氯霉素兽药纯度标准物质的研制

氯霉素兽药纯度标准物质的研制
张庆合;李红梅;杨梦瑞;何雅娟;郭卫
【摘要】对市售氯霉素原料经提纯后研制兽药标准物质,采用熔点、红外和质谱法对提纯后氯霉素样品进行定性鉴定,采用高效液相色谱法进行定量分析.探讨了高效
液相色谱法分析检测氯霉素兽药的分离与检测条件.试验发现氯霉素在甲醇溶剂中
不稳定,在乙腈溶剂中稳定性提高.采用多家实验室联合分析的方法对标准物质进行
定值.研制的氯霉素标准物质的纯度为99.7%,定值结果不确定度为0.3%(k=2).
【期刊名称】《化学分析计量》
【年(卷),期】2008(017)001
【总页数】4页(P4-7)
【关键词】氯霉素;标准物质;纯度
【作者】张庆合;李红梅;杨梦瑞;何雅娟;郭卫
【作者单位】中国计量科学研究院化学所,北京,100013;中国计量科学研究院化学所,北京,100013;中国计量科学研究院化学所,北京,100013;中国计量科学研究院化
学所,北京,100013;新疆计量测试研究院,乌鲁木齐,830011
【正文语种】中文
【中图分类】O6
氯霉素(Chloramphenicol)属广谱抗生素，曾在畜牧业中广为应用，但有较强的副作用和毒性作用，在动物可食组织中的残留会通过食物链传给人类，长期微量摄入，
不仅使人体肠道正常菌群失调，而且还会引起多种疾病，对人类的健康造成危害。

包括我国在内世界上许多国家禁止食用动物使用氯霉素，并规定了在畜产品中氯霉素不得检出[1]。

近几年，一系列的相关限量标准和检测方法标准陆续实行[2-7]，使得氯霉素已经成为实验室常规检测项目之一。

但目前为止，国内还没有氯霉素的标准物质。

为了保证测量结果的可溯源性以及量值的准确可靠，氯霉素标准物质的研制显得尤为迫切。

因此笔者研究了氯霉素标准物质，并对定值不确定度进行了评定。

1 实验部分
1.1 主要仪器与试剂
高效液相色谱仪：Agilent 1100型，包括四元低压梯度输液泵、二极管阵列检测器(DAD)、在线脱气和柱温控制系统、自动进样器、仪器控制与数据采集和处理工作站，美国Agilent公司；
分光光度计：MPS-2000型，日本岛津公司；
高效液相色谱/四极杆-飞行时间/串联质谱仪：Micromass Q-ToF micro型，美国Waters公司；
傅立叶变换红外光谱仪：AVATAR型，美国尼高力公司；
WRR熔点仪：WRRE型，上海物光公司；
热重分析仪：Pyrir1型，美国P-E公司；
甲醇：色谱纯，美国Merke公司；
乙腈：色谱纯，美国J.T.Baker公司；
乙酸：分析纯，纯度99.5% ，北京化工厂；
氯霉素纯品：市售氯霉素经提纯处理制得；
实验室用水为二次蒸馏水。

1.2 液相色谱实验条件
色谱柱：Agilent Zorbax Extend C18(150 mm×4.6 mm i.d.，5 μm)；柱温：30℃；流动相：甲醇-0.2%乙酸(体积比35∶65)，流量为1.0 mL/min；样品浓度：
1 mg/mL(溶剂为乙腈)；进样体积：5 μL；检测波长(UV)：280 nm。

2 结果与讨论
2.1 定性分析
图1为氯霉素样品的质谱图，由图1得到的相对分子质量信息与氯霉素的相对分
子质量相符合。

在WRR熔点仪上测得氯霉素的熔点为150.3～150.5℃，与药典
要求相符合。

图2和图3分别是氯霉素样品和氯霉素标准品(NIST)的红外光谱图，经分析比较图2和图3一致。

经以上3种方法测试，证明所得纯品为氯霉素。

图1 氯霉素样品的质谱图
图2 氯霉素样品的红外光谱图
图3 氯霉素标准样品的红外光谱图
2.2 定量方法及条件
采用高效液相色谱法对氯霉素进行定量分析，通过试验优化了流动相的酸度、组成及检测波长等条件。

2.2.1 流动相酸度
在液相色谱条件中，流动相的选择和配比非常重要，直接影响色谱峰的分离情况和保留时间。

目前关于氯霉素HPLC分析主要采用反相色谱法，在流动相中添加一
定量的乙酸作为流动相调节剂。

试验比较了流动相中乙酸含量分别为0%、0.1%、0.2%、0.4%时氯霉素纯品的分离情况。

当流动相中不含有乙酸时，主峰与其附近的小杂质峰不能分离；流动相中乙酸含量在0.1%～0.4%范围内时，随着乙酸浓度的升高，主峰的保留时间缩短，而峰宽、塔板数以及色谱峰面积百分含量均变化不大，且主峰的对称性几乎没有影响，因此实验选用0.2%的乙酸。

2.2.2 流动相有机溶剂的含量
试验比较了流动相甲醇体积分数分别为30%、35%和40%时检测氯霉素的分离谱图。

结果表明，随着流动相中甲醇含量的提高，保留时间缩短，但是主峰与其附近的杂质峰的分离度逐渐降低，当甲醇与0.2%的乙酸体积比为35∶65时，主峰与
杂质峰完全分离，主峰保留时间约为7.3 min。

2.2.3 检测波长选择
为了全面检测氯霉素样品中杂质与主成分在不同波长下响应差异，采用二极管阵列检测器选择5个波长(210、235、254、280、300 nm)分别检测。

结果表明，在
不同波长下检测的色谱峰数量和相对大小存在一定差异，其中280 nm检测色谱
峰数量为6个，而其它波长检测的色谱峰数量都比较少，在210 nm时基线噪声
比较大，是由于流动相甲醇和乙酸在该波长存在一定吸收。

该结果可能是由于氯霉素样品中主要杂质均为与其结构或官能团比较相似的化合物所致。

因此，氯霉素标准物质的定值波长选择280 nm。

2.2.4 采用不同溶剂时氯霉素溶液的稳定性
试验比较了甲醇和乙腈配制的氯霉素溶液的稳定性，同一样品溶液新配制和在4℃冰箱避光储存10 天之后分别检测的色谱图如图4所示。

由图4可以明显看出，在1.5 min有一杂质峰明显增加，可能为2-氨基-1-(4-硝基苯)-1，3-丙二醇(二醇物)。

表1为分别采用甲醇或者乙腈为溶剂配制1.00 mg/mL的氯霉素溶液，不同时间
归一化方法检测主成分含量的变化情况。

结果表明，采用甲醇为溶剂配制的氯霉素溶液中氯霉素分解，而乙腈溶剂配制氯霉素溶液在相同时间内稳定。

因此，实验采用乙腈溶解氯霉素样品。

A—新配制； B—10 d之后图4 氯霉素甲醇溶液稳定性实验色谱图表1 甲醇和乙
腈溶剂中氯霉素纯度值变化情况
时间/d纯度/%甲醇为溶剂乙腈为溶剂
099.8199.81199.7999.80399.0699.80698.3199.80897.7499.801097.4099.8
2.3 标准物质的均匀性检验
从研制的标准物质中随机抽取15个包装，进行瓶间均匀性检验；从其中任意一瓶中取出7个子样，进行瓶内均匀性检验，对均匀性测量数据进行F检验和t检验，检验结果列于表2。

表2 氯霉素标准物质均匀性检验结果项目XsF检验值t检验值瓶间(n=15)瓶内(n=7)99.81%99.82%0.0060.0051.440.01
经查表得，F0.05(14，6)=3.96，tα=2.09，F≤F0.05(14，6)，t≤tα，证明研制的标准物质瓶内和瓶间样品均匀一致。

2.4 标准物质的稳定性考察
稳定性是标准物质特性量值随时间变化的度量，本标准物质稳定性的考察，按先密后疏的原则，对在不高于4℃冰箱中避光冷藏保存的样品定期抽样，用高效液相色谱法检测其纯度，每次取4～6个包装，每个包装取一个子样，测定2～3次，取其平均值，检测结果列于表3。

结果表明，在1 年的时间内，所研制的氯霉素标准物质纯度的变化均在定值结果不确定度范围内，说明稳定时间至少1 年。

表3 氯霉素标准物质稳定性检验结果检测时间
2006.042006.052006.062006.102007.06检测结果
/%99.8199.8099.8299.8299.81
2.5 标准物质定值
按照“国家一级标准物质技术规范”的要求，采用5家实验室合作定值，所采用的定值方法为液相色谱法(面积归一化法)。

每家实验室均从全部样品中随机抽取10个包装，从每瓶中任意取出1～2个子样用液相色谱法测量纯度，对测得的数据经检验符合正态分布后，计算5家测定结果的平均值及标准偏差，估算不确定度，得出氯霉素纯度的定值结果，列于表4。

表4 氯霉素标准物质纯度定值结果定值单位编号测定值/%(n=10)sU0.01/%平均
值
/%199.820.010.07299.820.020.07399.630.060.2099.77499.790.060.20599.78 0.020.07
采用热重法(TG法)进行水分测定，氯霉素中水分含量为0.11%。

取各实验室定值结果的总平均值99.77%减去水分含量0.11%作为纯度定值结果，即研制的氯霉素标准物质的纯度为99.7%。

2.6 标准物质定值结果的不确定度
液相色谱多家定值结果不确定度由3部分组成：
(1)将各家定值结果的平均值作为一组新的测量值，取该组测量值的相对标准偏差作为一部分来源u1，其值为0.08%；
(2)多家定值所用方法的重复性引入的不确定度，即取各家定值结果中最大的相对标准偏差u2，其值为0.06%；
(3)杂质成分响应因子引入的不确定度u3，因为经过提纯制备之后的氯霉素中的杂质可能是与其结构相似的化合物，因此忽略其响应因子差异，仅考虑不同杂质组分在试验检测波长下响应差异引入的不确定度：
=0.02%
其中Bimaxλ为在5个检测波长下杂质组分i的最大百分比含量，Bi定值λ为定值波长(280 nm)下杂质组分i的百分比含量。

u3-i为杂质组分i的不确定度分量，评定结果列于表5。

表5 氯霉素检测波长引入不确定度评定λ/nm各杂质组分色谱峰面积百分比
/%2.235min4.157min5.905min9.917min26.98min210-----235-----254---0.0620.1212800.0030.0070.0030.0580.099300---0.0520.098u3-i---
0.0040.022u30.02
注：“-”表示未检出色谱峰。

对上述3分量u1、u2、u3合成得：
水分测定值的不确定度为0.11%。

因此，氯霉素标准物质定值的不确定度：
扩展不确定度(k=2)：U=kuc=2×0.15%=0.3%
综上所述，研制的氯霉素标准物质的纯度为99.7%，扩展不确定度为
U=0.3%(k=2)。

参考文献
[1] 吴晓丰，杨鹭花.氯霉素残留的危害及其检测方法[J].动物医学进展，2004，25(3)，41-43.
[2] GB/T 18932.19-2003 蜂蜜中氯霉素残留量的测定方法液相色谱-串联质谱法[S].
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[4] SB/T 10386-2004 畜禽肉中氯霉素的测定[S].
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