黄芩素对宫颈癌细胞凋亡的影响_卢科莲

*四川省应用基础研究计划项目（编号：14JC0135），四川省泸州市科技计划项目（编号：2014－S －35）
△通信作者。

教授；E －mail ：mxg6639@163．com
黄芩素对宫颈癌细胞凋亡的影响
*
卢科莲1，喻小兰2，夏纪毅3，张宇骄4，毛熙光4
△
1
四川省泸州市妇幼保健院妇产科（646000）；
2
泸州医学院附属中医医院妇产科（四川泸州646400）；
3
泸州医学院
药物与功能性食品研究中心（四川泸州646000）；
4
泸州医学院附属医院妇产科（四川泸州646000）
【摘要】目的
观察不同浓度的黄芩素干预宫颈癌HeLa 细胞后细胞迁移及细胞周期的变化，观察细胞培养
基中具有活性的金属基质蛋白酶－2(MMP －2)、金属基质蛋白酶9(MMP －9)的变化，及MMP －2、MMP －9、金属蛋白酶组织抑制剂2(TIMP2)、
细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、B 细胞淋巴瘤/白血病－2(Bcl －2)相关X 蛋白(Bax )、Bcl －2mRNA 及蛋白水平表达的变化。

方法
体外黄芩素干预Hela 细胞株24h ，分不含黄芩素的无血清
DMEM 高糖培养基培养的细胞为空白对照组，无血清DMEM 高糖细胞培养基中加入终浓度为100μmol /L 的黄芩素为100μmol /L 组，无血清DMEM 高糖细胞培养基中加入终浓度为200μmol /L 的黄芩素为200μmol /L 组，共3组。

镜下观察各组细胞形态及数量的变化、细胞迁移实验检测细胞迁移的改变、流式细胞技术法检测细胞周期发生的变化、RT －PCR 法及Western blot 法检测MMP －2、MMP －9、TIMP2、CyclinD1、Bax 、Bcl －2mRNA 及蛋白水平的表达变化。

结果
黄芩素干预24h 后，与空白对照组比较，两干预组细胞周期G 1期受阻滞，阻滞程度与黄芩素
干预浓度一致(P ＜0.05)，细胞迁移受抑制，随着黄芩素浓度逐渐增加，迁移距离逐渐减少(P ＜0.05)，MMP －2、MMP －9活性受到抑制，抑制程度与黄芩素浓度呈正相关(P ＜0.05)，MMP －2、MMP －9、CyclinD1、Bcl －2的mRNA 及蛋白表达随黄芩素干预浓度增加，呈逐渐降低的趋势(P ＜0.05)，TIMP2、Bax 的mRNA 及蛋白表达趋势随黄芩素浓度增加而逐渐增强(P ＜0.05)。

结论黄芩素干预宫颈癌HeLa 细胞，通过阻滞细胞周期G 1期，抑
制MMP －2、MMP －9活性，上调TIMP2、Bax 的表达，下调MMP －2、MMP －9、CyclinD1、Bcl －2的表达，促进HeLa
细胞的凋亡。

【关键词】黄芩素;宫颈癌HeLa 细胞;金属基质蛋白酶－2;金属基质蛋白酶－9;金属蛋白酶组织抑制剂2;细胞周期蛋白D1;Bax ;Bcl －2
黄芩素是中药黄芩的最主要成分，有研究表明其具有抗炎、抗氧化、免疫调节以及抑制肿瘤等作用［1］
，
并且黄芩水提物可以明显抑制宫颈癌HeLa 细胞的体
外生长，与药物的作用时间和浓度呈正向关系［2］。

细
胞周期和癌变是相互关联的，而细胞周期的失调是细
胞过度增殖而致癌变产生的重要原因
［3］。

肿瘤中基质
金属蛋白酶（MMPs ）和基质金属蛋白酶组织抑制物（TIMPs ）之间的平衡失调是肿瘤进展的一个重要因素
［4］。

细胞周期蛋白D1（CyclinD1）是与细胞周期密
切相关的关键因子，OBA 等［5］
研究表明CyclinD1在肿瘤中高表达，并且向恶性表达转移相关，其作用与直接控制肿瘤的侵袭与转移有关
［6］。

与细胞凋亡相关的主
要有生存和死亡两类基因，而Bcl －2是细胞凋亡中最重要的癌基因之一。

Bcl －2与Bax 可形成异源二聚体，从而维持促凋亡蛋白在细胞内的定位分布，Bax 自身形成的同源二聚体，当胞内Bcl －2较多时，Bcl －2和Bax 的异源二聚体增多，凋亡趋势减弱，当胞内Bax 较多，则自身形成的同源二聚体占主要部分，发生凋亡，所以Bax /Bcl －2的比例决定细胞是否进入凋亡。

2013年8月至2014年5月，本研究通过前期确定黄芩素干
预的最佳时间点，在此时间点，用不同浓度黄芩素干预宫颈癌细胞，观察细胞TIMP2、Bax 、Bcl －2表达的变化，及其与促凋亡的关系，为治疗宫颈癌，阻止宫颈癌的进行性发展提供新的治疗思路。

1材料与方法1．1
材料
HeLa 细胞株由泸州医学院附属医院医学
实验中心馈赠，
DMEM 高糖培养基购于Hyclone 公司，黄芩素购于Chengdu Must Bio －Techology 公司，细胞周期检测试剂盒购于南京凯基公司，
RIPA （强）裂解液及5X 上样缓冲液购于碧云天公司，DNA Marker 、RT －PCR 试剂盒购于天根公司，蛋白Marker 购于Fermentas 公司，蛋白酶抑制剂购于Roche 公司，0.2μm PVDF 膜及ECL 发光液均购于Millipore 公司，
SDS －PAGE 胶所有干粉试剂均购于索莱宝公司，兔抗人MMP －2抗体、兔抗人MMP －9抗体、兔抗人TIMP2抗体、兔抗人Cy-clinD1抗体、兔抗人Bax 抗体及兔抗人Bcl －2抗体均购于美国CST 公司。

MMP －2、
MMP －9、TIMP2、Cy-clinD1、Bax 、Bcl －2引物均由上海生工设计、合成。

1．2方法1．2．1
细胞培养
用含有100mL /L 灭活胎牛血清及
100U /mL 青霉素、100μg /mL 链霉素的DMEM 高糖培养基培养HeLa 细胞。

置于37ħ、50mL /L CO 2细胞孵箱常规培养。

DOI:10.13820/ki.gdyx.2015.03.006
1．2．2细胞分组细胞分0、50、100、200、300μmol/L
浓度及12、24、48h时间干预组。

对数生长期细胞，经由2.5g/L胰酶消化后接种到一次性培养皿中（接种数约1.5ˑ106个/皿），待细胞贴壁并生长24h后，换无血清DMEM高糖培养基培养同步化处理24h。

然后用含有不同浓度黄芩素的无血清DMEM高糖培养基分组培养，每组设3个复孔。

镜下观察发现50μmol/L组在3个时间点与空白对照组差异不明显，200μmol/L组在48h时及300μmol/L组在设立的3个时间点均出现大量细胞凋亡，凋亡率约90%。

所以，最终分组如下：（1）空白对照组：用不含黄芩素的无血清DMEM高糖细胞培养基培养细胞；（2）100μmol/L组：用加入终浓度为100μmol/L的黄芩素的培养基培养；（3）200μmol/L组：加入终浓度为200μmol/L的黄芩素的培养基培养。

1．2．3细胞迁移实验如1．2．2细胞培养，同步化处理细胞后，用清洁、无菌的200μL eppendorf枪头均匀在培养皿底部横竖各划3条相互垂直的直线，每个培养皿分9个观察点。

然后弃培养基，加入含不同黄芩素浓度的培养基进行培养，分别在0、6、12、24h观测细胞迁移的距离。

成像后用Image J软件分析，独立培养不同批次细胞分别进行迁移实验，重复3次。

1．2．4细胞周期的检测干预24h后按照南京凯基细胞周期检测试剂盒说明书步骤进行试验，使用R＆D 流式细胞仪进行检测，仪器自带专用软件进行成图并分析数据。

1．2．5明胶酶谱的检测每组细胞培养上清液与4ˑSample buffer混匀后，室温静置10min备用。

电泳与SDS－PGE胶电泳一样的步骤，根据所测的细胞培养上清液与上样缓冲液混匀液，各泳道上样相同体积20μL的上清液样本，同时在最左边的泳道中加入彩色预染Marker3μL进行电泳。

当溴酚蓝泳动到整块胶中下1/4处时，停止电泳，切胶刀切掉多余的胶，把剩下部分的胶放入DH
2
O中轻柔漂洗2次，5min后/次，转移到复性液中，复性40min，2次。

复性后的胶放入
DH
2
O中漂洗60min，2次。

再把胶放入孵育液中，37ħ孵育过夜。

把胶放置于考马斯亮蓝中染色60 min，然后用脱色液（碧云天公司）脱色，60min后再放
入DH
2
O中漂洗5min。

将胶置于托盘中央，将托盘置于Bio－Rad凝胶成像仪中自动曝光显影。

用Quantity One测定条带平均光密度值，以平均光密度值的高低表示活性的强弱。

不同批次、独立培养细胞的上清液进行试验，重复3次。

1．2．6RT－PCR法检测mRNA表达水平按照天根RT－PCR试剂盒上操作步骤进行PCR实验。

MMP－2序列为：上游引物5'－AGAGTGCAGTAACCAACCAG－3'，下游引物5'－GCACAAACAGGTTGCAGCTC－3'；MMP－9上游引物5'－TTCAGGGAGACGCCCATTTC－3'，下游引物5'－GTCGTCGGTGTCGTAGTTGG－3'；TIMP2上游引物5'－GCGGTCAGTGAGAAGGAAGT－3'，下游引物5'－GAGGGGGCCGTGTAGATAAA－3'；Cy-clinD1上游引物5'－GACTACGGGGAGTTTTGTTGAAGT－3'，下游引物5'－TTCCATGGCTGGGGCTCTTC－3'；Bax上游引物5'－CGTGTCTGATCAATCCCCGA－3'，下游引物5'－GGGCAGAAGGCACTAATCAAG－3'；Bcl－2上游引物5'－CATGCGGCCTCTGTTTGATT－3'，下游引物5'－TGCATATTTGTTTGGGGCAGG－3'；TIMP2上游引物5'－GCGGTCAGTGAGAAGGAAGT－3'，下游引物5'－GAGGGGGCCGTGTAGATAAA－3'，β－actin上游引物5'－TTTCTTGACAAAACCTAACTTGCG－3'，下游引物5'－GGACTTCCTGTAACAATGCATCTC－3'。

采用独立培养的不同批次细胞，重复3次实验。

1．2．7Western blot法检测蛋白表达水平干预结束的HeLa细胞，弃培养基，用预冷、无菌PBS工作液冲洗3次后，加入临时混有蛋白酶抑制剂的裂解液提取蛋白，提取后的蛋白经沸水变性5min后，进行10%的SDS－PAGE胶电泳，以溴酚蓝接近胶底部停止电泳。

电泳结束后进行湿转，转移致0.2μm PVDF膜上，转膜60min。

含5%脱脂奶粉的1ˑTBST液封闭1h，封闭结束后1ˑTBST轻柔漂洗2次，5min/次。

一抗4ħ孵育过夜［稀释比例为MMP－2（1ʒ800）、MMP－9（1ʒ800）、TIMP2（1ʒ500）、CyclinD1（1ʒ1000）、Bax（1ʒ200）、Bcl－2（1ʒ200）］，次日，取出PVDF膜后，1ˑTBST液充分漂洗2次，20min/次，漂洗后放入二抗中［HRP羊抗兔（1ʒ2000）、HRP羊抗小鼠（1ʒ2000）］，室温孵育1h，取出PVDF膜再次充分漂洗4次，5min/次。

放入Bio－Rad凝胶成像仪进行成像并使用Quantity one软件分析结果。

以内参β－actin平均光密度值为标准进行调节。

实验重复3次。

1．3统计学方法使用SPSS16.0统计软件，计量资料采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD分析。

2结果
2．1黄芩素对细胞数量及形态的影响随着黄芩素干预浓度从100、200μmol/L的逐渐增加，与空白对照组比较，细胞数量逐渐减少（658ʃ10.53、158.67ʃ4.98、55.33ʃ3.78），细胞形态从不规则类圆形变成不规则多边长梭形，形态发生明显改变。

见图1。

2．2黄芩素对细胞迁移的影响与空白对照组比较，在相同的处理浓度和时间点观察，细胞迁移距离随黄芩素浓度的增加而减少（P＜0.05），24h时，100μmol/L 和200μmol/L组细胞出现明显凋亡，与细胞分组情况一致。

见图2、表1。

A ：空白对照组；
B ：100μmol /L 组；
C ：200μmol /L 组
图1
各组细胞的形态（ˑ100
）
图2
各组细胞迁移情况
表1
各组细胞迁移距离比较（珋x ʃs ）μm 组别6h 12h 24h 空白对照组324ʃ35．25535ʃ54．99623ʃ61．42100μmol /L 组175ʃ52．17*
340ʃ90．12*
475ʃ69．47*
200μmol /L 组
64ʃ10．7＊
＊
149ʃ12．12＊
＊
214ʃ31．07＊
＊与空白对照组比较*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01
2．3黄芩素对细胞周期的影响空白对照组、
100μmol /L 组到200μmol /L 组，
S 期百分比由34.05%、24.58%到19.41%，相对应地G 1期百分比由64.88%、72.67%到79.19%（P ＜0.05），阻滞的程度随着黄芩素干预浓度的增加而增强。

2．4黄芩素对HeLa 细胞MMP －2及MMP －9活性的影响
与空白对照组相比较，
100μmol /L 组MMP －2、MMP －9活性降低（P ＜0.05）；200μmol /L 组MMP －2、MMP －9活性降低显著（P ＜0.05，P ＜0.01），随着黄芩素干预浓度增强，MMP －2和MMP －9活性受抑制逐渐增强。

见图3、表2。

2．5
黄芩素对细胞MMP －2、MMP －9、TIMP2、CyclinD1、Bax 、Bcl －2mRNA 表达的影响
在黄芩素干预24h 后
，
图3各组细胞MMP －2、
MMP －9的活性变化表2
各组细胞MMP －2、
MMP －9活性比较珋
x ʃs 组别
MMP －2MMP －9空白对照组36．127ʃ1．18439．613ʃ0．318100μmol /L 组32．651ʃ0．571*33．217ʃ0．660*
200μmol /L 组
28．987ʃ1．033*
29．277ʃ0．868＊
＊
与空白对照组比较*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01
MMP －2、MMP －9、CyclinD1、Bcl －2mRNA 水平表达随黄芩素干预浓度的增加逐渐降低，
与空白对照组比较，
100μmol /L 组表达减弱（P ＜0.05）；200μmol /L 组表达下降明显（P ＜0.01），差异有统计学意义。

TIMP2和Bax 随黄芩素干预浓度的逐渐增加表达逐渐增强，100μmol /L 组表达增强（P ＜0.05），200μmol /L 组表达增强显著（P ＜0.01），差异有统计学意义。

见图4、表3。

图4各组MMP－2、MMP－9、TIMP2、CyclinD1、Bax、Bcl－2mRNA 的表达变化
2．6黄芩素对细胞TIMP2、Bax及Bcl－2蛋白表达的影响在黄芩素干预24h后，与空白对照组相比较，100μmol/L组MMP－2、MMP－9、CyclinD1、Bcl－2表达下降，TIMP2、Bax随黄芩素的浓度增加，表达逐渐增强，差异有统计学意义（P＜0.05）；200μmol/L组MMP－2、MMP－9、CyclinD1、Bcl－2显著下降，TIMP2、Bax表达增强明显，差异有统计学意义（P＜0.01）。

见图5、表4。

图5各组MMP－2、MMP－9、TIMP2、CyclinD1、Bax、Bcl－2蛋白表达的变化
表3各组MMP－2、MMP－9、TIMP2、CyclinD1、Bax、Bcl－2mRNA表达量比较珋
xʃs 组别MMP－2MMP－9TIMP2CyclinD1Bax Bcl－2
空白对照组1．11ʃ0．0321．41ʃ0．0210．461ʃ0．0191．190ʃ0．3640．751ʃ0．0221．202ʃ0．038 100μmol/L组0．96ʃ0．072*0．89ʃ0．010*0．732ʃ0．029*0．857ʃ0．023*0．958ʃ0．017*0．982ʃ0．037* 200μmol/L组0．79ʃ0．027＊＊0．67ʃ0．039*1．670ʃ0．018＊＊0．579ʃ0．044＊＊1．220ʃ0．054＊＊0．651ʃ0．038＊＊与空白对照组比较*P＜0.05，＊＊P＜0.01
表4各组MMP－2、MMP－9、TIMP2、CyclinD1、Bax、Bcl2蛋白表达量比较珋
xʃs 组别MMP－2MMP－9TIMP2CyclinD1Bax Bcl－2
空白对照组1．390ʃ0．0171．545ʃ0．0290．693ʃ0．1391．674ʃ0．0260．491ʃ0．0161．401ʃ0．009 100μmol/L组0．870ʃ0．011*0．874ʃ0．022*1．069ʃ0．023*0．973ʃ0．012*1．159ʃ0．025*0．998ʃ0．021* 200μmol/L组0．695ʃ0．023＊＊0．552ʃ0．013*1．249ʃ0．021＊＊0．344ʃ0．021＊＊1．307ʃ0．023＊＊0．538ʃ0．023＊＊与空白对照组比较*P＜0.05，＊＊P＜0.01
3讨论
宫颈癌的发生主要是与HPV感染引起机体内源性因素产生影响，相关癌基因激活、抑癌基因失活及机体免疫调节机制失衡等病理改变，引起细胞增殖与凋亡的异常，导致组织癌变［7］。

黄芩素具有较大范围的抗肿瘤活性，现有研究表明主要集中在影响花生四烯酸系统代谢、抑制细胞增殖和细胞周期，诱导肿瘤细胞凋亡以及抗肿瘤新生血管生成方面［8］，但是具体作用机制并未阐明。

在多种肿瘤疾病中，都提示MMP－2、MMP－9参与其中，并且与其浸润、侵袭程度有密切的关系［9－10］。

国内外研究发现在体外培养的肺癌细胞中，TIMP2主要通过抑制MMP－2而对肺癌细胞的转移和血管生成起到抑制作用［11－13］。

黄芩素促宫颈癌Hela细胞的作用过程中MMP－2、MMP－9与TIMP2是否受到其影响？并且MMP－2和MMP－9活性是否也发生改变？实验结果表明，MMP－2、MMP－9活性受到黄芩素的抑制，而且三者的表达与其他研究者实验结果一致。

在对肿瘤的研究中发现，细胞周期各个阶段的调节因子都有不同程度的异常，肿瘤的形成主要是G
1
/S期的转换失调引起的，所以G
1
期的调节因
子与癌变的关系最密切，而CyclinD1基因编码的Cy-
clinD1蛋白在细胞周期G
1
/S期的转换中发挥重要的调控作用［14］。

研究黄芩素对宫颈癌HeLa细胞的作用，就有必要研究CyclinD1的变化。

前期实验结果表
明［15］，细胞周期G
1
期受到阻滞的情况下，CyclinD1的表达下降。

郑虹等［16］发现宫颈癌中Bax蛋白表达水平明显低于正常宫颈组织（P＜0.01），表明Bax参与宫颈癌的发生和发展。

Bcl－2、Bax基因蛋白通过调节细胞凋亡参与宫颈癌的发生［17］。

本实验结果表明，在黄芩素促宫颈癌HeLa细胞凋亡的过程中，Bax与Bcl－2呈反向变化，与郑虹等［16］实验结果一致。

本研究结
果表明，黄芩素可通过阻滞细胞周期G
1
期，抑制其迁移，下调MMP－2、MMP－9、CyclinD1、Bcl－2的表达，上调TIMP2及Bax的表达，实现促HeLa细胞凋亡的作用。

本研究表明黄芩素能通过减弱MMP－2、MMP－9活性，降低各研究因子的表达促进宫颈癌HeLa细胞的凋亡，但是MMP－2、MMP－9与各因子之间的作用先后关系并不清楚。

所以，后期考虑通过阻断MMP－2、
MMP－9后观察其他因子的变化，明确其在黄芩素促
其凋亡过程中的关系。

综上所述，黄芩素能够显著促进HeLa细胞体外凋亡，阻滞细胞周期G
1
期，相关信号通路的激活，使MMP－2、MMP－9、CyclinD1、Bcl－2的表达降低，TIMP2、Bax表达增高，达到抑制宫颈癌的作用。

本研究提示，黄芩素可用于宫颈癌的治疗，主要是通过引起
MMP－2和MMP－9活性的降低，阻滞细胞周期G
1
、上调TIMP2的表达来抑制MMPs对细胞外基质的降解，同时抑制其迁移、侵袭作用，保护细胞外基质并激活相关的凋亡因子，从而促进HeLa细胞凋亡来实现，为临床宫颈癌的防治提供的新的思路和理论依据。

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（收稿日期：2014－05－04编辑：朱绍煜
櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆
）医学论文中常见的对照形式
对照的形式有多种，可根据实验研究的目的和内容加以选择，常用有下列几种:(1)空白对照:对照组不施加任何处理因素。

例如，观察某种疫苗预防某种传染病的效果，试验组的一批儿童接种该疫苗，对照组的一批儿童不接种该疫苗，也不接种任何其他免疫制品，处理因素完全空白。

最后对比两组血清学和流行病学的观察指标的效果。

本法一般很少用，只用于那些不予治疗但不影响预后的疾病，多为自限性疾病。

(2)试验对照:对照组不施加处理因素，但施加多种非处理因素。

如观察赖氨酸对儿童发育的影响，试验组儿童的间食加赖氨酸的面包，对照组儿童的间食为不加赖氨酸的面包。

处理因素是赖氨酸，非处理因素的面包量两组是相同的。

(3)标准对照:不设立专门的对照组，而是用现有标准值或正常值做对照，或在治疗效果观察类研究中，用某种现公认的常规疗法作对照。

如试验指标脉搏的对比，即可用正常值72次/min作参照。

(4)自身对照:对照与试验在同一受试者身上进行，如用药前后的对比，先用A药后用B药的对比，都是属于自身对照。

(5)历史对照:与文献报道的类似研究作对比。

采用历史对照可信性较差。

因为时间、地点、条件的变化，采用历史对照时，很难保证非处理因素能有一定的可比性，所以应尽量少用。

只有对那些非处理因素影响较小的少数疾病及公认的难以治愈的疾病才适于做文献历史对照，使用时应特别注意资料的可比性。

本刊编辑部DOI:10.13820/ki.gdyx.2015.03.007。