离子对色谱法测定组氨酸的含量

离子对色谱法测定组氨酸的含量
摘要目的：建立采用高效液相色谱法测定组氨酸含量的方法。

方法：选用Copsil C18色谱柱，流动相：乙腈-阴离子型离子对试剂；流速：1.0 ml/min，
进样体积：20μl，柱温：30℃，检测波长：205nm。

结果：线性相关系数为
0.99986，定量限0.8ng，检测限0.08ng，回收率在98 %～102 %之间。

结论：方
法简便快速，结果准确可靠，可用于组氨酸的含量测定。

关键词：组氨酸，离子对色谱法，含量测定
组氨酸是组成蛋白质的基本单元，具有极其重要的生理功能。

被认为是一种人类必需的氨基酸，主要是对于儿童。

其
含量测定方法有电位滴定法、茚三酮比色法、高效液相色谱法、氨基酸分析仪等。

目前，高效液相色谱法使用最为广泛，但由于大多数氨基酸本身没有紫外吸收和荧光反应，需要对
样品进行衍生处理将其转化为有紫外吸收和荧光的物质，所
以此方法操作复杂，用时长。

因此在需要建立一种简便可行
的检测方法。

组氨酸含有咪唑基，在紫外光末端有吸收，且
属弱碱性氨基酸，可采用离子对高效液相色谱法直接测定其
含量。

本方法使用十八烷基硅烷键合硅胶填充柱为分析柱，
乙腈-阴离子型离子对试剂为流动相的离子对色谱法测定组氨酸的含量。

1 实验部分
1 主要仪器和试剂
1.1 仪器
高效液相色谱仪（Agilent 1200）、色谱柱、电子分析天平、酸度计
1.2 试剂
组氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸均为(工作标
准品,Sigma-Aldrich),腺嘌呤、胞嘧啶、胞苷均为(试剂,Sigma-Aldrich)，乙腈、磷酸为色谱纯，辛烷磺酸钠（离子对试剂，麦克林)、三乙胺（分析纯，广州化
学试剂厂)，水为超纯水
2 实验步聚
2.1 含量测定色谱条件和系统适用性试验色谱柱：十八烷基硅烷键合硅
胶(Sagix：Copsil C18，规格5 µm×4.6 mm×250mm)，流动相：称取辛烷磺酸钠2.16g，硫酸铵4.4g，加水900ml溶解，加入三乙胺2ml，用磷酸调pH至3.0，
经0.22μm水系滤膜过滤，取滤液与乙腈以90∶10（V/V）混匀。

流速为
1.0ml/min，进样体积：20 µl，柱温：30 ℃，检测波长：205 nm，运行时间：
30 min。

理论塔板数以组氨酸计算，应不低于2000。

2.2 对照品溶液（100 ng/µl）：取组氨酸对照品约10 mg，精密称定，用水
稀释并定容至100ml，摇匀，经0.45μm水系滤膜过滤。

2.3 供试品溶液：取组氨酸成品，精密称取100mg，用水溶解并定容至
100ml，摇匀；精密吸取10.0ml，用水稀释至100ml，摇匀，经0.45μm水系滤
膜过滤。

3 方法考察
3.1 专属性试验分别配制组氨酸、可能的核苷类和氨基酸类杂质溶液
（腺嘌呤、胞嘧啶、胞苷；丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸），进
行保留时间定位，再配制一份含上述物质的混合溶液，按组氨酸含量测定方法进
行测定，计算组氨酸与前后各组分的分离度，进行专属性试验，结果表明，该方
法中组氨酸（保留时间约6.4min）与相邻组分的分离度均＞1.5。

该方法专属性良好。

在此色谱条件下，对照品、样品、杂质的色谱图。

见图1
图1
3.2 检测限、定量限
配制一系列不同浓度的组氨酸标准溶液，按组氨酸含量测定方法进行测定，以信噪比约3倍时的浓度确定方法的检测限，以信噪比为约10倍时的浓度确定方法的定量限。

当组氨酸浓度为0.004ng/μl时其色谱峰信噪比S/N=3，即检测限为0.08ng。

当组氨酸浓度为0.04ng/μl时其色谱峰信噪比S/N=10，即定量限为0.8ng。

3.3 线性与范围
精密称取组氨酸对照品，配制成1000ng/μl贮备液，再吸取适量的贮备液稀释成以下浓度：LOQ、10ng/μl、50ng/μl、80ng/μl、100ng/μl、
120ng/μl、150ng/μl，按组氨酸含量测定方法进行测定，记录色谱图峰面积，以浓度对峰面积绘制标准曲线。

得线性回归方程为：y=38.40846x-
3.07344 r2=0.99986（见图2）结果表明组氨酸浓度LOQ、10ng/µl -
150ng/µl 范围内与峰面积呈现良好的线性关系。

见图2
图2
3.4 重复性试验
取一批组氨酸成品，平行配制6份供试品溶液溶液，进行含量测定，得平均
含量为99.7%，RSD%(n=6)为0.10%，方法重复性良好。

3.5 准确度试验
取组氨酸对照品，按100%含量测定浓度（约100ng/µl）平行配制6份溶液，按组氨酸含量测定方法进行测定，记录色谱图峰面积；按外标法以峰面积计算。

组氨酸的样品回收率均在98.0-102.0%范围内，平均回收率为99.96%，回收率RSD%(n=6) =0.20%。

表1 准确度
编号实测浓度
（ng/µl）
(250ng/µl)
回收
率(%)
平均值
（%）
RSD
（%）
准确度-1100.4471100.0
17
99.960.20
准确度-2100.8746100.0
94
准确度-3100.6598100.2
29
准确度-4100.176399.70
8
准确度-5100.383399.75
5
准确度-6100.624599.98
5
3.6 耐用性试验
取重复性项下的同批次的组氨酸成品，分别改变流动相中的乙腈比例（8%和12%）、改变流速（0.9ml/min和1.1ml/min）、改变流动相pH
（pH=2.8和pH=3.2）、改变柱温（25℃和35℃）的条件下进行含量检测，组氨酸保留时间一致，含量结果符合要求。

2 结论
2.1 通过本次试验得出，组氨酸与相邻组分的分离度符合专属性要求，组氨酸浓度与峰面积呈线性关系，其线性方程可作为定量依据，专属性、检测限、定量限、线性、重复性、准确度（回收率）、耐用性试验等符合要求。

2.2 方法研究表明，该法操作简便、结果准确、灵敏度高、重现性好，可作为组氨酸含量的测定。

参考文献
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2 黄莹，氨基酸检测方法综述[J].海峡药学，2005，16(6):206 .
3 卢利宁，徐庆阳，谢希贤，组氨酸检测方法探讨，天津科技大学生物工
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4 刘海坤，周瑞赐，周静林，等用库伦滴定法测定组氨酸的研究[J].分析
化学，1986，(1)：51-54
指导专家姓名：。