蓖麻籽蛋白质的粗分离

蓖麻籽蛋白质的粗分离
狄建军;袁绍辉;魏永春;黄凤兰;谢寇龙
【摘要】The phosphate extraction process of crude protein in castor bean was optimized. The results showed that the extracting efficiency was the highest when the saturation of ammonium sulfate was 70%. Through extracted by optimized phosphate extraction method and analyzed by UV method, it was found that the longer the time interval was from pollination to harvest, the higher the accumulation of crude protein in castor bean was.%以蓖麻籽中总蛋白为研究对象,对磷酸盐法提取蓖麻籽中粗蛋白过程进行优化.结果表明,在硫酸氨饱和度为70％时对蓖麻籽中粗蛋白的提取效率最高；利用优化后的磷酸盐法对7个不同发育时期的蓖麻籽中的蛋白质进行粗提取,并利用紫外分析法对所提取的不同生长阶段的蓖麻籽中的粗蛋白进行比较分析,结果发现自植株授粉后到获取蓖麻籽的时间间隔越长蓖麻籽中总蛋白积累量就越高.
【期刊名称】《山东农业科学》
【年(卷),期】2013(045)002
【总页数】3页(P110-112)
【关键词】蓖麻籽;蛋白质;提取
【作者】狄建军;袁绍辉;魏永春;黄凤兰;谢寇龙
【作者单位】内蒙古民族大学生命科学学院,内蒙古通辽028000;内蒙古自治区高校蓖麻产业工程技术研究中心,内蒙古通辽028042;内蒙古民族大学生命科学学院,内蒙古通辽028000;华中农业大学生命科学技术学院,湖北武汉430070;内蒙古民
族大学生命科学学院,内蒙古通辽028000;内蒙古民族大学生命科学学院,内蒙古通辽028000;内蒙古自治区高校蓖麻产业工程技术研究中心,内蒙古通辽028042;内蒙古民族大学生命科学学院,内蒙古通辽028000;华中农业大学生命科学技术学院,湖北武汉430070
【正文语种】中文
【中图分类】S565.601
蛋白质的提取方法有很多，目前文献已报道过的蛋白质提取方法主要有水溶液提取法、有机溶剂提取法以及酶法和超声波萃取法等［1～5］。

蓖麻(Ricinus communis)在国内种植广泛，资源丰富。

为进一步加深对蓖麻籽中酶的研究和利用，本实验利用磷酸缓冲液(PB)法提取蓖麻籽蛋白质，并对盐析浓度进行优化，同时利用优化后的提取方法对在不同发育时期的蓖麻籽粗蛋白进行提取并比较分析。

1 材料与方法
1.1 材料
成熟通蓖五号种子，通辽巨大种业公司提供。

种植在实验田的哲蓖四号经人工授粉后采集分期蓖麻种子，授粉当天为0
DAP(Days after pollination)，授粉第二天为1 DAP;分别采集哲蓖四号同一植株上 16、23、30、37、44、51、69 DAP 共 7个不同时期的种子，采集后立即去壳并放入超低温冰箱中。

1.2 主要仪器
高速冷冻离心机，珠海黑马医学仪器有限公司;DYY-6C型电泳仪，北京市六一仪器厂;精密pH计，上海精密科学仪器有限公司;电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;SHA-B数显恒温振荡器，常州国华电器有限公司;T6新世纪紫外可见
分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 蓖麻籽粗蛋白提取方法的优化
参照曾佑炜等［6］的方法并稍作修改。

从超低温冰箱中取出去壳的通蓖五号蓖麻籽适量，放入冷冻好的研钵中迅速研磨。

充分研磨后称取8.0 g放入50 ml的离心管中，加入5 mmol/L磷酸缓冲液(PBS，pH 6.5，含100 mmol/L NaCl，缓冲液 A)32 ml，并充分混匀，4℃ 放置过夜。

4℃、14 000 r/min离心30 min，小心去除沉淀和白色脂肪，取上清于另一离心管中，相同条件下重复离心1次。

取7个1.5 ml的离心管，将所得上清液各取1 000 μl，分别加入不同质量的固体硫酸铵，使各管的硫酸铵浓度依次为30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%，4℃放置过夜。

4℃、17 000 r/min离心30 min，弃去上清，取500 μl缓冲液A将沉淀溶解。

1.4 粗蛋白的电泳检测
将得到的蓖麻粗蛋白提取物进行SDSPAGE检测。

浓缩胶的浓度为5%，分离胶浓度为12%。

分别将上述所得的蓖麻粗蛋白提取液取样100 μl，加入25 μl的5 × 蛋白缓冲液混匀，沸水中煮沸5 min，12 000 r/min离心5 min，取上清25 μl
点样，电泳，经染色及脱色后观察。

1.5 粗蛋白含量的测定
利用紫外分光光度计对蓖麻籽中的蛋白含量进行测定。

将各管提取样液20倍稀释后，在280 nm和260 nm处分别测出其吸光值(A值)，然后利用280 nm及260 nm下的吸收差来求出蛋白质的浓度［7］。

蛋白质的浓度(mg/ml)=1.45A280-0.74A260
1.6 利用优化后方案提取哲蓖四号蓖麻籽粗蛋白并检测
分别将采集的不同发育时期蓖麻种子经充分研磨后，称取0.25 g样品放入1.5 ml 离心管中，依据料液比为1∶4的比例，每管分别加入1 000 μl的缓冲液A。

依据
上述粗蛋白提取方法提取粗蛋白并溶解于500 μl缓冲液A中，利用紫外分光光度法测定粗蛋白含量，同时进行SDS-PAGE电泳检测。

2 结果与分析
2.1 蓖麻籽中总蛋白粗提优化体系的确定
2.1.1 紫外法检测分析所提通蓖5号蓖麻籽中粗蛋白含量的结果由图1可以明显
看出，在硫酸铵饱和度为70%时对蓖麻籽中蛋白质的粗提效果最佳;粗蛋白提取量在硫酸铵饱和度为40%～50%之间的增率最大，而其他各梯度之间的差率跨度并
不是太大。

图1 不同硫酸铵饱和度对蓖麻籽中粗蛋白提取的影响
2.1.2 对所提通蓖5号蓖麻籽中粗蛋白的电泳检测结果由图2可以明显看出，不
同硫酸铵饱和度下所提取的蛋白质条带差异较大，说明不同大小的蛋白质条带很可能在提取时具有自身最适硫酸铵饱和度;1号离心管对应的硫酸铵饱和度下提取蛋
白效率最低，而6、7号中的条带差异不明显，2、3、4、5 号对应条带差异较大，可能在这些管对应硫酸铵饱和度下对某些特定大小蛋白条带的提取效率较高。

图2 蓖麻籽中粗蛋白电泳注:图中自左向右分别代表1～7号离心管中不同硫酸铵
饱和度下所提取的蓖麻籽中的蛋白质电泳条带。

2.2 利用优化后体系对哲蓖4号蓖麻籽中总蛋白的粗提结果
2.2.1 紫外法检测分析所提哲蓖4号蓖麻籽中粗蛋白含量的结果由表1可以看出，自植株授粉后开始，随着蓖麻籽生长时间的延长，蓖麻籽中蛋白的积累量增多;植
株授粉后16～23天间，蓖麻籽中积累蛋白的速度最快，即蓖麻籽中多数蛋白是在此期合成的;从表中还可以看出，第30～69天蓖麻籽中蛋白积累量的增加不多，
说明蛋白的合成和降解进入比较稳定的时期。

表1 不同生长阶段蓖麻籽中粗蛋白的提取结果注:表中所测的吸光值和计算所得的
蛋白浓度值均是蛋白液在稀释20倍后所测得的值。

离心管编号植株授粉后时间
(d)A280的吸光值(mg/ml)A260的吸光值(mg/ml)A280/A260的值所得蛋白浓
度值(mg/ml)1 16 0.186 0.285 0.6527 0.05880 2 23 1.137 1.599 0.7111
0.46539 3 30 0.964 1.071 0.9000 0.60526 4 37 0.860 0.822 1.0462 0.63872 5 44 0.822 0.743 1.1063 0.64208 6 51 0.816 0.702 1.1624 0.66372 7 69 0.887 0.762 1.1509 0.72227
2.2.2 对所提哲蓖4号蓖麻籽中粗蛋白的电泳检测结果由图3可以看出，不同生
长时期的蓖麻籽中不仅蛋白含量有所不同，而且蛋白种类及其表达量也不尽相同。

从图中还可以看到有些蛋白从无到有且积累量不断增加，这些蛋白可能就是贮藏蛋白;而有些蛋白从无到有然后再消失，这些蛋白很可能是功能蛋白，随着蓖麻籽成
长的需要而不断合成与代谢;结合粗蛋白总含量在蓖麻种子发育后期变化不大的结果，说明在这个过程中贮藏蛋白不断合成，油脂合成酶类在种子成熟后期不断降解。

图3 不同发育时期的蓖麻籽中粗蛋白电泳注:自左向右分别代表1～7号离心管中
从不同生长时期的蓖麻籽中所提取的蛋白质电泳条带。

3 结论与讨论
3.1 在利用磷酸盐法提取蓖麻籽中粗蛋白而进行盐析的过程中，当硫酸铵饱和度为70%时蓖麻籽中粗蛋白的提取效率最佳;而且不同硫酸铵饱和度下所提取的蛋白质
条带差异较大，说明不同大小的蛋白质条带在提取时具有自身最适盐析浓度。

自蓖麻植株授粉后开始，随着蓖麻籽生长时间的延长，蓖麻籽中蛋白总的积累量增多;
且自植株授粉后的第16～23天蛋白积累速率最快，而从植株授粉后的第30天到种子成熟过程中，蓖麻籽中蛋白积累量的增加不明显。

3.2 为探求有效提取蓖麻籽中粗蛋白的方法，对蓖麻籽中粗蛋白分离的过程进行了优化:采用高速冷冻离心的方法去除杂质效果较好，省去透析过程，简化了操作步骤，节省了时间，经电泳检测对实验并没有产生明显影响。

本实验中所优化的盐析浓度比较适合对蓖麻籽中粗蛋白的提取，而对比较单一的蛋白提取效率不一定是最
优的，例如对于蓖麻毒蛋白的提取过程中硫酸铵饱和度一般定为60%［8］。

随着蓖麻籽长成的需要，可能有些功能蛋白不断地合成与代谢，致使总蛋白的量与类别不断的更新变化。

参考文献:
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［2］王川，李燕，马志英，等.几种酶法从猪皮中提取胶原蛋白的对比研究［J］.食品科学，2007，28(1):201-204.
［3］Damerval C，De Vienne D，Zivy M，et al.Technical improvements in two-dimensional electrophoresis increase the level of genetic variation detected in wheat seeding proteins［J］.Eletrophoresis，1986，7(1):52-54. ［4］谷瑞升，刘群录，陈雪梅，等.一种省时高效的木本植物蛋白双向电泳分析方法［J］.北京林业大学学报，1999，21(5):7-10.
［5］Baskir J N，Hatton T A，Suter U W.Protein partitioning in two-phase aqueous polymer system ［J］.Biotechnology and Bioengineering，1989，34(4):541-558.
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［7］贺永怀，刘演波，陈兴.一种快速简便的提取和纯化蓖麻毒素的方法［J］.生物化学与生物物理进展，1987，6:64-66.
［8］郑成，雷德柱，雷雨，等.蓖麻毒蛋白提取［J］.广东化工，2003，5:1-4.。