大肠杆菌克隆载体

Cos质粒载体的优点：
◇容量大（可达45 kb），用于基因簇的克隆 ◇具有λ噬菌体的特性，形成的重组DNA分子
可进行体外包装，并能感染E.coli细胞（在
细胞内不能形成子代噬菌体颗粒，因而不能 形成噬菌斑） ◇具有质粒的特性，操作简便 ◇对重组DNA分子长度具有选择性包装 （30～45kb）
cos位点
2. λDNA作载体的优缺点和解决办法
优点：
◇λDNA进入细菌细胞容易 ◇由于λ能裂解宿主细胞，因此提取
DNA或基因表达产物都比较容易 ◇用λ噬菌体颗粒包装的DNA易于长期
保存
缺点及解决措施 ：
◇λ头部只能容纳自身DNA的78-105%，即 38～51 Kb，天然λ仅可插入2.5Kb外源DNA 片段——除去所有与λ裂解无关的基因和空白 区
是在pBR322基础上衍生出来的一 系列质粒载体
pUC质粒载体的优点:
◇具有更小的分子量和更高的拷贝数 （2.7kb, 500~700 copies/cell）
◇适用于组织化学法检测重组体，一步 实现对阳性克隆的鉴定
◇具有多克隆位点区（MCS）
Common plasmid vectors can carry up to 15kb foreign DNA
3）整合质粒： 含有整合酶编码基因和特异性整合位点序列，
克隆在整合质粒上的外源基因进入受体细胞 后，准确重组整合在染色体的特定位置上。
4）穿梭质粒 a) 分子上含有两个亲缘关系不同的复制子结构
及相应选择标记基因，因此能在两种不同种属 的受体中复制并检测。
大肠杆菌---链酶素穿梭质粒，大肠杆菌---酵 母菌穿梭质粒。
b) 克隆在穿梭质粒上的外源基因不用更换载 体直接从一个受体菌转移至另一个受体菌中复 制并遗传。
5）探针质粒 a) 设计用来筛选克隆基因的表达调控元件，如启动子，
终止子。 b) 装有定量检测表达程度的报告基因，（抗生素的抗
性基因） c) 缺少启动子，终止子，载体本身不能表达报告基因 d) 当含有启动子，终止子的DNA片段插入合适的位点，
2）可扩增性。 ▲严紧型复制质粒 (Stringent) 每个细胞复制1-5 个质粒拷贝。 ▲松弛型复制质粒 ( Relaxed) 具有高拷贝数30-50个。
3) 可转移性在天然条件下，野生型质粒通过细菌 接合作用从一个宿主细胞转移至另一个宿主细胞。
4) 选择标记的插入失活
F plasmid
质 粒 载 体 克 隆 的 一 般 步 骤
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3．质粒的分类及用途
1）克隆质粒： 用于克隆和扩增外源基因。 2） 测序质粒： a) 高拷贝复制，便于DNA片段克隆和扩增。 b) 含多酶切口的接头片段，在接头片段两端邻近
区域，设有两个不同的引物序列，重组质粒变性 后即可测序。
c) 来自T7 噬菌体的T7 启动子。必须由T7 噬菌 体来源 T7 RNA聚合酶识别起始转录。
d) 表达载体用T7 启动子必须用能产生T7 RNA 聚 合酶的受体菌株 JM109 , DE3。
问题：
4.关于穿梭质粒载体，下面哪种说法最正确（） A. 在不同的宿主中具有不同的复制机制 B. 在不同的宿主细胞中使用不同的复制起点 C. 在不同的宿主细胞中使用不同的复制酶 D. 在不同的宿主细胞中具有不同的复制速率
4. 常用的质粒载体
pBR322
Ampr
1)限制酶切 2)DNA重组
无DNA插入
Ampr Tcr
转化
Ampr Tcr
Tc
有DNA插入
Ampr Tcs 外源DNA Ampr Tcs
无菌落
筛选重组子
阳性菌落
Amp+Tc平 板
提取DNA 电泳
Amp平 板
重组DNA Ampr Tcs
筛 选 重 组 子 的 示 意 图
5）. λ噬菌体的基因组 ◇ 48514bp，线状双链DNA
◇ 线状分子两端具有12n.t的5’-端突起的可互 补的粘性末端（cohensive end，cos），该末 端称为cos位点，可被λ编码的A蛋白所识别
◇ 当λ侵入宿主细胞后，线装DNA分子借助粘 性末端连接成环状分子
λDNA
cos位点
报告基因才能表达。 e) 表达量的大小直接反应被克隆基因的表达调控元件
的强弱。
6）表达质粒 a) 在多克隆位点的上游和下游分别装有两套转
录效率较高的启动子，合适的核糖体结合点 （SD 序列），终止子结构。使得克隆在合适位 点上的任何外源基因都可在受体细胞中,高效表 达。
b) 大肠杆菌常用启动子：Lac, Tac, Trp 和来自 噬菌体强启动子 PL, PR 。它们由大肠杆菌 RNA 聚合酶识别起始.
删除非必需区，减小质粒的分子量，提高外源DNA的 装载量(一般来说，大于20kb的质粒很难导入受体细 胞)
加入遗传标记基因 在标记基因内引入具有多种限制酶识别及切割位点的
DNA序列，即多克隆位点(multiple cloning sites， MCS) 根据不同要求，插入特殊的基因表达调控序列 灭活某些质粒的编码基因
λDNA 基因结构
B2区和重组基因区是λ噬菌体进入裂解周期的 非必需区（~15kb），可将该区缺失或用外源 DNA片段取代，对噬菌体的感染和生长都不会 造成影响
Insertion vector 插入型载体
EcoRI
LA 19.9 LacZ RA 21.9
Charon 16A
Replacement or substitution vector 取代型载体
Cosmid was constructed by inserting the cos sequence of λ, which is necessary for packing phage DNA into phage protein coats, into a plasmid vector
在普通质粒载体中插入一个或两个来自λ 的cos位点DNA片段（长约200 bp）
问题
1.质粒具备下列特征，因此适合作为克隆载体，除了（） 。
A.赋予宿主细胞某种可检测的特性 B.可通过一定的纯化步骤与宿主细胞基因组分离 C.独立复制的能力 D.可复制自身DNA以及插入的外源DNA E.甲基化防止宿主的限制性内切核酸酶对其降解 2.下列对质粒特性描述中，不正确的是（）。 A. 既能以单链环状又能以双链环状的形式存在 B. 是独立于细菌染色体DNA以外的复制子 C. 没有线性的质粒DNA D. 能够自身复制。
pBR322质粒载体的优点:
◇具有较小的分子量
(经验表明,为避免在DNA纯化过程中发生链的断裂,克 隆载体的分子大小最好不要超过10kb)
◇具有两种抗生素的遗传标记基因, 易于选择 重组DNA分子 ◇具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后， 每个细胞中可累积1000～3000个拷贝
pUC系列载体
5） 不相容性 相同或相似复制子结构及特征的两种不同质粒不
能稳定地存在于同一受体细胞内，这种现象称质 粒的不相容性。 a) 两种不同质粒同时进入受体细胞，两者复制的 起始频率随机. b) 分裂前夕的拷贝数不均等，经过若干次细胞分 裂后必然导致，两种不同质粒的独占性。
2.质粒的改造、构建与使用
大肠杆菌克隆载体
主要内容
一. 质粒载体 二. λ载体 三. cos 质粒 四. 细菌人工染色体
质粒载体
1.质粒的基本特性 2.质粒的改造、构建与使用 3.质粒的分类及用途 4.常用的质粒载体
1. 质粒的基本特性
质粒是一类存在于细菌细胞中能独立于染 色体DNA而自主复制的共价,闭合,环状双 链DNA分子 (1~500 kb)
四、细菌人工染色体
Bacterial artificial chromosome ( BAC )
Derived from F plasmid, can carry inserts of about 300kb
EcoRI XbaI EcoRI
LA
Lac Bio RA
Charon 4A
λ vectors can carry DNA fragments up to 15kb
1.关于λ噬菌体，下列描述有误的是（） A.既能高效感染大肠杆菌，又能高效感染枯草杆菌 B.在成熟的λ噬菌体颗粒中，其DNA呈双链环状分子 C.改造成载体后，可携带较长的外源DNA片段 D.重组的噬菌体易于筛选和储存
◇同一种限制酶有多个识别位点，不利于外源 DNA插入——体内突变和建立新的克隆位点
◇重组的λDNA分子难于直接导入宿主细胞—— 利用体外包装成病毒颗粒，然后通过感染的方 法注入DNA
3. λ载体
头部
尾部
b 2区 重组基因 正负调控基因 裂解
ZUVGTH AWBCDEF MLKIJ
ins xis exo red gam att位点 CIII N CI Cro CII O P Q SＲ
2.限制性内切核酸酶EcoR I在野生型的λ噬菌体DNA 中有5个切点，Hind III有7个切点，BamH I有5个切
点。调整这些酶切位点的数量，主要通过（）
A.体内突变 B.完全酶切后连接 C.部分酶切 D.先用甲基化酶修饰后再酶切
三、 cos 质粒 （ cosmid ）
λ载体的容量理论上为23kb，实际有效 克隆大小为15kb，可满足一般的基因克 隆需要。但有的真核生物基因很大，可 达35～40kb甚至更大
Life cycle:
◇ lytic cycle(裂解周期） ◇ lysogenic cycle（溶源周期）
1. λ噬菌体的基本特点
3）. 噬菌斑 A. λ 噬菌体悬浮液加到大肠杆菌，和琼脂糖固体培养基，
37C° 过夜。 B. 固体平板培养基出现透明斑点（噬菌斑）.噬菌斑是
经过若干裂解周期形成宿主菌死亡区域。同体培养基限 制，透明圈外围大肠杆菌仍能生长. 4）. 一个噬菌斑中有上百万个噬菌体颗粒，均由一个 噬菌体无性繁殖所产生的，是入- 噬菌体DNA 用于分子 克隆的基本原理。
Cosmids can carry up to 45kb of insert DNA
问题：
1.cosmid是一种人工构建的载体（） A.它具有cos位点，因而可进行体外包装 B.它具有质粒DNA的复制特征 C.进入受体细胞后，可引起裂解反应 D.进入受体细胞后，可引起溶原化反应 2.cosmid质粒中，cos位点的功能是（） A.复制起点 B.限制酶切位点 C.参与包装进入病毒外壳 D.选择标记 E.用于筛选重组子
(Covalently closed circular DNA, cccDNA)
Plasmids: smaller cycles of doublestrand DNA that do not carry essential genes
1). 具有自己的复制起始位点 (Origing)(ori) 和 控制复制频率的控制基因及编码基因，形成独立 复制子 (Replico) 结构。
二 . λ载体（ Lambda vector ）
主要内容：
1. λ噬菌体的基本特点 2. λDNA作载体的优缺点和解决办法 3. λ载体
1. λ噬菌体的基本特点
1）. 是大肠杆菌温和型噬菌体 2）.大肠杆菌宿主细胞裂解释放噬菌体颗粒，
噬菌体颗粒又感染附近大肠杆菌,形成新一轮裂解周期，λ- 噬 菌体悬浮液加到大肠杆菌液体培养基，37C°培养6小时，培养 液由混浊变澄清，说明大肠杆菌完全被裂解。