生物大分子的制备2蛋白质酶的分离纯化(课堂PPT)

生物材料如暂不提取，应冰冻保存。动物材料则
需深度冷冻保存。
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1.2.2 细胞的破碎
不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织， 其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同，如 动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生 物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞 壁，要采取专门的细胞破碎方法。
(1) 机械法： ① 研磨：将剪碎的动物组织或其它生物材料置于研
钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨成匀浆。 ② 组织捣碎器：这是一种较剧烈的细胞破碎方法，
通常可先用家用食品加工机械将组织打碎，然后 再用10000～20000r/min的内刀式组织捣碎机（即 高速分散器）将组织的细胞打碎。
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(2) 物理法：
①反复冻融法：将待破碎的细胞冷至-15℃到-20℃，然
后放于室温（或40℃）迅速融化，如此反复冻融多次， 由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起 细胞溶胀破碎。
(3) 酶具有催化活性。检测酶活性，跟踪酶的来龙去脉，为选择
适当方法和条件提供 直接依据。在工作过程中，从原料开始
每步都必须检测酶活性．一个好的方法和措施会使酶的纯度
提高倍数大，活力回收高，同时重复性好。
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2.1 酶活性测定
酶活力 (Enzyme Activity) 也称酶活性，指 酶催化一定化学反应的能力。酶活性是研究酶 的特性、分离纯化以及酶制剂生产和应用时的 一项不可缺少的指标。酶活力是用在一定条件 下，它所催化某一反应的反应初速度来表示。 酶反应速度（指初速度）可用单位时间内单位 体积中底物的减少量或产物的增加量来表示， 其单位为mol/s。
第四章 样品的全息制备
1 生物大分子的制备 2 蛋白质（酶）的分离纯化
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1 生物大分子的制备
1.1 概述 1.2 生物大分子制备的前处理 1.3 生物大分子的分离纯化 1.4 样品的保存
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1.1 概述
在生命科学高度发展的今天，蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功 能的研究是探求生命奥秘的中心课题，而生物大分子结构与功能的研究，必须
材料的来源无非是动物、植物和微生物及其代谢产物。
选择的材料应含量高、来源丰富、制备工艺简单、 成本低，尽可能保持新鲜，尽快加工处理。
动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分， 绞碎后在适当的溶剂中提取，如果所要求的成分在细 胞内，则要先破碎细胞。
植物要先去壳、除脂。
微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。
② 在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大 分子的稳定性。
③ 固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性。
④ 各种物理性质：如分子大小、穿膜能力、带 电情况、在电场中的行为、离心沉降时的表 现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数。
⑤ 其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的 稳定性和对各种化学试剂的稳定性。
物。
含量极微 步 ⑵ 许多生物大分子在生物材料中的
，分离纯化的
骤繁多、流程长。
⑶ 许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过
防止 失活 程中如何
其
，就是生物大分子提取制备最困难之处。
⑷ 生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等
各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估
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受压的生物大分 子和小分子溶液
浓缩的生 物大分子
小分子溶液
超滤工作原理示意图 36
1.3.4 冰冻干燥
冰冻干燥机是生化与分子生物学实验室必备的仪器之一， 因为大多数生物大分子分离纯化后的最终产品多数是水溶液，要 从水溶液中得到固体产品，最好的办法就是冰冻干燥，因为生物 大分子容易失活，通常不能使用加热蒸发浓缩的方法。
②将混合物置于某一物相（大多数是液相）中，
通过物理力场的作用，使各组分分配于不同的
区域，从而达到分离的目的，如电泳、离心、 超滤等。
目前纯化蛋白质等生物大分子的关键技术是
电泳、层析和高速与超速离心。
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1.2 生物大分子制备的前处理
1.2.1 生物材料的选择
制备生物大分子，首先要选择适当的生物材料。
③酶解法：利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗
牛酶和酯酶等，于37℃，pH8，处理15分钟，可以专
一性地将细胞壁分解。
④有机溶剂处理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶
剂或 SDS（十二烷基磺酸钠）等表面活性剂处理细胞
，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与
研磨法联合使用。
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1.2.3 生物大分子的提取
冰冻干燥是先将生物大分子的 水溶液冰冻，然后在低温和高真空 下使冰升华，留下固体干粉。冰冻干燥的
原理可用溶剂的三相点相图来说明，见下图：
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三相点相图
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1.3.5 分离纯化方法的选择
制备生物大分子的方法可以粗略地分类如下：
① 以分子大小和形态差异为依据的方法：差速 离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过滤等。
⑥ 对其他生物分子的特殊亲和力。
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生物大分子的分离纯化方法多种多样，主要
是利用它们之间特异性的差异，如分子的大小、
形状、酸碱性、溶解性、溶解度、极性、电荷和 与其他分子的亲和性等。
各种方法的基本原理可以归纳为两个方面：
①利用混合物中几个组分分配系数的差异，把它
们分配到两个或几个相中，如盐析、有机溶剂 沉淀、层析和结晶等；
如果没有能够达 首先解决生物大分子的制备问题， 到足够纯度的生物大分子的制备 工作为前提，结构与功能的研究就无 从谈起。然而生物大分子的分离纯化与制备是一件十分细致而困难
的工作。
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与化学产品的分离制备相比较，生物大分子 的制备有以下主要特点：
组成 复杂 ⑴ 生物材料的
极其
，常常包含有数百种乃至几千种化合
②超声波处理法：此法是借助超声波的振动力破碎细胞
壁和细胞器。破碎微生物细菌和酵母菌时，时间要长 一些。
③压榨法：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在
1000×105 Pa～2000×105 Pa 的高压下使细胞悬液通过 一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。 ④冷热交替法：从细菌或病毒中提取蛋白质和核酸时可 用此法。在90℃左右维持数分钟，立即放入冰浴中使 之冷却，如此反复多次，绝大部分细胞可以被破碎。11
⑷ 光线：某些生物大分子可以吸收一定波长的光 ，使分子活化不利于样品保存，尤其日光中的 紫外线能量大，影响最大，样品受光催化的反 应有变色、氧化和分解等，通称光化作用。因 此样品通常都要避光保存。
⑸ 样品的pH：保存液态样品时注意其稳定的pH 范围，正确选择保存液态样品的缓冲剂的种类 和浓度十分重要。
检查NaCl、KCl等。
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1.3.3 超滤
超过滤即超滤 ， 是一种加压膜分离技术， 即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过 一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能 透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到 了部分的纯化。
超滤 可 广泛用于含有各种小分子溶质的各 种生物大分子（如蛋白质、酶、核酸等）的浓 缩、分离和纯化。
温度升高，溶解度加大；
远离等电点的pH值，溶解度增加。
注意：提取时所选择的条件应有利于目的产物溶解度的增加和
保持其生物活性。
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1.3 生物大分子的分离纯化
由于生物体的组成成分是如此复杂，数千种乃至 上万种生物分子又处于同一体系中，因此不可能有一 个适合于各类分子的固定的分离程序，但多数分离工 作关键部分的基本手段是相同的。
“提取”是在分离纯化之前将经过预处理或破碎的细胞置 于溶剂中，使被分离的生物大分子充分地释放到溶剂中，并尽 可能保持原来的天然状态不丢失生物活性的过程。
影响提取的因素主要有： 目的产物在提取的溶剂中溶解度的大小； 由固相扩散到液相的难易； 溶剂的pH值和提取时间等。
通常：
极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂； 碱性物质易溶于酸性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂；
为了避免盲目性，节省实验探索时间，要认真参 考和借鉴前人的经验，少走弯路。
常用的分离纯化方法和技术有：沉淀法（包括： 盐析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀等）、离心、吸附 层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、快 速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。
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1.3.1 沉淀法
沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相而析出的过 程。沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不 仅适用于实验室中，也可用于某些生产目的的制备过 程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶 时最常用的方法。通过沉淀，将目的生物大分子转入 固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分离。
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酶的分离提纯包括三个基本环节：
抽提：即把酶从材料转入溶剂中制成酶溶液；
纯化：即把杂质从酶溶液中除掉或从酶溶液中把酶分离出来；
制剂：即将酶制成各种剂型。
根据酶本身的特性，在分离纯化工作中必须注意下列问题:
(1) 要注意防止酶的变性失活.
(2) 酶的分离纯化的目的是将酶以外的所有杂质尽可能的除去， 因此，在不破坏所需酶的条件下，可使用各种“激烈”的手段。 此外，由于酶和它的底物、抑制剂等具有亲和性，当这些物 质存在时．酶的理化性质和稳定性发生了一定变化，从而提 供了更多条件和方法可供采用。
⑹ 时间：生化和分子生物学样品不可能永久存活 ，不同的样品有其不同的有效期，因此，保存 的样品必须写明日期，定期检查和处理。 52源自2 蛋白质（酶）的分离纯化
2.1 酶活性测定 2.2 酶溶液制备 2.3 酶分离纯化的基本过程 2.4 根据分子大小轻重建立的分离纯化方法 2.5 调节溶解度的分离方法 2.6 按电荷的正负性设计的分离方法 2.7 根据亲和作用建立的纯化方法 2.8 根据稳定性的差异建立的分离纯化方法 2.9 蛋白质（酶）的高效液相色谱分离分析法
化学性质。
④ 生物材料的破碎和预处理。
方案 ⑤ 分离纯化
的选择和探索，这是最困难的过程。
鉴定 ⑥ 生物大分子制备物的均一性（即纯度）的
，要求达到一维电泳一条带，二
维电泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一个峰。
⑦ 产物的浓缩、干燥和保存。 5
要了解生物大分子的物理、化学性质主要有： ① 在水和各种有机溶剂中的溶解性。
② 以溶解度差异为依据的方法：盐析、萃取、 分配层析、选择性沉淀和结晶等。
③ 以电荷差异为依据的方法：电泳、电渗析、 等电点沉淀、吸附层析和离子交换层析等。
④ 以生物学功能专一性为依据的方法：亲和层 析等。
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1.4 样品的保存
生物大分子制成品的正确保存极为重要， 一旦保存不当，辛辛苦苦制成的样品失活、变 性、变质，使前面的全部制备工作化为乌有， 损失惨重，全功尽弃。
沉淀法 的基本原理是根据不同物质在溶剂中的
溶解度不同而达到分离的目的，不同溶解度的产生是
由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差
异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质
及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及
改变溶液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解
度产生明显的改变。
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1.3.2 透析
在生物大分子的制备过程中，除盐、除少量
有机溶剂、除去生物小分子杂质和浓缩样品等都
要用到透析技术。
透析只需要使用专用的半透膜即可完成。保
留在透析袋内未透析出的样品液称为“保留液”， 袋（膜）外的溶液称为“渗出液”或“透析液”。截 留分子量 (MwCO) 通常为10KD左右。
用 1％ BaCl2 检查 (NH4)2SO4，用1％AgNO3
(3) 化学与生物化学方法：
①自溶法：将新鲜的生物材料存放于一定的 pH 和适当
的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如
蛋白酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物
释放出来。
②溶胀法：细胞膜为天然的半透膜，在低渗溶液和低浓
度的稀盐溶液中，由于存在渗透压差，溶剂分子大量
进入细胞，将细胞膜胀破释放出细胞内含物。
影响生物大分子样品保存的主要因素有：
⑴ 空气：空气空气的影响主要是潮解、微生 物污染和自动氧化。
⑵ 温度：每种生物大分子都有其稳定的温度 范围，温度升高10℃，氧化反应约加快数 倍，酶促反应增加1～3倍。
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⑶ 水份：样品本身所带的水份和由空气中吸收的 水份。水可以参加水解、酶解、水合和加合。 加速氧化、聚合、离解和霉变。
计和判断。
比例不同 ⑸ 生物大分子中的各种具体物质的组成
。
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生物大分子的制备通常可按以下步骤进行：
目的 要求 ① 确定要制备的生物大分子的
和
，是进行科研、开发还是要发现新
的物质。
测定方法 ② 建立相应的可靠的分析
，这是制备生物大分子的关键。
文献调研 预备性实验 ③ 通过
和
，掌握生物大分子目的产物的物理