ELISA试剂盒生产流程

标准化操作规程
--------ELISA试剂盒的生产
本着进一步提高ELISA（含化学发光）试剂盒生产质量的目的，同时便于本部门更好的实施精细化管理，特制订以下标准化操作规程。

单就ELISA试剂盒的生产而言，此过程相对比较简单，生产的关键在于做好预实验和生产完成之后的质检。

预实验（此实验的实质是ELISA实验操作流程）：
1.包被抗体经过特殊处理了的采用间接包被法，即先包被浓度为1.6ug/ml的打底物（方阵法摸索出的最佳包被浓度）37℃放置2h 或者4℃过夜，然后用无关蛋白（一般为1%BSA）进行非特异性的封闭（37℃ 1h或4℃过夜），接着加入经过特殊处理了的包被抗体（通过方阵法摸索出最佳浓度，通常为0.1ug/ml或0.05ug/ml）。

没有经过特殊处理的包被抗体采用直接包被法，采用方阵法确定最佳包被浓度（包被浓度通常为0.5ug/ml---4ug/ml之间），封闭条件同间接包被法。

目前ELISA（含化学发光）试剂盒的检测方法一般为双抗体夹心法和竞争抑制法（直接竞争法和间接竞争法）。

a.双抗体夹心法：
2．包被完成之后，加入与包被抗体相对应的经倍比稀释的标准品（一般我们可以通过查阅文献得知该指标的检测范围）,每孔100ul,37℃放置2h 或者4℃过夜
3．加入与包被抗体配对且浓度不同的生物素化的或者未经生物素化的抗体,每孔100ul，37℃放置1h，确定该检测抗体的最佳检测浓度
3.用0.01M TBS 洗涤3次,每孔270ul，静置1-2min/次,加入不同浓度的HRP标记的亲和素或者相对应的HRP标记的第二抗体，每孔100ul，37℃放置1h，确定最佳检测浓度
4.用0.01M TBS 洗涤5次，每孔270ul，静置1-2min/次，加入TMB 90ul/孔（或化学发光底物），37℃放置5-30min(化学发光实验为10min)，根据颜色的深浅决定终止（2NH2SO4）的时间
5.将酶标板置于酶标仪中于450nm处读取OD值，化学发光实验采用化学发光仪读取。

b.竞争抑制法：
2.第一步的打底物包被完成后（间接包被法），加入经特殊处理的抗原（间接竞争法）或抗体（直接竞争法），每孔100ul, 37℃放置2h 或者4℃过夜
3.加入与该抗原相对应的不同浓度的生物素化的抗体50ul/孔和经倍比稀释的标准品50ul/(间接竞争法)，或者加入与该抗体相对应的不同浓度的生物素化的抗原50ul/孔和经倍比稀释的标准品50ul/孔（直接竞争法），37℃放置1h，确定检测抗体或者检测抗原的最佳检测浓度
4. 用0.01M TBS 洗涤3次,每孔270ul，静置1-2min/次，加入不同浓度的HRP标记的亲和素每孔100ul，37℃放置45min,确定最佳检测浓度
5. 用0.01M TBS 洗涤5次，每孔270ul，静置1-2min/次，加入TMB 90ul/孔（或化学发光底物），37℃放置5-30min(化学发光实验为10min)，根据颜色的深浅决定终止（2NH2SO4）的时间
6.将酶标板置于酶标仪中于450nm处读取OD值，化学发光实验采用化学发光仪读取
包被：
在经过预实验确定各个步骤的最佳工作浓度之后，就可以开始对酶标板进行包被了，为了提高工作效率，一般每次以包15张以上为宜，整板之外一般多包6条左右，用于生产完
成后的检测之用，包被完成之后经稳定性处理，将板子置于37℃恒温箱中烘干（1h）,用真空封口袋封口后做好相应的标记和注明包板时间，与分装好后的检测A，检测B和标准品一起置于-20℃,其他稀释液等试剂分装好后置于4℃。

质检：
生产完成后，依据该试剂盒的使用说明书进行相应的检测，将检测的实验数据记录在册，作为后续工作的参考之用，最终的检测结果如与预实验结果相符即可发货，否则需要重新质检，质检仍不合格暂缓发货，经重新调整实验条件再次质检合格后方可用来发货。

ELISA试剂盒成品检测检验过程及注意事项
1.根据实际生产要求生产好的每种指标的板子都是若干个整块板子+剩余的几条散条。

整
块的板子用于发货用，而那所剩的几条是用于出货前的产品质量检测的。

（注意事项）：（1）上述的整块板子与其对应的散条整个生产过程中的条件必须高度保持一致，以减小批内差。

(2) 上述板子生产完后都要先置于-20℃冰箱保存一段时间(2h以上)再做检
测。

2.一般情况下取两条上述某一种指标的散条各做一条标准品和样品试验。

标准品按倍比稀释
做7个梯度浓度加一个样品稀释液空白对照孔。

而样品根据实际情况做3到
4个浓度复空即可。

(注意事项)：(1) 在做上述实验时必须先确保各个缓冲液是被污染的。

在加TestA之前要先将它稀释到产品生产之前预试验的浓度的100倍(比如预实验TestA的工作
浓度是1：5000，那么在做产品检测实验时就应先用缓冲液稀释1:50，再1:100
稀释后加入酶标板孔中，以减小误差。

)
(2) 上述实验所用的标准品，TestA等的日期与浓度需与预实验一致。

(3) 上述实验过程需严格按照相应指标说明书上的操作方法和步骤进行。

3.实验结束后要对结果进行分析总结。

对标准品OD值作标准曲线，并且与预实验的实验结
果作比对。

最后的结果有两种情况:一种是与预实验结果几乎一致，则可以确
定所生产的整块板子可以用来出货。

另一种是与预实验结果存在一定差距而
不能用来出货。

遇到这种情况的话可以继续做试验(板子不变，标准品或
TestA的浓度作出调整。

如果结果好的话就按新调整好的条件出货。

如果结
果仍不好就可以把这批板子报废处理掉。

之后检查实验失败原因再重新做预
实验和生产。

)
(注意事项): (1) 每一批生产的板子或多或少存在一些批间差。

所以每批板子出货前都要做一下检测及信息登记。

登记信息包括每一批生产的总板数，生产日期，标
准品日期及其浓度，TestA的浓度等，以便日后查验。

(2) 检验好之后就用一个封口袋将对应的TestA分装好并装入小西林瓶与对
应标准品装入，用纸片写上日期及对应指标后入库(置于-20℃冰柜中保存)。

发货前标签和缓冲液的准备
标签：
1.统计好货的数量、种属、名称、蛋白缩写、方法以及批号国别
2.打标签时要核对好货的货号、物种、批号、数量。

排版要尽量使标签看起来美观
3.每月月初注意更改新的保质期
缓冲液：
1.确保第一步配置的缓冲液没有问题。

包括：TBS、BSA、水、防腐剂等
2.配好的含BSA等无关蛋白的缓冲液要经过抽虑才能装瓶
3.装瓶的缓冲液保存在-20摄氏度，发货前要确保缓冲液没有变质
4.分清货的来源准备底物和检测B
5.核对标签说明书是否一致
说明书打印过程中注意事项
1,说明书页面设置：上：3.4cm，下1.6cm，内3cm，外2cm，页码书籍折页横向，有页眉页脚
2,标准品一般稀释至1.0ml，也有0.5ml或其他
3,检测A 一般120ul（按1:100稀释），也有240ul（按1:50稀释）
4,货号有调整，必须核对订单和新网蛋白是否同一种蛋白
5,检测范围：
（1）0001~2000表格记录清楚，若与出过货的不一致，改为出货范围
（2）另检测范围有更改，沿用改后的
（3）曲线图不同检测范围对应不同，需手动更改
（4）Sensitivity最低检测限改为相应数值
6,更改新网模板，
D:\新建文件夹\ftls\7.3,修改方法见《模板更新方法说明.docx》
注：说明书的美观自行调整。

7,关于COA
蛋白名、曲线图、标准品稀释量与说明书内一致
试剂盒组装完成后检查过程中需要注意的问题
1.说明书
1．说明书检测方法与试剂盒不对应，注意竞争法与夹心法的区别
2．说明书名称与试剂盒外标签上的名称不相符
3．说明书标题中的蛋白名称与说明书内容里面的蛋白名称不一致
4．检测范围与（1.0ml or 0.5ml）标准品稀释
5．说明书中的实验原理部分
2. 标签
1. 试剂盒外标签名称与说明书名称不一致
2. 种属与编号的种属不一致
3. 有效期打错，2012年打成2011年
4. 批号打错，与报检批号不一致
3. 组分
1. 板子编号打错，板子非真空
2. 标准品，检测A标签贴混
3. 标准品，检测A编号与试剂盒不一致
4. 检测A,检测B的量不够
5. 检测A,检测B稀释液装混
6. 漏放覆膜或者干燥剂
7. 标签破损
4. 外观
1. 试剂盒表面有污迹
2. 试剂盒里面粘胶裂开
ELISA部
2012.7.6。