蚕豆根瘤菌耐旱耐盐碱性研究

蚕豆根瘤菌耐旱耐盐碱性研究
韩梅
【摘要】为发掘和利用青海冷凉地区蚕豆优良根瘤菌种质资源,对筛选自湟中县、乐都区、互助县的16株蚕豆根瘤菌菌株,在YMB培养液中分别添加聚乙二醇(PEG-6000)、NaCl和NaOH进行培养,测定其在不同干旱、盐分、pH水平下的光密度值(OD420nm),并将测定的各光密度值采用主成分得分法,对菌株的综合能力进行分析.结果表明:筛选自乐都区的菌株3S-1-②得分最高,耐旱、耐盐碱能力最强;其次为筛选自乐都区和湟中县的菌株3S-1-①和3-1-1-1;筛选自互助县的菌株6-3-2-2得分最低,耐旱、耐盐碱能力最差.菌株3S-1-②具有耐旱、耐盐碱性应用前景.
【期刊名称】《青海大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2019(037)004
【总页数】7页(P35-41)
【关键词】蚕豆;根瘤菌;抗旱;pH;NaCl
【作者】韩梅
【作者单位】青海大学农林科学院,青海西宁8100016
【正文语种】中文
【中图分类】S144.3
根瘤菌的适宜接种可提高作物共生固氮的效率[1]，减少氮肥的施用量，达到减施
化肥的目的，同时也能降低生态环境的污染[2]。

一种有效氮素来源方式是生物固
氮[3]，全球每年来自生物固氮的氮约为1.39～1.75亿t[4-5]，生物固氮经济效益显著[6]。

利用豆科植物的共生固氮作用，对实现农业安全生产、农产品质量安全
和生态环境安全，开创清洁生产、高效优质、生态环保及农业可持续发展具有重要的意义。

高效菌株的筛选包括选择适应特殊寄主和特殊环境条件的特异菌株,或适应多寄主
和多种环境条件的广谱菌株[7-9]。

青海蚕豆种植面积较大，年种植面积每年2.67万hm2左右，由于气候条件适宜，蚕豆产量高，品质好，种植面积逐年扩大，成为出口创汇的名优特产之一[10]。

但是蚕豆种植区，大多是干旱、半干旱区。

在干旱半干旱农作区，种植蚕豆或与他轮作，是修复干旱半干旱区生态损伤、抑制土壤退化的有效途径之一。

高寒、干旱和地力瘠薄成为制约青海省蚕豆发展的重要因素。

干旱地区蚕豆根系上根瘤有效结瘤较低，严重影响着蚕豆共生固氮效应的良好发挥。

土著根瘤菌的数量相对灌溉区较少，且结瘤能力较弱[11]。

为了选择适宜本区域土壤环境中存活蚕豆根瘤菌，选种时除考虑根瘤菌的高侵染性和高固氮能力外，还应兼顾其耐旱、耐盐碱等适应性。

本试验为了满足青海当地需求，根据蚕豆根瘤菌使用地区的土壤条件，有针对性地选择耐旱、耐盐碱等抗逆性强的菌株接种，增加其接种效果，确保根瘤菌固氮潜力的有效发挥，以充分发挥根瘤菌资源优势，促进农业的可持续发展。

1 材料与方法
1.1 材料
供试菌株采集地为青海省湟中县、乐都区、互助县，具体地点及名称见表1。

寄主均为蚕豆，蚕豆根瘤菌经过分离、纯化、镜检、16SrDNA 测序分析，获得16株
根瘤菌；采集时间为2013年7月。

表1 蚕豆菌株来源Tab.1 Source of broad bean strain编号菌株菌株采集地编号
菌株菌株采集地13-10-1-1湟中县李家山乡马营村92-4-2-1湟中县拦隆口乡班仲营村23-1-1-1湟中县李家山乡马营村104L-1-②乐都县马场乡岔沟村33S-1-①乐都区共和乡祁家堡村115-1-2-1互助县双树乡大通苑村43S-1-②乐都区共和乡祁家堡村125-5-4-2互助县双树乡大通苑村52-2-2-1湟中县拦隆口乡马营村136-6-4-1互助县西山乡东山村62-1-5-1湟中县拦隆口乡马营村146-3-2-2互助县西山乡东山村72-1-4-1湟中县拦隆口乡图巴营村156-4-2-1互助县西山乡东山村82-3-3-2湟中县拦隆口乡班仲营村166-1-4-1互助县西山乡东山村
1.2 方法
1.2.1 方案设计
(1)供试菌株耐旱性方案。

使用聚乙二醇(PEG-6000)人工模拟干旱条件，在YMB(Yeast Mannitol Broth,YMB)培养液中加入不同量的聚乙二醇(PEG-6000)(见表2)，使培养液的渗透势分别为0，-0.2，-0.4，-0.5，-0.6，-0.7，-0.8，-1.0 MPa，共8个水平,每水平设3次重复，16个菌株，384瓶，每瓶50 mL。

各处理所需聚乙二醇(PEG-6000)量(Ps)的计算公式[12]如下:
Ps=-1.18×10-2C-1.18×104C2+2.67×10-4CT+8.39×10-7C2T
式中：C为聚乙二醇(PEG-6000)的浓度(g/kg H2O)，T为温度(℃)。

表2 耐旱性试验方案Tab.2 Drought resistance test scheme处理水/LPEG-6000/g甘露醇/g酵母膏
/gK2HPO4/gMgSO4/gNaCl/g10.9090.90.450.180.0920.9111.9490.90.450.18 0.0930.9165.4390.90.450.180.09
表2(续)处理水/LPEG-6000/g甘露醇/g酵母膏
/gK2HPO4/gMgSO4/gNaCl/g40.9187.4490.90.450.180.0950.9207.1290.90.4 50.180.0960.9225.2290.90.450.180.0970.9242.0790.90.450.180.0980.9272.8 990.90.450.180.09
(2)供试菌株耐盐方案。

在YMB培养液中加入不同量的NaCl，设置NaCl 0，1%，2%，3%，4%，5%，6% 7个梯度，共7个水平,16个菌株，3次重复，336瓶，每瓶50 mL。

(3)供试菌株耐碱方案。

在YMB培养液中加入不同量的NaOH，设置设pH 7，8，9,10,11，12六个梯度，共6个水平,16个菌株，3次重复，288瓶，每瓶50 mL。

1.2.2 供试菌株的培养与指标测定
将供试菌株分别挑取1环接种于已灭菌的YMB培养液中(50 mL/瓶)，置于28 ℃条件下振荡(160 r/min)培养5 d(14 h/d)后，用1 mL无菌吸管吸取菌悬液1 mL
在无菌条件下接种于各处理中，每次吸取菌液时，将接种液振荡均匀。

将接种的培养液振荡培养7 d后，取出振荡均匀，对浊度大的菌悬液做适当稀释后，采用7230型分光光度计在420 nm下比浊。

测定其吸光值OD(光密度值)，以OD的
大小表示各干旱、盐分、pH水平下的生长繁殖状况，在测定前用相应聚乙二醇(PEG-6000)、盐分、pH的YMB培养液对仪器调零[13]。

1.3 试验数据分析方法
用Excel 2007软件进行数据处理。

2 结果与分析
2.1 供试菌株耐旱鉴定结果分析
土壤干旱条件严重地影响根瘤菌的存活。

筛选菌株在0～-1.0 MPa的模拟干旱条
件下的浊度见表3。

表3 供试菌株在模拟干旱条件下的浊度(OD420 nm)Tab.3 Turbidity of the tested strain under simulated drought conditions(OD420 nm)菌株编号不同
渗透势(MPa)的OD420 nm值0-0.2-0.4-0.5-0.6-0.7-0.8-
1.011.412b1.213bc1.424ab1.212ab1.172ab1.023a0.978b0.453a21.308b1.19
7c1.533a1.353a1.217a1.151a1.071a0.588a31.235b1.125c1.325b0.785c0.635
c0.504c0.035d0.024b41.420b1.333b1.553a1.476a1.335a1.285a1.268a0.463a 51.432b1.245bc1.425ab1.225ab1.185ab1.187a1.062a0.445a61.442b1.325b1 .012c0.658c0.524d0.432c0.022d0.012b71.352b1.223bc0.870d0.564e0.421d 0.123e0.011d0.005b81.445b1.138bc1.027c0.722d0.636c0.520b0.042d0.041 b91.597a1.513ab1.562a1.253ab0.892c0.577b0.266c0.123a
表3(续)菌株编号不同渗透势(MPa)的OD420 nm值0-0.2-0.4-0.5-0.6-0.7-0.8-1.0101.425b1.346b1.213bc0.725d0.524d0.412c0.058d0.042b111.368b1.111 c1.474ab1.056b0.710c0.614b0.093d0.256a121.411b1.212bc0.987d0.654d0. 425d0.325d0.032d0.011b131.356b1.123c0.865d0.652d0.421d0.305d0.024d 0.008d141.696a1.613a1.550a1.465a1.034b0.721b0.176c0.122a151.356b1.1 05c0.756d0.542d0.421d0.033f0.021d0.011b161.456b1.234bc0.872d0.654c0 .245e0.125e0.024d0.015b
注：同列不同小写字母表示在0.05水平差异显著；下同。

供试菌株在-0.2，-0.4，-0.5 MPa渗透势下的生长状况差异较大，但各菌株的光密度值较高。

由表3可知，在-0.6～1.0 MPa的各个水平上，除菌株3-10-1-1，3S-1-①，3S-1-②，3-1-1-1，6-6-4-1光密度值下降较慢，其余各菌株生长浊度下降程度差异较大。

菌株3-10-1-1，3S-1-①，3S-1-②，3-1-1-1在-0.8 MPa 渗透势下不但能增殖且具有相当高的光密度值，分别为1.071，0.978，1.268，1.062;在-1.0MPa渗透势下，光密度值为0.008～0.588，说明菌株在此干旱水平上仍能生长繁殖，且菌株3-10-1-1，3S-1-①，3S-1-②，3-1-1-1光密度值仍比其他菌株高。

由此可见，菌株3-10-1-1，3S-1-①，3S-1-②，3-1-1-1有较强耐旱能力。

2.2 供试菌株耐盐鉴定结果分析
筛选菌株在0～1.8%的NaCl浓度梯度下耐盐生长的浊度见表4。

在模拟盐分各水
平下，供试菌株生长状况差异较大，在0.3%～1.8%的各个水平上，除菌株3-10-1-1，3S-1-②，3-1-1-1光密度,随盐分的增加下降较慢，其余各菌株光密度值随盐分增加下降较快。

在模拟盐分0.9%水平时，各菌株光密度值下降最快的菌株为2-3-3-2，4L-1-②，5-1-2-1，下降的菌株为3-1-1-1，2-2-2-1，3-10-1-1，
3S-1-②，菌液光密度值可以更为客观地反映菌株在盐胁迫下的相对耐盐性[14]，菌液光密度值下降越快，说明耐盐性越弱；菌液光密度值下降越慢，说明耐盐性越强。

菌株3-10-1-1，3S-1-②，3-1-1-1，3S-1-①在1.2%水平下还具有较高的光密度值，菌株3-10-1-1，3S-1-①，3S-1-②，3-1-1-1光密度值差异显著，明显高于其他菌株；在1.2%水平下，最低光密度值菌株4L-1-②的下降率差异显著，耐盐性为最低。

说明光密度值较高的菌株具有较好的耐盐性。

表4 供试菌株在模拟盐分条件下的浊度(OD420 nm)Tab.4 Turbidity of the tested strain under simulated salt conditions(OD420 nm)菌株编号不同NaCl 浓度(%)的OD420 nm值
00.30.60.91.21.51.811.432b1.252a0.952a0.865a0.732a0.250a0.042b21.458b
1.254a0.943a0.807a0.792a0.285a0.095a31.425b0.321d0.215d0.078c0.025e0 .012d0.007d41.449b1.259a0.967a0.897a0.743a0.280a0.054b51.452b1.215a 0.958a0.824a0.784a0.265a0.045b
表4(续)菌株编号不同NaCl浓度(%)的OD420 nm值
00.30.60.91.21.51.861.468b0.316d0.212d0.125bc0.053e0.024d0.010d71.369 c0.652c0.512c0.324b0.210c0.041d0.020b81.515a0.528c0.096e0.062c0.167c 0.083c0.064b91.543a0.281d0.218d0.324b0.217c0.011d0.008d101.413b0.25 8d0.089e0.065c0.052e0.015d0.008d111.522a0.226d0.198d0.074c0.111d0.0 11d0.084a121.412b0.425d0.351c0.215b0.124c0.020d0.009d131.521a0.894b 0.654b0.225b0.210c0.025d0.010d141.528a0.195d0.012e0.403b0.508b0.146
b0.051b151.435b1.012a0.745b0.412b0.210c0.032d0.011c161.354c0.745b0. 425c0.320b0.252c0.025d0.008d
2.3 供试菌株耐碱鉴定结果分析
各菌株在不同pH条件下的浊度见表5。

蚕豆根瘤菌生长的pH范围非常宽，耐碱能力也很强。

16株菌株均能在pH 7～11 的范围内生长，pH 7～8时OD值最大，根瘤菌生长最强；pH超过10时，OD值逐渐减小，其生长繁殖能力急剧降低；pH达到12时，OD值降到最低。

其原因是氢离子浓度直接影响细菌的酶活性,不
利的土壤pH影响根瘤菌存活[15]。

表5 供试菌株在不同pH条件下的浊度(OD420 nm)Tab.5 Turbidity of the tested strain under different pH conditions(OD420 nm)菌株编号不同pH的OD420 nm值
78910111211.432b1.415a1.251a1.025a0.652a0.112a21.413b1.385b1.145ab 0.894b0.559ab0.215a31.512a1.425a1.210a0.912ab0.623a0.145a41.455b1.4 52a1.212a1.021a0.712a0.134a51.502a1.356b1.202a0.895b0.705a0.145a61.4 25b1.256b1.125a0.825b0.625a0.140a71.356b1.405ab1.223a0.925ab0.645a0 .142a81.456b1.445a1.264a0.921ab0.445b0.115a91.594a1.413a1.254a0.920a b0.543ab0.123a101.475b1.401ab1.158ab0.987ab0.654a0.110a111.365b1.25 4b1.025b0.848b0.568ab0.112a121.412b1.326b1.145ab0.925ab0.654a0.140
a
表5(续)菌株编号不同pH的OD420 nm值
789101112131.452b1.256b1.056b0.856b0.635a0.362a141.538a1.457a1.158 ab0.842b0.554ab0.245a151.387b1.354b1.025b0.825b0.625a0.120a161.426
b1.254b1.112ab0.845b0.562ab0.135a
2.4 耐旱、耐盐碱蚕豆根瘤菌菌株
为了更客观地进行蚕豆根瘤菌耐旱、耐盐碱评价，采用主成分得分法进行数据处理[16]，根据特征值大于1且累计贡献率大于80%的原则，前3位综合评价指标的
贡献率分别为70.21%，20.65%和9.14%，累计贡献率达100.00%。

各处理得分由表6可知，菌株3S-1-②得分最高，耐旱、耐盐碱能力最好；其次为菌株3S-1-①，3-1-1-1；菌株6-3-2-2得分最低,耐旱、耐盐碱能力最差。

表6 主成分得分Tab.6 The principal components score菌株编号主成分1主成分2主成分3总得分排名12.164 3-0.262 90.307 42.208 8221.809 0-1.167 0-0.227 30.414 783-0.478 41.271 10.070 60.863 3442.919 60.022 20.029
72.971 5 152.126 0-0.491 00.095 21.730 236-1.485 7-0.251 1-0.375 1-2.111 9157-0.672 10.433 80.776 80.538 578-0.748 50.453 10.019 4-
0.2761190.401 80.931 4-0.550 00.783 2610-0.684 11.152 2-0.133 30.334 8911-1.639 0-1.163 4-1.223 7-4.026 11612-1.040 30.242 20.184 4-0.613 71213-0.581 90.022 90.801 60.242 610140.728 00.767 8-0.687 60.808
2515-1.323 7-1.129 30.679 8-1.773 21316-1.494 8-0.832 00.232 2-2.094 614
3 讨论与结论
在聚乙二醇(PEG-6000)人工模拟干旱条件，菌株3-10-1-1，3S-1-①，3S-1-②，3-1-1-1在-1.0 MPa渗透势下仍能生长繁殖，耐旱能力强，这与黄明勇等[17]对
金沙干热河谷区土著花生根瘤菌耐旱性研究结果一致，发现两株菌株在-1.0 MPa 的渗透势水平仍能生长；在不同程度盐胁迫下，根瘤菌耐盐性表现强弱不同，菌株3-10-1-1，3S-1-①，3S-1-②，3-1-1-1在1.2%水平下还具有较高的光密度值，耐盐性强。

这可能与细菌在不同盐胁迫下体内积累亲和性溶质来保持细胞内外的渗透压平衡[18]的能力不同有关，也可能与诱导菌体耐盐相关基因[14]表达的盐浓度高低不同有关；在1.2%～1.8%盐浓度范围，菌液光密度值没有明显波动，这与豌
豆根瘤菌在1.0%～4.5% 盐浓度下光密度值变化趋势相一致[19]，说明在超过一定程度盐胁迫下根瘤菌几乎受到完全抑制而没有明显的增殖。

迟玉成等[20]对山东省不同地区的 58株花生根瘤菌进行 NaCl，干旱的耐受性试验结果一致，表明根瘤菌的耐盐耐旱能力呈现多样性，来自同一地区的根瘤菌与来自同一地区、不同品种的根廇菌耐盐耐旱能力均不同。

通过蚕豆根瘤菌生长的耐碱能力研究，16株菌株虽然在 pH 7～11 的范围内均能生长，但在pH 7～8时光密度值最大，根瘤菌繁殖能力最强。

这与姜云植等[21]分离、筛选的豌豆族根瘤菌总体在中性偏碱范围(pH 7～8)侵染、结瘤及促生作用较大相关；采用主成分得分法对菌株的综合能力进行分析得出，菌株3S-1-②得分最高，耐旱、耐盐碱能力最好；其次为菌株3S-1-①，3-1-1-1；菌株6-3-2-2得分最低，耐旱、耐盐碱能力最差。

总体来看，菌株3S-1-②具有耐旱、耐盐碱性应用前景。

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