓度较高时， 形成
cAMP-CAP ，该复合物结合在启动序列后，RNA聚合酶才能与启动序列 结合，酶的合成才能开始；当葡萄糖存在时，葡萄糖降解物抑制腺苷酸
1、酶合成的调节（粗调）
环化酶的活性， 导致cAMP浓度降低，cAMP与CAP的结合受阻，CAP ② 酶合成的阻遏（repression of enzyme synthesis ）
不能被活化而无法结合至启动子，导致RNA聚合酶无法与启动序列结合，
终点产物反馈阻遏：合成代谢过程中，相关酶的合成被过 因此乳糖操纵子表达下降。 量终点产物所阻遏。 分解代谢物阻遏：可被组成酶快速利用的基质，阻遏了分 解难利用基质的酶的合成。
1、酶合成的调节（粗调） ③酶合成调节的遗传机制：操纵子学说
2、酶活性的调节（细调） ② 酶活性的抑制（inhibition）：大多是反馈抑制
A. 无分支代谢途径的调节：通常是在线形的代谢途
径中末端产物对催化第一步反应的酶活性有抑制作用。
抑制
A
Ea
B
Eb
C
Ec
D
X
2、酶活性的调节（细调）
B. 有分支代谢途径的调节：在有两种或两种以上的末 两个末端产物，不能直接抑制途径中的第一个酶Ea，而是 端产物的分支代谢途径中，调节方式较为复杂。分述如 分别抑制分支点后的Eb和Ec，造成中间产物C的积累，高 下： 浓度的C再反馈抑制Ea。
1、代谢缺陷型菌株 直线型合成途径中的营养缺陷型突变株，这类菌株不 能积累末端产物，只能积累中间产物； 在分支代谢途径中，可利用营养缺陷型来合成某种末 端产物。
2、抗代谢类似物的突变菌株 菌体通常需要各种代谢物如维生素、氨基酸等合成菌体需 要的成分，如果有与代谢物结构相似的物质（即抗代谢物） 存在，则可能产生两种结果：抗代谢物和代谢物竞争同一 个酶，使代谢物不能进一步合成菌体需要的成分；抗代谢 物代替代谢物合成生理上无活性的化合物。
酶的顺序反馈抑制 抑制
Eb
抑制
D C
Ec
E
Y
A
Ea
B
F
G
抑制
Z
途径中的第一个反应（A B）被两个不同的酶所催化，一 个酶被Y抑制，另一个酶被Z抑制。只有当Y和Z同时过量 才能完全阻止A转变为B。另两个控制点（C D），（C F），分别受Y或Z的抑制。
同工酶的反馈抑制 同工酶是能催化同一生化反应，但它们的结构稍有不同，可分别 被相应的末端产物抑制的一类酶。 抑制
第一节 发酵工程微生物的基本代谢及产物代谢
初级代谢及产物
多糖、蛋白质、核酸和氨基酸等。 对数生长期形成的产物是细胞自身生长所必需的， 称为初级代谢产物或中间代谢产物。
次级代谢及产物
抗生素、毒素、激素和色素等。 各种次级代谢产物都是在微生物生长缓慢或停止生
长时期即稳定期所产生的，来自于中间代谢产物和 初级代谢产物。
第六章 发酵机制及发酵动力学
第一节 发酵工程微生物的基本代谢及产物代谢
第二节 微生物代谢调节机制
第三节 糖代谢产物的发酵机制 第四节 氨基酸和核苷酸发酵机制 第五节 抗生素发酵机制 第六节 微生物发酵动力学
本章要求
掌握初级与次级代谢的产物 掌握微生物代谢调节的方式 掌握酶活性被抑制的方式 了解发酵产物的发酵机制及发酵动力学
二、人工控制微生物代谢的手段
（一）生物合成途径的遗传控制 代谢调节控制育种通过特定突变型的选育，达到改变代谢 通路、降低支路代谢总产物的产生或切断代谢途径及提高 细胞膜的透性，使代谢流向目的产物积累方向进行。
1、代谢缺陷型菌株 2、利用抗代谢类似物的突变积累氨基酸 3、产物降解酶缺失突变株
4、细胞膜组分的缺失突变
真核微生物细胞里，各种酶系被细胞器隔离分布，使
其代谢活动只能在特定的部位上进行，如与呼吸产能有 关的酶系集中于线粒体内膜上，DNA合成的某些酶位于 细胞核里。
（二）代谢流向的调控
微生物在不同条件下可以通过控制各代谢途径中某个酶促反应的速 率来控制代谢物的流向，从而保持机体代谢的平衡。
1、由一个关键酶控制的可逆反应
己糖激酶
6-磷酸葡萄糖
6-磷酸葡萄糖+H2O 6-磷酸葡萄糖酯酶 葡萄糖+Pi
微生物体内利用两种完全不同的酶，能十分精确地 控制正反应和逆反应。
（三）代谢速度的调控
1、酶合成的调节（粗调） 通过酶量的变化来控制代谢的速率。从本质上看，酶 合成的调节是在基因表达水平上起作用的。 ① 酶合成的诱导（induction of enzyme synthesis） 协同诱导：一种诱导剂可以同时诱导产生若干种酶的现象。 顺序诱导：一种诱导剂诱导产生的酶的反应产物可继续诱 导产生下一个酶，这种连续诱导产生一系列酶的现象称为 顺序诱导。
第三节 糖代谢产物的发酵机制
一、 厌氧发酵代谢产物发酵机制
葡萄糖在微生物细胞中进行厌氧分解时，通过EMP（糖酵 解途径）、HMP（磷酸戊糖途径）、ED （ 2-酮-3-脱氧-6-磷 酸葡萄糖酸裂解途径）及PK（磷酸酮解酶途径）和HK （磷酸
同一个酶可以通过不同的辅基（或辅酶）控制代谢物的 流向；
谷氨酸脱氢酶 + NADP+ 催化谷氨酸的合成
谷氨酸脱氢酶
+ NAD+
催化谷氨酸的分解
2、由两种酶控制的逆单向反应
在生物体代谢的关键部位的某些反应，是由两种不同的 酶来催化的。即在一个“可逆”反应中，其中一个酶催 化正反应，另一种酶则催化逆反应。 如： 葡萄糖+ATP
有的代谢产物由于相应降解酶的存在而在发酵液中不能稳定存在，因 此可通过诱变获得缺乏降解产物的酶的菌株使发酵单位提高。
4、细胞膜组分的缺失突变
以前经常提到反馈抑制和反馈阻遏，都是由于末端 产物的浓度过高引起的。利用细胞膜组分的缺失突 变使细胞膜的透性增大，可使代谢产物易于分泌到 胞外，从而达到解除末端产物抑制或阻遏的目的。
PC
OAA Mal
akg
Glu
生物素对谷氨酸合成的影响 PEP：磷酸烯醇式丙酮酸；Pyr：丙酮酸；AcCoA：乙酰辅酶A； OAA：草酰乙酸； α kg：α -酮戊二酸；Glu：谷氨酸；Mal：苹果 酸；PC：丙酮酸羧化酶
例2：溶烷棒杆菌GL-21（甘油缺陷型）生产谷氨酸
PGDH
磷酸二羟丙酮
α-磷酸甘油
（二）反馈阻遏作用的解除：实质是使调节基因或操纵基因发生 突变，使调节蛋白改变或不发生，调节蛋白不再与末端产物相结合， 或结合后的复合物不能同操纵基因结合，从而解除了末端产物对酶合 成的阻遏； （三）遗传障碍：使某酶蛋白结构基因突变，使酶蛋白缺失或酶蛋 白的活性中心改变，可以解除末端产物对途径中的第一个酶的反馈抑 制，积累中间产物； （四）使细胞膜透性增大：如利用甘油缺陷型或生物素缺陷型或 油酸缺陷型，通过控制甘油或生物素或油酸浓度以控制细胞膜的透性， 使胞内代谢产物外漏，缓解反馈抑制或阻遏作用。
（四）细胞透性的调节
细胞质膜的透性直接影响物质的吸收和 代谢产物的分泌，从而影响到细胞内代 谢的变化。
（五）能荷调节
对利用ATP的途径（合成代谢）的酶活性或形成ATP 的途径（分解代谢）的酶活性的调节。
二、微生物代谢调控机制
微生物在正常情况下，通过细胞内的自我调节，维持各个代谢途径 的相互协调，使其代谢产物既不缺少又不会过多的积累。而人类利用微 生物进行发酵则需要微生物积累较多的代谢产物，因此对微生物的代谢 必须进行人工控制。 一、积累代谢产物的有效措施 （一）反馈抑制作用的解除：实质是使代谢途径中的关键酶（别构 酶）的调节亚基的结构基因发生突变，使末端产物或其类似物不再与别 构中心结合，从而解除反馈抑制，积累末端产物；
通过诱变筛选出对抗代谢物相对应的代谢物不敏感，因此 可以解除代谢物的反馈抑制作用。
AK1和HSDH的调节亚基的结构基因突变，不能与苏氨酸的 例：黄色短杆菌抗α-氨基-β-羟基戊酸（AHV）菌株 结构类似物（AHV）结合，当然也不会同苏氨酸结合，所 能积累苏氨酸 以能解除苏氨酸对AK1和HSDH的反馈抑制，因而积累苏氨 酸。 Thr
HSDH AK1
Hse Met
Asp
AK2 AK3
Asp-P
Asa
Lys
Asp：天门冬氨酸；Asp-P：天门冬氨酰磷酸；Asa：天门冬氨酸半醛； Hse：高丝氨酸；Thr：苏氨酸；Met：甲硫氨酸；Lys：赖氨酸；AK： 天门冬氨酸激酶；HSDH：高丝氨酸脱氢酶
将诱变处理后的菌种接种到完全培养基上，生成的菌落再 以影印法分别接种到含葡萄糖培养基和以产物作为唯一碳 源的培养基上。在后一种培养基上不能生长的菌落就是缺 乏产物降解酶的变异株。 3、产物降解酶缺失突变株
累积反馈抑制
58%
40%
D A
E1
E
Y
B
C F G Z
30%
末端产物Y和Z单独过量时，各自对途径中第一个酶E1仅产 生较小的抑制作用，一种末端产物过量并不影响其他末端产 物的形成。当Y和Z同时过量，对E1产生的抑制作用则超过 各种末端产物单独过量时的抑制的总和。
超相加反馈抑制
90%
15%
D A
E1
E
Y
B
C F G Z
20%
② 酶活性调节的分子机制
主要有两种理论解释：
别构调节理论（酶分子构象的改变）
别构酶除了具有与底物结合的催化中心外，还具有与调节 剂结合的调节中心。当酶与调节剂以非共价键结合后，酶 蛋白的构象发生变化，引起催化中心改变，从而引起酶活 酶分子的化学修饰理论（酶分子结构的改变） 性的变化。 酶的共价修饰是酶蛋白在修饰酶催化下，可与某些物质发 生共价键的结合或解离，从而导致调节酶的活化或抑制， 以控制代谢的速度和方向。如糖原合成酶的磷酸化（高活 性）和去磷酸化（低活性）。
磷酯
该菌株的α -磷酸甘油脱氢酶（PGDH）缺失，因此不能 正常合成α-磷酸甘油和磷酯。影响了细胞膜结构的合成 而使得细胞膜透性增大，有利于谷氨酸在菌体外积累。
（二）微生物发酵条件的控制 当菌株确定后，环境条件合适与否是发酵成败的重 要因素，环境条件既影响微生物的生长，又影响代 谢的速度和方向及产物的形成和积累。 主要的有温度、pH、氧气含量、离子浓度等多种因 素。
生物素是丙酮酸羧化酶的辅酶，生物素在低于亚适浓度之 前，增加生物素有利于丙酮酸的羧化产生草酰乙酸，进而 例1：谷氨酸棒杆菌（生物素缺陷型）生产谷氨酸 有利于谷氨酸的合成；
生物素是催化脂肪酸生物合成的初始酶乙酰辅酶A羧化酶的 辅酶，该酶催化乙酰辅酶A羧化生成丙二酸单酰辅酶A，再 经一系列转化合成脂肪酸，而脂肪酸又是构成细胞膜磷脂 PEP Pyr AcCoA 的主要成分，因此生物素可间接地影响细胞膜的透性。
emphmptcadca和co2固定作用atca环三羧酸循环bdca环乙醛酸循环cco固定pepcogdp草酰乙酸gdpco丙酮酸苹果酸草酰乙酸conadnadhhpep羧化酶苹果酸酶苹果酸脱氢酶563氨的导入酮戊二酸还原氨基化谷氨酸氨的导入有三种方式谷氨酸合成酶途径酸脱氢酶活性极低或缺失细胞膜对谷氨酸的通透性高由天冬氨酸或丙酮酸通过氨基由天冬氨酸或丙酮酸通过氨基转移将氨基转给转移将氨基转给谷氨酸脱氢酶活性很高谷氨酸脱氢酶活性很高不被低浓度的谷氨酸抑制不被低浓度的谷氨酸抑制谷氨酸生产菌的谷氨酸生产菌的主要生化特点主要生化特点57葡萄糖6磷酸葡萄糖nadph乙酰辅酶a6磷酸果糖6磷酸葡萄糖酸5磷酸核糖3磷酸甘油醛果糖16二磷酸苹果酸丙酮酸co异柠檬酸co草酰乙酸顺乌头酸co乳酸nad柠檬酸nadp琥珀酸延胡索酸谷氨酸nadph乙醛酸乙酰辅酶acotca循环乙醛酸循环天冬氨酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶58d苏氨酸l苏氨酸酮基丁酸l异亮氨酸l苏氨酸脱氢酶反馈抑制d苏氨酸脱氢酶控制旁路代谢59谷氨酸n乙酰谷氨酸n乙酰谷氨酰磷酸n乙酰谷氨酸半醛n乙酰鸟氨酸鸟氨酸瓜氨酸精胺琥珀酸精氨酸n乙酰谷氨酸激酶arg60葡萄糖5磷酸核糖atpadpmgprpp合成酶磷酸核糖焦磷酸prpp谷氨酰胺谷氨酸hp5磷酸核糖酸pramggar合成酶甘氨酸atpadppi甘氨酰胺核苷酸gar10甲酰thfathfa甲酰甘氨酰胺核苷酸fgar磷酸核糖甘氨酰gluadpatppi咪核苷酸fgammgatpadppi5氨基咪唑核苷酸aircoair羧化酶5氨基4甲酸咪唑核苷酸cair5氨基4n琥珀基甲酰胺核苷酸cairaspatpadppimgsaicar合成酶延胡索酸腺苷酸琥珀酸裂解酶5氨基4氨甲酰咪唑核苷酸aicar5甲酰胺基咪唑4氨甲酰核苷酸faicarn10甲酰thfaimp环化脱水酶次黄嘌呤核苷酸impthfaprpp转酰胺酶gmpimpampgdpadp61imp腺苷琥珀酸sampsamp裂解酶延胡索酸ampsamp合成酶gdppigtp天冬氨酸黄嘌呤核苷磷酸xmpnadnadh鸟嘌呤核苷酸gmpgmp还原酶xmp氨化酶谷氨酰胺谷氨酸ampppiatphamp脱氨酶imp脱氢酶adpatpgdpgtpprpp谷氨酰胺praaicar谷氨酸pratp咪唑甘油磷酸组氨酸62嘌呤核苷酸的代谢调节6364葡萄糖丙酮酸乙酸草酰乙酸柠檬酸谷氨酸次级代谢产物
E3 E1
抑制
D
E
Y
A
E2
B
C
E4
F
G
抑制
Z
抑制
末端产物Y和Z单独过量，对途径中第一个酶E1无抑制作用， 只有Y和Z同时过量，才能对E1具有抑制作用。另两个控制 点的酶E2和E3分别被Y和Z所抑制。
协同反馈抑制 抑制
E2
抑制
D
E
Y
A
E1
B
C
E3
F
G
抑制
Z
末端产物Y和Z单独过量时，各自对途径中第一个酶E1仅产 生较小的抑制作用，一种末端产物过量并不影响其他末端产 物的形成。只有当Y和Z同时过量，才能对E1产生较大的抑 制作用。
第二节 代谢调节方式与机制
一、调节方式 代谢途径区域化
代谢流向的调控
代谢速度的调控 细胞透性的调节 能荷调节
酶量（粗调）
酶合成的诱导 酶合成的阻遏 酶活性的激活 酶活性的抑制
酶活（细调）
（一）代谢途径区域化
原核微生物细胞虽然没有复杂的具有膜结构的细胞器，
但也划分出不同的区域，对于某一代谢途径有关的酶系 集中在某一区域，以保证这一代谢途径酶促反应的顺利 进行，避免了其他途径的干扰；