质粒提取,转化和筛选

α 互 补 的 检 测
含重组体的为白色菌落，不含者为蓝色菌落
DNA重组技术
DNA recombination technology
基本策略
目的基因的获取 质粒的提取制备
体外重组（连接）细胞
筛选
筛选阳性转化子
扩增
获得子代重组DNA
实验一
碱裂解法小量提取质 粒 DNA
质粒 (plasmid)
定义：是存在于细菌染色体外的双链环状DNA。 具有可自主复制、传给子代、也可丢失及在 细菌之间转移等特性，与细菌的遗传变异有 关。 作用：携带外源基因进入细菌中扩增或表达的 主要载体，在基因克隆、表达中具有重要作 用。
1% SDS (十二烷基硫酸钠) 溶液III：29.4g乙酸钾 11.5ml冰乙酸 H2O至100ml
TE溶液：10 mmol/L Tris-Cl, pH 8.0 1 mmol/L EDTA, pH 8.0
实验二 氯化钙法进行质粒转化及筛选
一、原理
细菌处于0 ℃，在CaCl2低渗溶液中，菌体细胞 膨胀成球形，DNA则与CaCl2形成抗Dnase的羟 基－磷酸钙复合物粘附于细胞表面，经42 ℃短 时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物， 在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并 分裂增殖，重组子的基因在被转化的细菌中得到 表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转 化子。
Ⅱ 质粒转化
1. 加10 μl 质粒DNA溶液至100 μl 感受态细胞中， 温和混匀，置于冰上20 min 2. 42 ℃热冲击90s，迅速放回冰上，将细胞冷却 2~3 min，加入500 μl LB培养基。 3. 将转化后细菌放置37 ℃，200 rpm 振荡培养45 min，让细菌中的质粒表达抗生素抗性蛋白。
纯化得到质粒DNA。
碱裂解法提取质粒DNA主要步骤
1.细菌的培养
2.细菌的收集和裂解 3.质粒DNA的分离和纯化 4.质粒的鉴定
操作过程
1. 取1.5 ml过夜菌液于EP管中，12 000 r/min离心 1min，弃去上清液。 2. 加100 μl 溶液Ⅰ，剧烈震荡使菌体悬浮均匀， 室温放置5min 。
室温放置10分钟，12 000r/min离心10分钟，沉 淀DNA 。 7.弃上清，挥干，所得DNA溶于30μlTE中，用于 后续试验。
溶液I： 50 mmol/L葡萄糖 25 mmol/L Tris-Cl pH 8.0 10 mmol/L EDTA pH 8.0
溶液II： 0.2 mol/L NaOH
3. 加200 μl 溶液Ⅱ（现配现用），轻柔颠倒混匀 4~6次，室温放置5min 。 4. 加150μl预冷溶液Ⅲ ，轻柔颠倒混匀4~6次，冰 上放置10分钟。
5. 12 000 r/m离心10 分钟(如果上清液仍然浑浊，
可将上清液移出，再次离心5分钟）。
6. 吸出上清液，加2.5倍体积的无水乙醇，混匀，
Ⅲ 涂板筛选
1. 取100 μl 转化混合物铺于LB+Amp（含有诱导 物 IPTG 及生色底物 X-gal）平板上，室温放置 至液体被琼脂全部吸收，倒置平板于37℃培养 12~16 h(过夜)
2. 取出平板，观察平板上菌落的颜色和形状，挑 选白色克隆进行PCR和质粒酶切验证。
白色克隆特点：灰白，扁平，湿润
碱裂解法提取质粒DNA实验原理
在碱性环境中，细菌膜破裂释放内容物。染
色体DNA变性分开，而质粒DNA虽变性但仍处于
缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的
条件下，染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质 在SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可
溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染
色体DNA、RNA及蛋白质，最后用酚、氯仿抽提