实验二、简单染色法课件

高倍镜观察
❖将高倍物镜转至镜筒下方 (在转换物镜时，要 从侧面注视，以防低倍镜未对好焦距而造成镜 头与玻片相撞) 。
❖ 调节光圈和聚光镜，使光线亮度适中，再仔细 转动微调螺旋，调节焦距，获得清晰物象，移 动推动器选择最满意的镜检部位，待油镜观察。
物镜的同焦现象（P44）
油镜的工作原理（P42）
➢ 显微镜 ➢ 酒精灯 ➢ 载玻片 ➢ 接种环 ➢ 香柏油 ➢ 二甲苯 ➢ 擦镜纸 ➢ 生理盐水等。
作业
• 实验报告
（结果部分：绘图说明金黄色葡萄球菌和枯草芽 孢杆菌的形态特征，注明观察时使用的物镜及 放大倍数）
下一个实验：革兰氏染色法
1、涂片
1. 取一块干净的载玻片，平放，在载玻片中央 滴一小滴生理盐水；
❖ 分辨率（分辨力）是指显微镜能辨别物体两
点间最小距离的能力。
式中 =光波波长
能辨别两点间最小 距离
2N A
❖ 数值孔径，即光线投射到物镜上的最大角度 (称镜口角)的一半正弦，乘上玻片与物镜间 介质折射率所得的乘积，可用下列公式表示：
其中
N Ans in
2
n 介质折射率 最大入射角，即镜口角
2、显微观察
观察程序ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ下：
❖放置观察标本 ❖低倍镜观察 ❖高倍镜观察 ❖油镜观察
低倍镜观察
❖ 下降低倍物镜，从侧面注视调节，使其接近标 本。
❖ 双眼看目镜，慢慢旋转粗调节螺旋使镜筒缓慢 升起，至视野内出现物象后，改用细调节螺旋， 上下微微转动，直至视野内获得清晰的物象。
❖ 慢慢移动玻片夹推动器，寻找要观察的部位， 置于视野中心，观察、记录结果，并准备换高 倍镜观察。
革兰氏染色法：不仅能观察到细菌的形态，而且还可 将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰 氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色（复染颜色） 的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。细菌对革兰氏染色的 不同反应，是由于它们细胞壁成分和结构不同而造成的。
材料
1. 菌种 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌 2. 染色剂 3. 仪器或其他用具：
微生物染色原理
❖在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细 胞通常带负电荷；碱性染料在电离时， 其分子的染色部分带正电荷，易与细胞 结合使其着色。
❖细胞处于酸性条件下（如细菌分解糖类 产酸），所带正电荷增加，可采用酸性 染料染色。
染色方法
(二)复染色法 用两种或多种染料染细菌，目的是为了鉴别不同性质
的细菌，所以又叫鉴别染色法。主要的复染色法有革兰氏 染色法和抗酸性染色法。
显微镜使用操作步骤
1、观察前的准备 2、显微镜观察 3、显微镜使用完毕后的处理
1、观察前的准备
❖ 仔细阅读显微镜使用说明书 ❖ 取镜（一手握镜臂，一手托底座） ❖ 显微镜的放置（平放，距边缘约10cm） ❖ 熟悉显微镜，检查显微镜 ❖ 调节光源（光线均匀，亮度适宜） ❖ 调节双筒显微镜的目镜 ❖ 调节聚光器数值孔径 ❖ 检查显微镜物镜、目镜、聚光器
注意：热固定温度不宜过高，否则会改变甚至破 坏细胞形态。
4、染色
❖将热固定的细菌涂片平放于在载玻片架 上，滴加染液于涂片上（染液刚好覆盖 涂片薄膜为宜）。
❖染色时间：
➢吕氏碱性美蓝染色1~2min； ➢石炭酸复红染色约1min ➢草酸铵结晶紫染色约1min。
6、干燥
❖自然干燥：平放于室温，自然干燥；
1、增加照明亮度 2、增加显微镜的分辨率
1、增加照明亮度
❖ 使用油镜时，油镜与其他物镜的不同是载玻片 与接物镜之间，不是隔一层空气，而是隔一层 油质，称为油浸系。
❖ 如果玻片与物镜之间的介质为空气，则称为干 燥系。
❖一些物质的折射率：
水
1.33
玻璃
1.52
空气
1.0
香柏油
1.515
2、增加显微镜的分辨率
❖ 香柏油的折射率大于空气和水，因此，它作介质 时，数值孔径值高于低倍镜和高倍镜。
❖ 数值孔径值越大，显微镜最小可分辨距离越小， 即分辨率越高。
使用完毕后的处理
❖ 观察完毕，上升镜筒，取下标本片。 ❖ 先用擦镜纸擦去镜头上的油，然后再用擦镜纸沾
少量二甲苯擦去镜头上残留油迹，最后再用擦镜 纸擦去残留的二甲苯。 ❖ 用绸布擦净显微镜的金属部件。 ❖将各部分还原，关闭电源, 将接物镜转成八字形， 再向下旋。罩上镜套，然后放回镜箱中。 ❖ 填写显微镜使用记录。
❖吹干：用电吹风冷风或低温热风吹干；
❖吸干：平放在一张吸水纸上，上面覆盖 一张吸水纸，将细菌涂片两面水分吸干。
7、镜检
• 涂片干后镜检。 • 防止水的折射，以便于观察。
显微镜的基本结构（P41）
1. 物镜转换器 2. 物镜 3.标本夹 4.载物台 5.聚光器 6. 彩虹光圈 7.光源 8. 镜座 9. 电源开关 10. 光源滑动变阻器 11. 粗调螺旋（粗调节器） 12. 微调螺旋（细调节器） 13. 镜臂 14.镜筒 15.目镜 16.玻片夹推进器
实验二 细菌的简单染色
目的要求
1. 学习微生物涂片、染色的基本技术，掌 握细菌的简单染色法。
2. 初步认识细菌的形态特征。
3. 学习显微镜（油镜）的使用方法，熟悉 无菌操作技术。
微生物染色原理
• 染料是一类苯环上带有发色基团和助色基 团的有机化合物。前者赋予染料颜色特征， 后者使染料能形成盐。
• 常用的微生物细胞染料都是盐，分酸性染 料和碱性染料两大类：美蓝（即亚甲蓝）、 结晶紫、碱性复红、番红（即沙黄）、孔 雀绿等都属于碱性染料；酸性复红、伊红 及刚果红属于酸性染料。
微生物染色原理
❖ 由于微生物细胞含有大量水分，对光线的吸收和反射与水溶 液的差别不大,机体是无色透明的，与周围背景没有明显的反 差,在普通光学显微镜下不易识别，必须对它们进行染色，使 经染色后的菌体与背景形成明显的色差,从而能更清楚地观察 到其形态和结构。
❖ 微生物细胞是由蛋白质、核酸等两性电解质及其他化合物组 成。所以，微生物细胞表现出两性电解质的性质。两性电解 质兼有碱性基和酸性基，在酸性溶液中离解出碱性基呈碱性 带正电。在碱性溶液中离解出酸性基呈酸性带负电。
2. 用接种环无菌操作从琼脂斜面上挑取适量菌 苔；
3. 将挑取的菌苔沾入载玻片中央生理盐水中混 匀并涂成薄膜。
注意：载玻片要洁净无油迹；滴生理盐水和取菌 不宜过多；涂片要涂抹均匀，不宜过厚。
3、固定
❖ 手持(木夹夹住)已干燥的涂有菌膜的载玻片， 涂面朝上，在酒精灯火焰上通过2~3次。
原理：加热使细菌细胞的蛋白质凝固，从而固定 细菌细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上。