cenh3翻译文本

着丝粒介导法诱导产生拟南芥单倍体正常的二倍体染色体组来自父本和母本各一套，而单倍体植物则只含有父母或是母本的一套染色体。

若父母本是杂合子，由于单倍体能够在相对较短的时间内得以纯合，能够在很大程度上缩短植物育种进程1-3。

目前得到单倍体的方法主要有两种。

第一是通过培养配子体细胞从而获得父系或是母系单倍体4，但是对于一些顽固的树种或是基因型植物来说，这一方法是不可行的2,5。

第二，种间杂交是获得单倍体植物的另一个相对有效的方法。

由于种间杂交过程中，受精作用后父本或是母本一方的染色体组消失而得到单倍体的后代6-11。

染色体组消失的分子机理至今还不清楚，但是有一种假说认为，存在种间差异的亲本着丝粒与有丝分裂纺锤体之间互作的的不均等性导致染色体选择性消失12–14. 这里我们将展示单倍体拟南芥植株能够通过改造一个着丝粒蛋白即着丝粒特异性组蛋白CENH3从种子中轻松地获得。

当表达改造后CENH3蛋白的空突变体与野生型亲本杂交时，突变型亲本的染色体消失，结果得到了单倍体后代。

这些单倍体植株后通过非减数性减数分裂自发的转化成可育的二倍体，从而保证了它们在基因型上的稳定性。

通过交换父母本可以得到父系和母系单倍体，这是一般单倍体育种方法难以实现的。

不仅如此，他们通过基因组消除方法利用天然四倍体亲本得到了二倍体的杂交后代。

由于CENH3广泛存在于真核细胞中，利用该方法可以得到绝大多数植物的单倍体。

以下将介绍是怎样通过改造该着丝粒蛋白轻松获得单倍体拟南芥的。

着丝粒位于染色体，连接着纺锤体微管进而调控细胞分裂以保证基因组在上下代之间的稳定。

在表观遗传学上以They are epigenetically specified by incorporation of CENH3，(CENP-A in humans; also called HTR12 in A. thaliana15), 其中CENH3是组蛋白H3的一个变体，是被代替了原有的着丝粒核小体的H316。

该实验室分离得到了拟南芥胚胎致死空突变cenh3-1，用改造后的变体代替天然的CENH3，为试验的进行提供了必要的前提条件。

将cenh3-1 用绿色荧光蛋白标签标记融合，前文已经提到cenh3-1具有胚胎致死性，该实验室发现这是可以挽救的(Fig. 1a), The embryo-lethal phenotype of cenh3-1 can also be rescued by GFP–tailswap (Fig. 1a), a transgene in which we replaced the hypervariable amino-terminal tail domain of CENH3 with the tail of conventional H3, using the
H3.3 variant (encoded by At1g13370)。

GFP–tailswap 植物（通过转基因实现胚胎挽救的的cenh3-1突变体植物）在有丝分裂的过程中表现正常，该实验室并没有观察到非整倍体的体细胞（无数据显示）。

但是，GFP–tailswap植物却是不育的，表明，它们在减数分离的过程中出现了异常。

GFP–tailswap 植物大多数是雄性不育的（无数据显示）,虽然在花药较多的情况下，它们也可以作为花粉的供体。

当GFP–tailswap 植株作为母本与野生型父本杂交时，可育植株的比例只有野生型植物的60–70% 。

以野生型作为父本进行杂交，该实验室观察到在其F1后代中出现几种特殊的表现型。

第一，80–95%的胚珠在早期发育中流产，得到的是无活力的种子（图1）。

第二，可育的后代中原本应该含有两套染色体，分别来自二倍体的父本GFP–tailswap 转基因植株和母本cenh3-1植株。

但是该实验室发现，一半以上的植株只含有野生型亲本CENH3的染色体却消失了。

尽管这样的后代具有野生型的表现型，却是不育的。

进一步发现，以GFP–tailswap植株为母本与隐性quartet 变体亲本植株杂交同样得到不育的F1后代，其中60%的植株表现型与父本一致，并没有加入野生型亲本中的显性等位基因。

这些特异的现象表明，不育的后代丢失了GFP–tailswap母本的染色体，以致在其体细胞中的染色体条数少于正常的拟南芥二倍体（2n=10）。

通过对这些植株进行核型分析发现它们是单倍体，体细胞中只有5条染色体。

(Fig. 1b–e).
因为着丝粒控制着染色体在上下代之间的遗传，因此，我们有理由相信是进入合子细胞中的CENH3的变体GFP–tailswap植株性细胞中的染色体在分离中发生偏差后消失，结果产生了只含有来自野生型亲本的一套染色体的单倍体植株。

为了进一步验证，该实验室以GFP–tailswap植株为母本与不同的父本进行杂交组合。

结果发现后代单倍体后代中只含有野生型父本的5条染色体(Table 1 and Supplementary Fig. 2)，即父系单倍体。

表明GFP–tailswap 性细胞中的染色体消失。

(共对42 株单倍体进行核型分析)。

并且，结果表明利用着丝粒介导法产生单倍体的过程中与野生型亲本的基因型无关。

这是常规方法所难以实现的。

通过改造基因CENH3诱导单倍体并不只限制在GFP–tailswap 转基因植株。

Crossing cenh3-1 mutants complemented by GFP–CENH3 to wild-type plants also yielded haploid plants,同样得了单倍体植物，但是单倍体的获得率要比以
GFP–tailswap转基因植株作为亲本时要低很多。

(Table 1)。

当GFP–tailswap 或是GFP–CENH3植株自交时并没有得到单倍体的后代(Table 1)。

这些结果表明对于着丝粒所做的一般改造能够妨碍合子有丝分裂时染色体的分离，含有变体CENH3的染色体与野生型染色体发生了竞争，结果产生了单倍体的胚胎。

通过GFP–tailswap植株与wild-type植株的杂交可以有效地得到单倍体，其中25–45% 的后代可育(Table 1)。

除此之外，还得到二倍体杂交种和非整倍体杂交种，这些非整倍体植株均表现出拟南芥典型的发育期表型特征，染色体数目多于1017 (Table 1 and Supplementary Fig. 3)。

非整倍体可能就是GFP–tailswap与wild-type杂交过程中导致大部分种子流产的原因，因为一些具有不平衡的染色体组型的胚胎是不能生存的。

单性单倍体含有的一套染色体组可能来自母本也可能来自父本。

We also obtained haploids by crossing a chromosomes derived from GFP–tailswap, preventing genome elimination in a wild-type3GFP–tailswap cross。

拟南芥单倍体植株的在形态学特征上与二倍体相似，但是，无论是花径还是叶片长度等都比二倍体植株的小许多。

移植后，从次数组织中长出很多叶子。

单倍体一般不育。

含有一套染色体组，减数分裂时不能够进行正常的同源染色体的配对。

父系和母系单倍体在形态学上很相似（无数据显示）。

为了在作物育种中充分发挥单倍体的作用，必须加倍成可育的二倍体即双单倍体。

对拟南芥单倍体植株的进一步观察发现每个荚果里有1到2个种子。

每一个单倍体能获得50-2,500个种子，不同的亲本组合产生的种子也不一样。

绝大多数的种子看起来是正常的且能够产生可育的二倍体。

为了研究单倍体植株为什么能够产生二倍体的种子，该实验室分析了单倍体雄配子减数分裂时的染色体分离情况。

在前期I期间，5条染色体以单价体形式相互分离，而在中期则精确地联合在一起。

减数第一次分裂后期，大多数的性母细胞呈现不均等的减数分离。

这些情况下减数第二次分离时会产生非整倍体的四倍体。

只有很少一部分细胞，在减数第一次分裂后期，5个单价体移至同一极即以5:0的比例分离。

在接下来的减数第二次分裂中，姐妹染色单体平均移向两极，产生可育的配子。

这样，我们认为正是母系或是父系单倍体的这种偶然的减数分裂类型后通过自交产生双单倍体植株，这与先前的研究结果一致的[18,19]。

很少情况下，我们观察到单倍体体细
胞发生自发加倍的现象；主花序的一个侧枝，(2 out of 78 plants) 或者是一个荚果。

微管抑制剂秋水仙碱同样能诱导单倍体植株的体细胞染色体加倍，并且这样的二倍体植株的嫩枝能够产生完整的种子。

虽然单倍体拟南芥可以通过花药培养的方法产生20，自发加倍形成的二倍体往往是不育的21，并且这种方法并没有得以广泛应用。

通过改造基因CENH3可以轻易地得到单倍体并转化为二倍体，这样可以实现大量的拟南芥双单倍体的产生。

许多经济作物是多倍体22，但是对其的遗传分析却十分繁琐。

减少其倍性将有利于育种工作的进行。

所以该实验室尝试着利用着丝粒介导的方法将四倍体转变成二倍体。

拟南芥主要以二倍体的形式存在，但是四倍体也是其存在形式之一17。

该实验室将GFP–tailswap植株与自然生的四倍体Warschau-1 (Wa-1)杂交,结果多于98%的种子是败育的，有活力的后代中包括只含有Wa-1染色体的二倍体植株。

因此，利用着丝粒介导的方法将多倍体植物转化为低倍体是可能实现的。

着丝粒的这种不协调性早些时候被认定为是种间杂交时导致选择性基因组消除的原因12–14,23,24, 但是当时并没有找到人为地实现这种消除的手段。

该实验室已经建立了一套利用基因工程技术对CENH3进行改造实现基因组消除的实践基础，其中CENH3是真核细胞中发挥着丝粒功能的必要蛋白之一。

通过GFP–tailswap 和GFP–CENH3两个转基因获得单倍体的这种事实说明了通过对植物蛋白质进行相关的改造在其他植物种类中诱导单倍体是可行的。

转基因拟南芥中野生型与GFP–tailswap或是GFP–CENH3 蛋白共表达时并不能诱导单倍体（无数据显示）。

所以，目前我们的办法是依赖与将原来的CENH3一个改造后的变体。

一个cenh3突变体或是利用像RNA干扰这样的基因沉默的办法很可能是诱导或是消除一个新的植物种类CENH3基因功能的方法。

单倍体诱导株系在草类植物中已经有过报道25–27,但是他们的遗传基础是不清楚的，除了玉米中的不明确配子型（ig）28. Ig的作用可能限制于玉米，因为拟南芥中的ig变体或是AS2不能重复其在玉米中的作用29. 与常规诱导植物单倍体的方法相比，这个过程具有不可比拟的优势。

首先，没有涉及到组织培养技术，避免了基因型依赖。

第二，通过交换父母本即可以得到父系和母系单倍体两种。

第三，以cenh3变体为杂交母本，同时转入了父本的和基因组物质。

这可以加快细胞质不育系的育种进程中制造杂交种子。

第四，基因组消除是发生在同基因型
的父母本之间，除了CENH3基因改造的过程，避免了远源杂交障碍。

通过CENH3基因的改造实现基因组消除很可能发生在第一次极少数合子的有丝分裂，即当来自亲本的两套染色体装满了不同数量的CENH3蛋白。

野生型和变体CENH3基因的表达在接下来的细胞循环中应该迅速地使得每个着丝粒中这两种蛋白的数量达到均衡。

我们发现在自交植株中合子有丝分裂是正常的，因为只有在杂交型转基因植株中有发现在，GFP–tailswap 和GFP–CENH3 植株中，我们没有发现单倍体的存在。

另外，GFP–CENH3植株具有完整的野生型特征。

着丝粒DNA结合能力，着丝点组配上，或是纺锤体微观的偶联能力上的细微差别已经足够减慢改造后CENH3位于的染色体的分离，从而导致基因组消除。

植物的细胞循环的关卡一定是相当松弛的，这样才能够让野生型和突变体染色体的有区别的分离，并且保证染色体基本上分离完全的。

本试验中基因组消除的精确性机理仍不清楚。

着丝粒DNA序列和CENH3蛋白的进化均比较慢，着丝粒不同一直被认为是种间障碍的原因30.虽然我们的试验应用了标记蛋白，这表明，CENH3能够诱导杂种合子中特别的某一种染色体的丢失。

进一步的试验可能指示是否CENH3基因存在自然的变异，能作用杂种合子有丝分裂时染色体分离。