DAPK2抑癌基因与机体免疫和肿瘤发生的相关性综述

*综述*
DAPK2抑癌基因与机体免疫和肿瘤发生的 相关性综述
刘晨睿1"吴勇军气李智3,张钮华1,王丹慧2,吴娟2
1.吉首大学医学院，湖南吉首416000；
2.南华大学附属湘潭医院（湘潭市第一人民医院）病理科，湖南湘潭 411100；3•中 南大学湘雅医院临床药理研究所，湖南长沙 410000 ；4•南华大学附属湘潭医院（湘潭市第一人民医院）肿瘤内科，湖南湘
潭 411100
摘要DAPK2基因与肿瘤发生相关性研究是肿瘤治疗研究热点，从基因层面对肿瘤进行控制对于攻克肿瘤难题具有重要的意
义。

目前国内外对于DAPK2和肿瘤相关性的研究还处在以实验验证为主的阶段,深入精确的理论模型还没有完全建立。

该文
从DAPK2结构与功能入手,展开讨论DAPK2基因表达与肿瘤发生的相关性以及DAPK2基因表达与胶质瘤细胞增殖、侵袭的
相关性。

通过采用多种实验手段（Transwell 实验、RNA 干扰实验、划痕愈合实验、克隆形成实验、MTT 实验、流式细胞术等），证明
DAPK2基因与机体免疫和肿瘤发生存在关联。

关键词死亡相关蛋白激酶2；DAPK2 ；甲基化；肿瘤治疗；肿瘤诊断
中图分类号 R730.231 文献标志码 A doil0.il 966/j.issn.2095-994X. 2020.06.12.63
Summary of the Relationship between DAPK2 Tumor Suppressor Gene and Body Im ­
munity and Tumorigenesis
LIU Chen —ru4Q , WU Yong-jun 1，2, LI Zhi 3, ZHANG Yu-hua 1, WANG Dan —hui 2, WU Juan 2
收稿日期：2020-11-08；修回日期：2020-11-28
作者简介:刘晨睿（1995-）,男，研究生在读，住培医师，研究方向为肿瘤内科学与表观遗传学&
通信作者：吴勇军（1971-），男，博士，主任医师，研究方向为肿瘤病理诊断及表观遗传学研究，E-34il ： *****************l.Jishou University School of Medicine, Jishou, Hunan Province, 416000 China; 2.Department of Pathology, Xiangtan Hospital of Nanhua University (Xiangtan First People's Hospital), Xiangtan, Hunan Province, 411100 China; 3.Institute of Clinical Pharmacology, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha, Hunan Province, 410000 China; 4.Department of Oncology, Xiangtan Hospital Affiliated to Nanhua University(Xiangtan First People's Hospital), Xiangtan, Hunan Province, 411100 China
Abstract The research on the correlation between DAPK2 gene and tumorigenesis is a hot spot in tumor treatment research, and the
control of tumors at the genetic level is of great significance to overcome tumor problems. At present, the research on the correlation
between DAPK2 and tumor at home and abroad is still in the stage of experimental verification, and the in-depth and accurate theo ­retical model has not been fully established. This article starts with the structure and function of DAPK2, and discusses the correlation
between DAPK2 gene expression and tumorigenesis and the correlation between DAPK2 gene expression and glioma cell proliferation and invasion. By using a variety of experimental methods (Transwell experiment, RNA interference experiment, scratch healing experi ­
ment, clone formation experiment, MTT experiment, flow cytometry, etc.), it is proved that DAPK2 gene is related to body immunity and tumorigenesis.
Key words Death-related protein kinase 2; DAPK2; Methylation; Tumor treatment; Tumor diagnosis.
肿瘤是摧毁人类健康的“杀手”，我国每年因为恶性 肿瘤而死亡、残疾的人数约为130万人,治疗恶性肿瘤的
费用也是 难以承受之重。

目前针对恶性肿瘤的特效药尚未问世，及早发现并预防恶性肿瘤对于提升我国公
疗负担具有重要意义。

肿瘤的发生
是 进式的 ， 因 与 。

线
粒体通过持续不断地“融合分裂再融合再分裂”循环，确
保细胞完成正常的分裂过程。

肿瘤细胞的产生源于细胞
分裂活动强于细胞融合活动，使得细胞内线粒体处于片 段化状态$
深入研究线粒体参与肿瘤发生发展的全过程，有助
于为针对线粒体的靶向治疗提供理论依据和实验支撑$ 线粒体分裂异常导致肿瘤发生与MAPK 信号通路激活有 关。

该文通过RNA 对DAPK2基因进行靶向沉默,探讨
DAPK2基因表达与肿瘤发生的相关性以及DAPK2基因 表达与胶质瘤细胞增殖、侵袭的相关性$
1 DAPK2结构与功能
DAPK2 (死亡相关蛋白激酶2)基因位于人体染色体 12P 11.21区，是典型的苏氨酸蛋白激酶，由钙调蛋白(CAM)
进行调节$ DAPK2基因编码蛋白分子质量为15 Kda ,能 转录成熟的mRNA 全长为2.4 Kmb $ DAPK2隶属于死亡 相关蛋白激酶家族 u=(DAPK 、DRP-1/DAPK2、Dlk/ZIPK 、
DRAK1和DRAK2)，是型的可溶性胞浆蛋白、核蛋白。

DAPK2基因是Dynein 超家族一员，在线粒体分裂体系中 起到重要作用。

DAPK2基因具有GTPase 结构域［21(Dy
namin_domain)、中间区(middle_domain)和效应结构域(Ef -
fector_domain)$ DAKP2基因在维持介导线粒体融合/分裂 动态
关
， 是 因
$
国外学者PT 经过研究发，DAPK2基因
导胚
胎发育所不可或缺的线粒体分裂活动$ Fis1(线粒体分裂 蛋白)是DAPK2的线粒体受体，其胞浆内含有“N 端结构 ”，线粒体
有“C-
” 成 ：
的 ，Fis1 通过 与
动$
DAPK2 基因 状态 胞 内 ，
在线粒体外膜的Fis1蛋白感应到线粒体发生分裂后：① Fis1自动将胞浆内含有的DAPK2基因进行收集并放置到
线粒体外膜，经过生化反应后形成寡聚体;②这些寡聚体
分 线粒体 分裂位 ， 成 环状 $
由于水解GTP 挤压线粒体膜， 环状结构的寡聚体
合最终发生断裂 产生2个相 独立的线粒体；③ DAPK2基因最终重新驻留在胞浆之内$步骤①、②、③循
环反复，形成一个持续的过程$
DAPK2基因的活性组件位于中间区(middle_domain)， 其它与线粒体分裂相关的 体对于活组件的定位
有重要作用。

研究人员可以通过抑制内源性DAPK2基因 表达可以抑制线粒体分裂并提升线粒体集合网络化程
度;通过S-亚硝基化、泛素化和磷酸化等方式调整DAPK2
基因的活性水平$研究人员通过大量实验确认DAPK2基
因与肿瘤发生存在强关联，DAPK2在常见的肿瘤组织或
者肿瘤细胞(如结肠癌、甲状腺嗜酸性细胞癌、胰腺癌和胶 质瘤等)中普遍存在过表达现象，研究人
使用基因
沉默技术降低DAPK2基因表达水平，削弱恶性细胞的侵 袭能力和增值能力，诱导恶性细胞逐步调亡［6-101$
2 DAPK2抑癌基因与机体免疫和肿瘤发生的相关性
2.1肿瘤成因概述
肿瘤是目前危害人类健康最严重的三大疾病之一$
每年全球约800万人死于恶性肿瘤，《中国肿瘤登记年 报》显示我国每年因各类肿瘤死亡病例约达270万，且其
发病率有逐年高的趋势$肿瘤发生是一个非常复杂的 生物过程，涉及到多个生物信号通路、多个步骤和多种类
基因的 参与$肿瘤活 基(ROS )生成、肿瘤能量
代谢故障、抵抗细胞凋零和组织 等都需要线粒
体的参与，肿瘤治疗 使 线粒体为靶向治疗目标
的全新策略［111$线粒体是典型的细胞器，处于复杂的动态 变化之中。

线粒体不断地动融合/分裂的循环，以最大限
度地适应并满足细胞内环境变更和细胞持续的能量需
图1 DAPK2基因甲基化率见肿瘤
Figure 1 DAPK2 gene methylati o n rate and com mon
tumors
求,研究这种动态循环过程的学科叫做线粒体动力学(&i-tochondrial_dynamics)o在稳定环境下线粒体的融合/分裂循环处于动态平衡状态，当融合/分裂循环因为外力原因被打破之后，线粒体形状会因为循环失衡发生形状上的变化，形态不同的线粒体在功能上也会呈现区别。

国内外大量研究证实［12］,线粒体分裂/融合循环被打破可以导致肿瘤、肥胖、Par9inson病症和阿尔茨海默病症(Alzheimer_disease)等多种疾病的发生。

2.2DAPK2基因表达与肿瘤发生的相关性
肿瘤细胞的线粒体分裂/融合循环处于失衡状态，一般体现为“强分裂、弱融合”的特征(分裂活动大于融活动)，失衡循环导致细胞内线粒体呈现片段化状态。

抑制肿瘤和的在于纠正线粒体分离/融合失状态，线粒体分裂抑制。

国内外研究吐⑸通过实验发现，MAPK信号通路的活可能会导致线粒体分裂为肿瘤细胞。

线粒体融/分裂循环动态平的因DAPK2基因，DAPK2基因的异常表达和肿瘤发生具有强关联。

我们可以采用慢病毒介导的shRNA干扰技术使得DAPK2因于状态，实研究［shRNA-DAPK2］对肿瘤细胞的生物学行为有怎样的影响。

实验步骤可以分为如下几步：①RNA干扰实验材料准备。

使用qPCR监测MKN-45/LCG-N23/AGS/MKN-2N/ SGC-7901/CES-1细胞株中［DAPK2-mRNA］的表达水平，选择［DAPK2-&RNA］表达水平较高的细胞株MKN-45/ BGC-823用于RNA实验。

②干扰序列筛选。

将构建好的［shRNA-DRPl］慢病毒载体注入到MKN-45细胞株和BGC-823，在qPCR内，
的KD3序列。

③比对实验。

种实验手段(划痕愈合实验、克隆形成实验、MTT实验、流式细Transwell侵袭实验等)，研究在肿瘤细胞增殖、侵、迁移、凋亡等生学为DAPK2因的作。

通过比对实验可以证明，DAPK2基因在组织或细胞中的阳性表达和肿瘤发生存在有效关联，抑制肿瘤细胞侵袭和增值可以从抑制DAPK2基因方面入手，诱导肿瘤细胞逐步凋亡。

BCG-823/MKN-45细胞株在感染［shRNA-DAPK2］慢病毒载体之后，DAPK2基因表达被沉，细胞侵袭、迁移和细胞增殖等生物学行为均受到抑，G2/M期细胞凋亡率和细胞数增高o在移植瘤模型实验中发现DAPK2基因被沉默之后移植瘤重量减轻、体积缩小。

在相关指令基因的精准控制下，可以发生程序性、自主行的死亡行为，这种控的生物学行为称作I 凋亡(apoptosis)o肿瘤细胞形成的主要原因就是正常的细胞凋亡为阻碍。

治疗肿瘤的常见策略就是通过各种技术手段诱导肿瘤细胞主动凋亡。

Cleaved_caspase_3是凋亡信号通路的重要执行者、核心凋亡效应分
凋亡早期标志，Cleaved_caspase_3是以酶原形式存在的Caspases-3的激活形式。

通过Western_blot检测发现，Cleaved_caspace_3表达明显升高的细胞其凋亡率随之明显升高，从侧面正面DAPK2基因被沉默之后，细胞凋亡率和Caspases_3存在强关联。

国内外研究者通过体内实验和体外细胞实验发现肿瘤细胞的迁移、侵袭、自噬和凋亡等生物学行为和DAPK2基因存在强关联。

通过回归临床样本检测挖掘临床病例指标、预后与DAPK2基因表达的关系，得到如下结果:①DAPK2基因在肿瘤组织中过表达，随着TNM分期基站和淋巴结转移，DAPK2基因表达阳也随之升高；②患者生存DAPK2基因阳性表达存在强的负三联系；③通过qPCR监测发现非肿瘤区域组织的［DAPK2-mRNA］表达水平远远低于肿瘤组织［DAPK2-mRNA］表达水平。

在真核细胞中存在自噬(autophagy)现象，该现象属于一种保守的细胞生物学行为o自噬因(Atg)通过生物指令控制溶酶体降解活动大部分细胞内聚物，降低细胞应急压力的同时，维持细胞内环境平衡。

肿瘤细胞通过激活自噬行为实现“废物再循环利用”，为自身生存供分的。

DAPK2因
与线粒体分裂为的，DAPK2表达被抑制后，线粒体自噬也随之受到抑制。

2.3DAPK2基因与胶质瘤细胞增殖、侵袭的相关性
胶质瘤细胞在不受控制的条件下具有强大的侵袭生长能力。

生物活细胞内循环重塑的动态平衡是由肌动蛋
维持的，动态平衡的基础是细胞信号传导控制平衡和肌动可平衡o肿瘤细胞维持强大的侵袭生长能力的“密码”就是细胞膜褶皱和细胞伪足，它们均依托肌动蛋白细胞骨架而生长。

微丝中F-action以聚合态形式呈现，G-action以游离态形式呈现，它们共同组成细胞肌动。

细胞肌动蛋白除了维持形态这一核心功能之外，在细胞凋亡、细胞迁移、细胞黏附和细胞应力维生生也发作。

国内学者［16］通过Transwell侵袭性实验发现，将胶质瘤细胞内DAPK2基因做沉默处理之后，F-action细胞褶皱和细胞伪足数量明显减少，缩小且着色强度降低，细胞整体侵袭能力明显削弱。

实验结果显示，siDRPl组细胞穿过基质胶细胞数为(88±1.2'个，对照组的穿过细胞数为(290±2.2'个(!<0.05)。

实验结果证明DAPK2基因能够提升多种肿瘤(、卵巢癌、状肿瘤、大状)的能力。

肌动蛋白细胞骨架重塑的关键因子是RHOA/ROCK 通路调节°ROCIK在细胞凋亡、氧自由基产生和盈利纤维形成（由RHOA参与介导）等生物学行为中均发挥重要作用，其中ROCK1在细胞骨架组装过程中发挥重要作用°国内学者通过免疫共沉淀实验发现,Flag条带无法在单独转染HA-DAPK2或Flag-RHOA质粒的细胞样本中被检测到；Flag条带能够在共转染HA-DAPIK2或Flag-RHOA 质粒的细胞样本中被检测到,这说明DAPK2基因和RHOA/ROCK通路之间可能存在交互作用，但是这种交互作用的详细机理还没有完全揭开。

实验 明，在使用siRNA迫使DAPK2基因表达沉默之后,ROCK1蛋白和RHOA蛋白的表达水平明显下降，胶质瘤细胞表面褶皱和细胞伪足的数量也随之下降，肿瘤细胞增殖受到明显抑制。

DAPK2基因能够提升RHOA/ROCK2通路活性水平,肌动蛋白细胞骨架重塑质细胞
能力！
3总结与展望
DAPK2基因表达水平与肿瘤发生存在强关联,通过 技术手段将DAPK2基因沉默后能够抑制肿瘤细胞的侵袭、增值和迁移，并诱发肿瘤细胞的自我凋亡，减轻肿瘤°国内DAPK2结构功能分析的i不断提高，对于各类生物学行为机制研究的深入和完善，必将为的靶向治疗提供更多的选择药物和治疗方式。

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