应用自动质谱退卷积定性系统拆分中药挥发油总离子流谱图中的重叠

应用自动质谱退卷积定性系统拆分中药挥发油总离子流谱图中的重
叠峰——以青皮为例
研究如何应用自动质谱退卷积定性系统（automated mass spectral deconvolution & identification system，AMDIS）拆分中药挥发油总离子流谱图中的重叠峰。

通过水蒸气蒸馏法提取挥发油，GC，MS测定得到总离子流谱图，AMDIS对重叠峰进行解析。

AMDIS能够初步分析总离子流谱图中大约含有多少化合物。

而后，通过分析待鉴定化合物对应扫描点的提纯质谱图及该处原始质谱图与参考谱库中的各匹配项，可准确的对化合物进行定性或否定某些实际并不存在的化合物。

进一步分析各化合物特征性碎片离子峰的变化规律，可确认之前的结果。

研究结果表明AMDIS通过对待鉴定化合物对应扫描点谱图的提纯，可以有效的对重叠峰进行拆分，进而准确的定性。

标签：自动质谱退卷积定性系统；中药；挥发油；总离子流谱图；重叠峰
许多中药富含挥发油类成分，如来源于芸香科柑橘属植物的枳实、枳壳、陈皮、青皮、佛手等[1]。

中药的挥发油是一个十分复杂的体系，含有数以百计的化学成分，且许多成分性质相近，这导致应用气相色谱，质谱联用仪（GC，MS）分析挥发油得到的总离子流谱图（total ion chromatogram，TIC）中存在着大量的重叠、甚至内嵌峰。

如何对这些重叠峰进行拆分，并定性，将对挥发油成分的正确分析起到至关重要的作用[2，3]。

为解决这一难题，有学者应用化学计量学方法（chemometric resolution method）对重叠峰进行拆分，并定性。

如交互移动窗口因子分析法（alternative moving window factor analysis，AMWFA）、直观推导式演进特征投影法（heuristic evolving latent projections，HELP）等[2，3]。

尽管这一方法是有效的，但是对于不熟悉化学计量学的研究人员而言，要掌握它是比较困难的。

而与气，质化学工作站（ChemStation）匹配的NIST（national institute of standards and technology，美国国家标准技术研究院）质谱软件中就带有AMDIS（automated mass spectral deconvolution & identification system，自动质谱退卷积定性系统），它能有效地解决重叠峰的拆分问题，并且更易掌握。

AMDIS程序是NIST受“禁止化学武器组织”的委托，研发的一种能够对GC，MS测定所得TIC中所有谱峰进行自动筛查并确定是否有目标化合物存在的应用软件[4，5]。

它能够提取出每1个待鉴定成分的“纯净”质谱图和相关信息，并运用这些信息来确定该成分是否可被确定为参考数据库中的某1个化合物[6，7]。

根据质谱原理，在没有干扰的情况下，同一化合物的各个离子碎片峰的形状和保留值应完全相同；在TIC中虽然有些化合物的碎片离子峰相互重叠，并表现为1个峰，但因化合物不同，其碎片峰的形状与保留值应有一定的差异。

AMDIS基于模型峰的算法，把形状与保留值完全相同的碎片峰重新组合，去掉其他的干扰峰，进而构建一张比较“纯净”的谱图[5]。

AMDIS是一个处理分析GC，MS数据的优秀软件，它虽然是为检测毒剂而开发的，但亦可用于从复杂基质中探测大量目标化合物的场合[7]。

目前，該软件被广泛应用于具有严重背景干扰的农残检测、毒物分析等领域[8，9]。

然而，将该程序应用于中药挥发油或挥发性成分只
有零星的报道[10，11]，还未见系统阐述如何应用AMDIS拆分中药挥发油TIC 中重叠峰的报道。

在此，笔者以青皮Citri Reticulatae Pericarpium Viride（CRPV）挥发油为例，对此问题进行较系统的阐述。

1 材料
Agilent 7890A/5975C GC，MS气质联用仪，匹配一化学工作站MSD ChemStation E. 02. 01. 1177（美国安捷伦公司）。

FA2004N型电子天平（1/1万，上海民桥精密科学仪器有限公司），FW，400A倾斜式高速万能粉碎机（北京中兴伟业仪器有限公司），ZDHW型调温电热套（河北省黄骅市中兴仪器有限公司）。

正己烷为色谱纯，无水硫酸钠为分析纯。

C8，C20系列正构烷烃标准溶液（mixture No. 04070）购于Fluka Chemika。

青皮样品于2011年8月15日采于3棵相邻并具有相同树龄的植株，其生长于重庆市璧山县健龙乡画眉村。

原植株经成都中医药大学药学院严铸云教授鉴定为大红袍红橘Citrus reticulata “Dahongpao”。

2 方法
2.1 挥发油的制备称取青皮样品22.35 g。

样品粉碎后与约10倍量的蒸馏水于40 ℃时在一标准提取器中溶胀1 h，而后提取3～4 h，至挥发油量不再增加为止，得到挥发油0.15 mL。

将挥发油于4 ℃时通过无水硫酸钠脱水24 h，后置于冰箱备用。

2.2 气相与质谱条件HP，5MS色谱柱（250 μm×30 m，0.25 μm）；柱室初始温度60 ℃，保持3 min，以4 ℃·min-1升至250 ℃；进样口温度280 ℃，分流比20∶1，溶剂延迟3 min；载气He，流速1 mL·min-1；进样量1 μL，样品浓度10%，正己烷溶解。

质谱条件：电离方式EI，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃；质量扫描范围m/z 30～350；质谱图匹配的谱库为NIST 08 MS database。

根据Van Den Dool与Kratz提出的公式[12]计算各待鉴定化合物的保留指数（Retention index，RI）。

2.3 AMDIS分析将原始TIC中的背景扣除后，应用AMDIS拆分其中的重叠峰。

AMDIS程序的分析类型选为Simple，其余各参数均为软件默认值。

3 结果
青皮挥发油放大的总离子流谱图见图1。

尽管一些色谱峰的基线得以分离，但重叠峰仍广泛的存在于总离子流谱图中。

下面通过2段TIC谱图的分析，对应用AMDIS拆分重叠峰的问题作一详细的阐述。

TIC中待鉴定化合物R1对应扫描点Scan 1203（11.832 min）的提纯质谱图。

其经过Go to NIST MS program操作后，NIST 08 MS Library给出的最佳匹配物是壬醛，匹配概率高达79.5%（最大值100%）。

Scan 1203的原始谱图经检索后，其最佳匹配物仍是壬醛，但匹配概率只有11.2%。

这表明，该扫描点原始质谱经
过提纯后，去除了由其他物质引入的碎片离子峰，同时最大限度的保留了R1的碎片离子峰，导致其与匹配化合物标准质谱图的匹配几率大大增加。

待鉴定化合物R2对应扫描点Scan 1205（11.847 min）的提纯谱图对应的最佳匹配物是3，7，二甲基，1，5，7，辛三烯，3，醇，匹配几率为77.0%。

该点原始谱图对应的最佳匹配物还是3，7，二甲基，1，5，7，辛三烯，3，醇，但匹配概率只有18.4%。

该扫描点的另一提纯谱图对应另一待鉴定化合物R3，其对应的最佳匹配物是3E-己烯，1，醇，乙酸酯，匹配度为14.2%。

从谱图特征来看，与该提取谱图对应的最佳及其他匹配物是不合理的。

此提取质谱主要由化合物3，7，二甲基，1，5，7，辛三烯，3，醇的部分碎片离子峰组成。

这表明R3实际并不存在。

各质谱图见图3。

分别选择化合物R1（壬醛）与R2（3，7，二甲基，1，5，7，辛三烯，3，醇）的特征碎片离子峰：57，70，81，114；71，82，43，67。

图2中可明确看到R2的特征碎片离子峰71，82，43，67呈现基本一致的变化规律，其所对应的保留时间为11.847 min。

但另一组峰57，70，81，114中，57，70，114显现基本一致的变化规律，而峰81的变化规律与这3个峰明显不同。

这是因为峰81为R1与R2的共有峰，其同时受到R1与R2的影响，导致其对应的保留时间（11.840 min）介于R1（11.832 min）与R2（11.847 min）之间。

另3个特征峰主要为R1所独有，因此它们几乎不受R2的影响。

以上分析表明，图2中的TIC事实上只含有2个化合物：R1（壬醛）与R2（3，7，二甲基，1，5，7，辛三烯，3，醇）。

两者对应的保留指数分别为1 105与1 106。

文献[3]亦从产于自贡、来源于大红袍红橘青皮挥发油中检测出化合物壬醛，保留指数为1 104，其与R1的保留指数1 105非常接近，这进一步佐证了R1为壬醛的事实。

但文献[3]未检测出3，7，二甲基，1，5，7，辛三烯，3，醇，这可能由于其与壬醛的出峰时间过于接近，或含量太低。

不过R2的保留指数1 106与NIST提供的3，7，二甲基，1，5，7，辛三烯，3，醇的保留指数1 089亦比较接近，偏差只有1.56%，这也再一次确认了R2为3，7，二甲基，1，5，7，辛三烯，3，醇的事实。

TIC（18.346～18.920 min）的AMDIS分析见图4。

其中主要有1个大的色谱峰（18.433 min），但在18.760，18.840 min有2个小的突起，值得注意。

经过AMDIS的初步分析，其中有4个化合物。

化合物C1对应Scan 2111（18.433 min）的提純质谱图，其对应的最佳匹配物是百里香酚，匹配系数为53.1%。

该扫描点原始谱图对应的最佳匹配物仍是百里香酚，匹配系数为51.9%。

化合物C2对应Scan 2156（18.760 min）的提纯谱图，其对应的最佳匹配物还是百里香酚，匹配几率是24.2%。

第二匹配物是香芹酚，匹配概率为20.4%。

该扫描点原始谱图对应的最佳匹配物仍是百里香酚，匹配系数是35.6%。

第二匹配物是香芹酚，匹配几率为20.5%。

化合物C1与C2对应的匹配物十分相似，这说明它们可能为同一物质，或是两个同系物。

Scan 2156处的原始谱图为化合物C1与C2组成的混合谱图（后面的分析表明：化合物C1与C2为2个同系物），同时C1与C2的质谱图高度相似，导致该处提纯谱图与对应物的匹配几率并未高于原始谱图与相应对应物的匹配几率。

化合物C3对应Scan 2167（18.840 min）
的提纯谱图，其对应的最佳匹配物是十一醛，匹配系数是51.6%。

该扫描点原始谱图对应的最佳匹配物2，乙烯基，1，3，3，三甲基，环己烯，匹配度是16.9%；其与百里香酚的匹配度为1.98%。

化合物C4对应Scan 2128（18.557 min）的提纯谱图，其对应的最佳匹配物是2，2，二甲基，丁烷，匹配概率是30.6%。

该点原始谱图对应的最佳匹配物仍是百里香酚，匹配几率为29.6%。

从谱图特征来看，此扫描点提取的质谱图是不合理的。

分析该提纯谱图与对应匹配物的标准质谱图，两者亦不匹配。

这表明，化合物C4实际上并不存在。

各质谱图见图5。

选择化合物百里香酚、香芹酚与十一醛的特征碎片离子峰：135，150，91，77；41，55，67，110。

将C2与C3对应的图谱放大后，可清楚地看到两者分别对应1个物质。

C1与C2都具有百里香酚或香芹酚的特征碎片离子峰。

且两者特征碎片离子峰的变化规律也十分相似。

这进一步表明这2个扫描点对应两个同系物。

通过文献报道的青皮挥发油中同系物之百里香酚、香芹酚、3，甲基，4，异丙基苯酚三者的含量高低[2，3]，及NIST08 MS database提供的三者的保留指数，分别为1 266，1 278，1 332。

此处时间点18.433，18.760 min确定的保留指数分别为1 297，1 306。

进而推断C1与C2分别对应化合物百里香酚与香芹酚。

在18.840 min处可看到另一物质C3（十一醛）的特征峰。

由于其含量太低，因此只有将谱图放大，才能看清它的特征峰。

文献[3]亦从产于自贡、来源于大红袍红橘青皮挥发油中检测出十一醛，其保留指数为1 354，与C3的1 308比较接近，偏差为3.39%，这进一步证明了C3为十一醛的事实。

这里需要注意一点，就是图4a中Scan 2167（18.840 min）处的原始质谱图。

若要通过气质化学工作站对原始谱图的PBM（probability based matching algorithm，基于匹配概率的算法）Quick Search或NIST Search来确定隐藏于这一扫描点下的物质将是一项十分困难的工作（尽管通过TIC的峰形、该扫描点的质谱图、及特征性的碎片离子峰可确定这一扫描点存在一待鉴定物质）。

因为PBM Quick Search给出的排在前10位的匹配物都是百里香酚及其同系物，而在其他匹配物中根本看不到化合物十一醛。

同样地，通过NIST Search给出的匹配物来确定该物质也不太可能。

该点原始质谱图是由化合物百里香酚、香芹酚与十一醛组成的混合谱图，但因为十一醛的含量太低，因而该谱图的主要特征峰（135、150）均由百里香酚、香芹酚给出，而其自身特征峰的丰度却较低。

但有了AMDIS的“提纯”功能后，将百里香酚、香芹酚的特征峰去除，只留下待鉴定物的特征峰，则可以确定它的结构为十一醛。

而前面的一个例子中，通过细致分析原始谱图的PBM Quick Search或NIST Search的匹配项，以及待鉴定化合物特征碎片离子峰的变化规律，也可以推断重叠峰中相應的物质。

4 讨论
通过以上的分析，可知AMDIS能初步分析TIC中含有多少化合物。

而后，通过对各待鉴定化合物对应扫描点提纯谱图及该扫描点原始谱图与参考谱库中各匹配化合物的比对、分析，确定其结构；或否定某处提纯谱图及其对应的化合物（即此提纯谱图并不合理，其对应的化合物实际并不存在）。

进一步，通过选择各化合物的特征性碎片离子峰，并分析它们的变化规律，可确认已有的鉴定结果。

由第2段TIC中的化合物C3（十一醛）可看出，当被鉴定物浓度较低，且受到干扰时，AMDIS分析方法具有较大优势。

它能有效去除干扰并获得“纯净”
的谱图信息，从而增大目标化合物定性的可靠性[5]。

总之，AMDIS的提纯质谱图的功能，可有效地对重叠峰中混合质谱图进行拆分，进而准确的对各物质定性。

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Deconvolution of overlapped peaks in total ion chromatogram of essential
oil from Citri Reticulatae Pericarpium Viride by automated mass spectral
deconvolution & identification system
WANG Jian1，2，CHEN Hong，ping1，LIU You，ping1*，WEI Zheng1，Liu Rong1，FAN Dan，qing1（1.State Key Lab Breeding Base of Systematic Research and Utilization on Chinese Materia Medica Resources，Co，Founded
by Sichuan Province and Ministry of Science and Technology，College of Chinese Materia Medica and Pharmacy，
Chengdu University of Traditional Chinese Medicine，Chengdu 611137，China；
2.College of Traditional Chinese Medicine，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）
[Abstract]This experiment shows how to use the automated mass spectral deconvolution & identification system （AMDIS）to deconvolve the overlapped peaks in the total ion chromatogram （TIC）of volatile oil from Chineses materia medica （CMM）. The essential oil was obtained by steam distillation. Its TIC was gotten by GC，MS，and the superimposed peaks in TIC were deconvolved by AMDIS. First，AMDIS can detect the number of components in TIC through the run function. Then，by analyzing the extracted spectrum of corresponding scan point of detected component and the original spectrum of this scan point，and their counterparts′ spectra in the referred MS Library，researchers can ascertain the component′s structure accurately or deny some compounds，which don′t exist in nature. Furthermore，through examining the changeability of characteristic fragment ion peaks of identified compounds，the previous outcome can be affirmed again. The result demonstrated that AMDIS could efficiently deconvolve the overlapped peaks in TIC by taking out the spectrum of matching scan point of discerned component，which led to exact identification of the component′s structure.
[Key words]automated mass spectral deconvolution & identification system （AMDIS）；Chinese materia medica （CMM）；essential oil；total ion chromatogram （TIC）；overlapped peaks
doi：10.4268/cjcmm20131023。