Native_PAGE

4. 操作过程及注意事项
1. 溶液配制 凝胶配制
实验准备
保存
5. 凝胶保存
上样
2.制备样品 加样
4. 染色 技术联用
检测
3. 电泳
电泳

4. 操作过程及注意事项
• 实验准备
首先要清楚是分离碱性蛋白还是酸性蛋白。 – 分离酸性蛋白时候，要利用高pH凝胶系统。 通常在电泳中采用的pH8.0-9.0的缓冲系统， 蛋白会带负电荷，蛋白会向阳极移动；

3. Native PAGE的分类
– 操作过程
1. 样品处理： 加入考马斯亮蓝，其可以与膜蛋白结合消除 蛋白疏水性，从而起到增溶作用。同时使膜蛋 白带负电荷，电泳时（pH7.0）向阳极迁移。 2. 制胶。 通常在顶部的阴极一侧需要一个梯度为3-5% 的丙烯酰胺，在底部的阳极一侧需要梯度为1315%的丙烯酰胺，适用于10kDa—10MDa的分 离，可以通过改变胶的浓度，而改变分离范围。
4. 电泳：
在4℃进行电泳；先使用阴极缓冲液B，电压设定为 100v；等样品进入凝胶后将电压设为500v,待蓝色 前沿前进到一半距离处，暂停电泳，将阴极缓冲 液吸出，换成A缓冲液；待蓝色前沿到达底部前停 止电泳；

3. Native PAGE的分类
– 缺点是：考马斯亮蓝与蛋白的结合起到了去垢 剂的作用，可能导致敏感蛋白复合物的分离； 并对化学发光或蛋白质辅基的荧光或荧光染料 的标记具有潜在的猝灭作用。 – 通常与其他电泳联用做二维电泳，甚至三维电 泳。

1. PAGE
–过硫酸铵：ammonium persulfate (NH4)2S2O8，简称AP。AP在水溶液中即可 形成一个过硫酸自由基，化学聚合。 –核黄素：riboflavin，即vitamin B2， C17H20O6N4。Riboflavin-TEMED系统需要光 照和氧气，引起riboflavin分解生成自由基， 称为光聚合。
1. PAGE

2. Native PAGE
• 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE) 是在不加入SDS、疏基乙醇等变性剂的条 件下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺 凝胶电泳。在电泳分离后仍能保持蛋白质和 酶等生物大分子的生物活性和构象，对于生 物大分子的鉴定有重要意义。
China Pharmaceutical University
Native PAGE
马海荣 仇黎鹏 李小文 吴灿 S0930597 S0930598 S0930599 S0930600
L/O/G/O
Contents
1
2 3
PAGE基本原理 Native PAGE
Native PAGE 分类
实验操作过程及注意事项

1. PAGE
• PAGE分离原理：
– 电荷效应：不同蛋白质所带电荷不同，在电场
中迁移率不同。电荷越多，迁移越快。
– 分子筛效应：一定浓度的凝胶具有一定大小的
孔径。分子量和形状不同的蛋白质泳动时所 受到的阻滞程度不同，迁移率不同。
– 浓缩效应：不连续体系由电极缓冲液，浓缩胶
– 离子强度：过高，电泳时过度发热；过低，出 现非特异蛋白凝集。范围通常在 10~100mmol/L。 – 温度：所有步骤都要在0~4℃条件下进行，可 保持蛋白质的活性，降低蛋白质的水解作用。

2. Native PAGE
• Native PAGE凝胶
– separating gel
–N,N,N’,N’—四甲基乙二胺：N,N,N’,N’— tetramethyl ethylenedia mine，简称 TEMED

1. PAGE
TEMED AP+H2O 0-40℃ Bis 三维网 状结构 过硫酸自由基
PAM
交联 聚合
Acr
TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯 酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺 链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。
4

1. PAGE
• 以聚丙烯酰胺凝胶为支持物的电泳称为聚丙 烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。
• 聚丙烯酰胺凝胶： – 丙烯酰胺：acrylamide，简称Acr – N,N-甲叉双丙烯酰胺：N,N—methylenebisacylamide，简称Bis

2. Native PAGE
• 影响native PAGE的因素
– 凝胶浓度：Acr的浓度改变范围为5%~10%， Acr:Bis可从20:1到50:1，引起不同筛分效应。 – pH：一般采用pH为8.8，也可在微酸性环境下 电泳，前提是不影响蛋白质的生物活性。
• CN-PAGE
– 在聚丙烯酰胺凝胶中分离酸性水溶性蛋白和膜 蛋白（PI<7）的电泳技术，没有带电荷染料， 而是通过除染色以外的其它方法如与SDSPAGE或与LC-MS联用鉴定分析蛋白。 – 分辨率通常比BN-PAGE低。 – 迁移距离决定于蛋白的固有电荷、大小和形状。

3. Native PAGE的分类
• 当考马斯染料对所要 分析的天然混合物产生干扰 时，CN-PAGE就显示出了优势，CN-PAGE可保 证蛋白复合物结构和功能的完整性。 • 如测定催化活性（例如线粒体ATP合酶）或分离 用于荧光共振能量分析的微量膜蛋白，CN-PAGE 比BN-PAGE更温和，CN-PAGE 可以保持膜蛋白 的超分子组合体的结构而BN-PAGE会导致分解。 • 线粒体ATP合酶中的具有酶活性的低聚物可以用 CN-PAGE检出，但BN-PAGE无法检出。

3. Native PAGE的分类
Blue native Pቤተ መጻሕፍቲ ባይዱGE （BN-PAGE）
Native PAGE
Clear native PAGE （CN-PAGE） Quantitative preparative native continuous PAGE （QPNC-PAGE）

3. Native PAGE的分类
• QPNC-PAGE分离系统 – QPNC-PAGE是在特殊的装置里进行的分离生 物活性分子的电泳过程。分离系统包括电泳槽 和部分收集器，这些装置要置于冰箱中。
– 电泳缓冲系统是基于Tris-HCl和NaN3，pH为 10.0，这种条件下大多数蛋白都会带负电荷， 在电场的正负极之间迁移。 – 在生理PH（8.00）的缓冲体系下蛋白被连续洗 脱并分成不同的部分。
• Single gel （单一浓度凝胶） • Gradient gel（梯度凝胶）
– 浓度梯度聚丙烯酰胺凝胶适合分离成分复杂、分 子质量范围较大的蛋白，分离效果更好。随着凝 胶浓度的逐渐增加，凝胶孔径逐渐减小，不同大 小蛋白质分子的移动就会在不同的区域受阻，形 成较窄的区带。 – 需要梯度混合器来完成制胶工作。常用凝胶浓度 4%~22%。电泳电压一般在500V左右。

3. Native PAGE的分类
3. 缓冲液：
– 阳极缓冲液;50mM Bis-Tris/HCl PH7.0 – 阴极缓冲液A: 50mM Tricine,15mM Bis-Tris/HCl， PH7.0+0.002%考马斯亮蓝（或不加） – 阴极缓冲液B: A+0.02%考马斯亮蓝

3. Native PAGE的分类

3. Native PAGE的分类
• QPNC-PAGE凝胶特征 – 聚丙烯酰胺凝胶需要在室温下凝聚69hr。 – 凝胶的孔径很大，因此分子筛作用在电泳 分离中最小化。故凝胶和活性分子之间的 相互作用可以忽略。 待分离的金属蛋白不会分解成脱辅蛋白 和金属辅助因子。 孤立蛋白的生物活性结构（天然或3D构 象）在QPNC-PAGE后不会发生构象变化。
– 分离碱性蛋白时候，要利用低pH凝胶系统， 一般采用pH4.0-5.0。通常电泳是在微酸性环 境下进行，蛋白带正电荷，这时候需要将阴极 和阳极倒置才可以电泳分离碱性蛋白。

4. 操作过程及注意事项
– 溶液配制Tips • Acr是神经毒剂，戴手套操作。 • 电泳纯，ddH2O。 – 胶配制 • AP应现配先用；或大量配制，-20℃储存。 • 最后加TEMED。 • 可通过调节AP和TEMED的量调节聚合时间。 一般聚合时间为20min~60min。 • 灌胶要迅速，且避免产生气泡。

3. Native PAGE的分类
• B. Kastenholz 对Arabidopsis thaliana（拟南 芥）中的一种高分子量（约200kDa）活性 镉蛋白分离。先用GPC通过分子量大小进行 分离，然后用QPNC-PAGE进行分离，电泳 图谱出现单一条带，同时镉蛋白的天然化学 结构没有改变，并且蛋白复合物经电泳后并 没有解离成金属离子和脱辅蛋白质。
和分离胶组成。浓缩胶和分离胶存在凝胶孔 径的不连续性和缓冲系统（离子成分、pH和 电位梯度）的不连续性。

1. PAGE
• PAGE类型
阳极电泳 阴极电泳 电泳系统 连续电泳
蛋白质电性
不连续电泳
圆盘电泳
电泳槽
垂直平板电泳
水平平板电泳


4. 操作过程及注意事项
• 上样
– 标准样品（测分子量） – 要求在形状大小，水化度方面与待测蛋白 比较类似。比较难找。SDS-PAGE。 – 样品的离子强度不能太高（I<0.1mmol/L）， 否则会引起电泳条带变形。 – 上样前一定先要离心，除去沉淀物。 – 一般来说 marker不是必要的，如果一定要 用，可以买一些专门的native PAGE marker。

3. Native PAGE的分类
• 2D BN/SDS-PAGE

3. Native PAGE的分类
• 3D BN/IEF/SDS-PAGE.

3. Native PAGE的分类

3. Native PAGE的分类
• QPNC-PAGE
– 是一种应用于生物化学和生物有机化学的根据 等电点分离蛋白的高分辨技术。
– 这种凝胶电泳被生物学家应用于独立活性，天 然金属蛋白样品，正确或非正确折叠的与金属 辅助因子结合的可溶性蛋白混合物的鉴定。
– 金属蛋白和蛋白异构体在PAGE中被定量的分 成高纯度的部分，故QPNC-PAGE与其它电泳 技术如SDS-PAGE，2-DE，等速电泳和CNPAGE等相比被称为―突破性的方法‖。

3. Native PAGE的分类
• Blue native PAGE
– Blue-native PAGE是PAGE中应用较广的一种， 在分析蛋白质-蛋白质相互作用以及膜蛋白复合 物方面有很大的优势。 – 1991年Schagger等人为了研究线粒体内膜中多 亚基蛋白复合物建立起的一种温和凝胶电泳系 统，它是以考马斯亮蓝G-250代替SDS使蛋白 复合物带负电，从而避免了蛋白质的变性。— —Blue native PAGE
• GPC：gel permeation chromatography 凝胶渗 透色谱法。

3. Native PAGE的分类
• QPNC的应用对象为分子量6-200kDa的酸性、碱 性和中性金属蛋白。 • 在测定血液或其它临床样品中独立的金属蛋白结 构和功能关系方面具有重要应用，因为不正确的 金属可能导致蛋白的错误折叠。 • QPNC-PAGE，SEC，ICP-MS和NMR等技术的 连用可以得到病人或潜在的病人液体基质中相关 金属蛋白的生理状态的结构。这一技术可以提高 蛋白错误折叠相关疾病的诊断和治疗水平。