冷冻电镜技术与基于质量源于设计理念的药品研发的若干思考

冷冻电镜技术与基于质量源于设计理念的
药品研发的若干思考
2017年10月4日，瑞士洛桑大学教授雅克·杜伯谢（Jacques Dubochet）、美国哥伦比亚大学的约阿希姆·弗兰克（Joachim Frank）和英国剑桥大学的理查·亨德森（Richard Henderson）凭借在冷冻电镜技术建立过程中发挥的开创性作用获得了2017年度诺贝尔化学奖。

在诺贝尔奖盛名之下，世界对于基于冷冻电镜技术的结构生物学研究热情被彻底点燃。

在结构生物学研究领域中，冷冻电镜在解析生物大分子三维结构方面发挥着至关重要的作用，是X 射线结晶学和核磁共振（NMR）无法替代的一项重要技术[1]。

早期人们利用X 射线结晶学和核磁共振解析药物底物和药物靶点结构、机制，但随着生物制品尤其抗体大分子药物的发展，冷冻电镜技术越来越多地应用于活性生物分子结构的解析中。

1 冷冻电镜技术介绍
一直以来，科学家们不断探究生物分子的结构与功能，以期逐步加深对生命的认知。

结构生物学是一门专注于生物大分子结构解析的学科，通过对生物大分子近原子分辨率结构的解析，直观地了解生物分子所参与的生命过程，为生命过程的阐释和治疗性药物的开发奠定了分子基础。

目前结构生物学研究的方法主要有X 射线晶体衍射、冷冻电镜和核磁共振等技术[2]。

X 射线晶体衍射和核磁共振由于分别受到样品需要体外结晶和分子量上限的限制，其用于分子结构解析的弊端日益凸显。

冷冻电镜作为生物分子结构解析方法的后起之秀，在生物分子结构解析方面具有不需要结晶、能够进行超大分子及复杂复合物结构解析、通过快速冷冻样品获得近天然状态的高分辨率三维
结构等独特优势，受到了众多结构生物学科学和药物研发研究工作者们的青睐。

联合应用结构解析的三大主要技术（X射线晶体衍射、冷冻电镜和核磁共振），能解析超大复合物的构成与构象以及高分辨率的三维结构。

冷冻电镜用于生物样品三维结构解析，包含单颗粒分析、微电子衍射和冷冻电子断层扫描3种技术。

冷冻电镜单颗粒分析技术（cryo-EM SPA）是一种以单颗粒形式分析生物分子组装的新方法，通过将负染电镜筛选获得的合适浓度的生物分子样品快速冷冻，使生物大分子以近天然状态存在于无定形冰中，然后进行冷冻样品的筛选、数据收集和三维结构解析，从而获得高分辨率的生物分子结构，其工作流程见图1。

冷冻电镜单颗粒分析技术能够在分子水平上研究生物功能分子及其复合物的构象变化和动力学相互作用的不同阶段。

例如，冷冻电镜单颗粒分析技术结合传统结构生物学技术（如X 射线晶体衍射和核磁共振）获取结构信息，完成参与转录、mRNA 剪接和翻译等基础生命过程的重要分子的研究[2]以及新的药物靶点的发现和确认。

图1 冷冻电镜单颗粒分析技术工作流程图
微电子衍射技术（MicroED）利用高灵敏度的冷冻电镜连续旋转只有约10 层分子厚度的纳米晶体，并在快速相机上采集衍射成像，确定近原子分辨率的分子结构[3]。

该技术既可用于生物大分子结构解析，也可用于小分子化合物的结构解析。

冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）是将样品固定在玻璃态冰中，在倾斜状态下成像，得到一系列二维图像；然后组合成三维图像进行重建，获得生物大分子和细胞的高分辨率成像[4]。

2 冷冻电镜助力快速、高效的新药研发
2.1 正确选择药物靶点的重要性
从19世纪中叶制药工业兴起到20世纪50～60年代分子生物学普及，药物的研发基于化合物，即通过自然提取或人工合成获取化合物，再去研究这些化合物能用于哪些疾病的治疗，这一时期出现了世界上第一个广泛有效的抗生素物质—青霉素[5]，挽救了无数人的生命。

但是，化合物在人体内的作用机制不明确，也导致了重大的医疗事故，如1957年沙利度胺在欧洲被批准用于抗妊娠反应，截至1961年导致出现约15 000 名“海豹儿”[6]，该药在全球市场被召回。

分子生物学兴起后，随之兴起的还有基于靶点的药物发现[7]。

即利用新的技术手段加深对生命过程的认知和从分子水平理解人类疾病的发病机制，通过对疾病的发病机制理解，获取正确的药物靶点，进而进行高精准性、强针对性和低毒副作用的基于靶点的药物研发。

在进入实验室候选药物开发阶段前，靶点的选择和验证不仅对帮助确认具有前景的药物至关重要，而且能够提高研发过程的效率和有效性。

因此，正确的靶点选择直接影响后续药物的相关研究。

2016年，Rita Santos 等统计了美国FDA 批准的1578 种药物针对的药物靶点，共获得893 种人类和病原体衍生的生物分子[8]。

根据所属的家族，这些靶点分子可分为G 蛋白偶联受体、离子通道蛋白、蛋白激酶、核激素受体和其他。

其中，靶向G 蛋白偶联受体药物多达460 种，约占总获批药物数量的30%[9]。

G 蛋白偶联受体广泛分布于中枢神经系统、免疫系统、心血管、视网膜等器官和组织，与其相关的细胞内通路调节一旦发生异常，将导致一系列的疾病。

在众多药物靶点中，G 蛋白偶联受体无疑是备受青睐的药物靶点之一。

采用冷冻电镜单颗粒分析技术解析高分辨率的G 蛋白偶联受体结构是一个快速发展的领域。

该技术不需要结晶、能够在近天然状态进行高分辨率的结构解析，使之前无法获得的靶点结构成为可能，并有利于发现更多的靶点，为基于靶点的药物研究奠定基础。

2.2 基于靶点的药物发现
分子生物学兴起后，基于靶点的药物发现逐渐成为主流新药研发模式[10]。

通常通过结构生物学方法获得靶点及靶点-受体相互作用的结合位点。

将靶点结构和结合位点作为模型进行虚拟筛选，并通过高通量的方法获得可能结合的潜在分子，并进一步通过结构生物学方法直接解析靶点-潜在分子的高分辨率结构，进行潜在分子的确认。

2014年，冷冻电镜“分辨率革命”使其成为获得优于3Å 结构的常规技术[11]。

高分辨率的结构能够清晰地描绘靶点与潜在分子相互作用的信息，包括结合表位、配体手性等，为潜在化合物的结构改造提供了指导[12]。

1988年诺贝尔生理学或医学奖获得者之一詹姆斯·布莱克（James Whyte Black）认为：发现一种新药最富有成效的基础是从一种老药开始[13]。

于现代药物研发而言，随着科技的不断进步，剖析老药发挥作用的药物靶点以及老药-药物
靶点的作用机制，可为基于药物靶点的新药研发提供指导。

如2002年美国FDA 批准依折麦布（ezetimibe）用于治疗高胆固醇血症和冠心病，虽然在2004年Davis 等[14]科学家通过基因敲除等实验确认了其作用靶点为Niemann-Pick C1-Like 1(NPC1L1)蛋白，但其具体作用机制仍然不确定。

直到2020年安进生物医药公司Ching-Shin Huang等[15]科学家通过冷冻电镜结构解析破译了依折麦布与靶点NPC1L1作用模式，确认了依折麦布通过阻断胆固醇的运输通道而治疗高胆固醇血症和冠心病的机制，为基于靶点NPC1L1 开发新的更高效、低毒副作用的治疗药物提供了基础，也为靶向胆固醇结合位点的药物进行联合给药治疗高胆固醇血症和冠心病提供了依据。

新的疾病或者突发流行病需要进行从头药物设计研究，这些应对性的药物研发需要有大量基础研究的积累。

冷冻电镜技术既完美契合了结构生物学的基础研究，又能够助力加速基于结构的药物研发。

例如，Pallesen 等[16]凭借免疫学研究和冷冻电镜结构信息提出了中东呼吸综合征冠状病毒通过病毒-细胞膜融合侵染宿主的机制。

基于Pallesen 等[16]的研究，在2020年新冠肺炎疫情暴发时，美国得克萨斯大学奥斯汀分校Jason S.McLellan 课题组和西湖大学周强课题组先后解析了新型冠状病毒跨膜刺突蛋白胞外结构域膜融合前的三维结构[17]和人受体全长血管紧张素转化酶2（ACE2）蛋白-新型冠状病毒刺突蛋白复合物的近原子分辨率结构[18]。

不仅阐明了病毒侵染人体的机制，并且推进了基于结构研究的合理的疫苗设计和药物研发，筛选出了针对刺突蛋白的中和性抗体候选物和重组疫苗候选物。

3 冷冻电镜的应用情况
近年来，冷冻电镜技术在全球范围被大众所熟知，并且被越来越多的学术界和跨国制药企业所采用。

在学术方面，我国科学家与国外研究者齐头并进、不分伯仲，特别是新冠肺炎疫情暴发时期，我国科学家们利用冷冻电镜技术解析了人受体ACE2-新型冠状病毒刺突蛋白复合物结构，见图2。

首次阐明了新型冠状病毒入侵人体的机制，并提供了新型冠状病毒刺突蛋白与人受体ACE2 相互作用的表位信息和作用细节。

图2 人受体ACE2-新型冠状病毒刺突蛋白复合物结构
A：人受体血管紧张素转化酶2（ACE2）-新型冠状病毒刺突蛋白复合物结构[红色为刺突蛋白的受体结合区域（receptor binding domain, RBD）；绿色为人受体ACE2 的全长结构，根据PDB 6M17和EMD-30039 数据改编]；B：人受体ACE2-新型冠状病毒刺突蛋白复合物结构的相互作用放大图（虚线代表分子间相互作用的氢键，图B 颜色与图A 对应）在药物研发方面，多个跨国公司已经将冷冻电镜技术用于药物发现。

例如，诺华制药公司对多瘤病毒进行了抗体筛选[19]；罗氏制药公司解析了B 淋巴细胞表面的跨膜磷蛋白CD20 与利妥昔单抗结构，为新型治疗肿瘤药物的研发奠定基础[20]；默克公司利用冷冻电镜解析了胰岛素与靶点受体的复合物结构，阐明药物
与靶点的作用机制，为新药开发提供结构信息[21]。

临床上单一药物无法很好地控制疾病时，需要联合用药以增加疗效。

冷冻电镜数据同样能够为联合用药提供理论依据，如安进生物医药公司对乳腺癌靶点人类表皮生长因子受体2（HER2）进行了抗体治疗药物曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的复合物结构解析，从基础研究方面支持了2 种单抗的联合用药，同时也研究了如何开发合适的铰链区以获得合适的双抗，为双抗药物的设计提供了理论指导[22]。

虽然冷冻电镜技术属于前沿技术，但目前已经有利用冷冻电镜基于结构研发的药物进入临床试验阶段，如葛兰素史克公司对寄生虫关键酶开发的黑热病新型抑制剂[19]、再生元制药公司对新冠肺炎研发的抗体“鸡尾酒”[23]均已进入临床试验阶段，相信冷冻电镜技术将会越来越多地被用于除了基础研究之外的药物开发等其他研究，为人类健康做出贡献。

制药企业采用冷冻电镜技术进行基于结构的药物研发发表的10 个最新研究成果见表1。

近几年，若干以冷冻电镜结构解析以及基于冷冻电镜结构的药物发现为主要技术的商业平台公司[ 包括我国的水木未来( 北京) 科技有限公司、佰翱得公司，以及美国的Nanolmaging公司等]已经开始为全球药物公司提供技术服务，标志着冷冻电镜技术开始在新药发现中发挥主要作用。

表1 制药企业应用冷冻电镜技术进行基于结构的药物研发（最新10 组数据）
注：表中数据截至2020年3月
4 未来的探索
上述对冷冻电镜技术在药品开发过程中的应用和阐述，进一步说明其在药品（生物制品）的质量方面有前瞻性的意义。

笔者在回顾技术应用的同时，也看到了未来冷冻电镜技术在新药研发方面的几个前瞻方向。

4.1 生物制剂高级结构表征与生产、冷链运输中的质量控制
药物制剂特别是生物制剂容易受到物理作用发生聚集等变化或者化学作用如氧化、酰基化的影响，可能导致药物分子高级结构发生变化，从而影响治疗功能，甚至引发重大医疗事故，因而在整个制剂生产和运输过程中均需要对生物分子的高级结构进行监测。

相对于现有的生物制剂高级结构检测方法，冷冻电镜能够直接获取近原子分辨率的三维结构，能够更精确有效地判断药物分子的结构构象变化。

4.2 冷冻电镜技术在质量源于设计理念中的思考
我国药品审评审批改革以来，如何让药品监管部门更高效地监管药品质量、缩短审评审批时间，并能保证药物的有效性和安全性，质量源于设计（quality by design，QbD）理念逐渐成为辅助药品监管系统的理想工具。

自药物研发的质量控制重心前移以来，冷冻电镜技术被用于药物早期开发、靶点确认、结构学分析等，使药品生命周期的管理更为主动，进而有助于制订稳健的药品工艺控制策略，在风险评估中给予支持[24]。

自我国加入人用药品注册技术要求国际协调会（ICH）后，整个生物医药市场迈向高质量发展阶段，药品质量标准体系也逐步与国际接轨。

药品的安全性和有效性是药品质量评价的基础，产品的质量并非检验所赋予，而是源于设计[25]。

在药品研发中，根据QbD 理念，从研发开始就要考虑产品的最终质量。

ICH8（R2）将QbD 定义为，是一种充分的科学知识与风险评估体系结合的开发策略。

理想状态下，当药品的质量控制重心前移到研发阶段，无需过多监管即可得到高质量的产品。

QbD 是美国FDA 和ICH 继《药品生产质量管理规范》（good manufacturing practice，GMP）之后倡导和推动的全新理念[24-25]。

在药物开发早期，利用结构生物学可以更清楚地了解药物对人体的作用机制，在提高药物靶点的准确性、简化开发过程的同时，保障了药物的有效性和安全性[25-26]。

4.3 生物大分子的高级结构表征
传统的生物大分子高级结构表征一般使用圆二色谱或者傅里叶变换红外光谱（fourier transform infrared spectrometer，FTIR）进行高级二级或三级结构的表征，但是随着冷冻电镜技术在观察生物大分子天然结构中的应用，拍摄的高分辨率图像可以重构三维图像，让复杂的生物大分子物理表征更加清楚，为更深度的研究提供方法[27]。

5 总结
随着技术的不断进步和人类对于生命科学领域知识的不断积累，药物研发越来越走向理性化，包括法规体系的建立和优化、药品质量控制模式的变迁走向QbD阶段。

基于结构的药物设计已经逐渐成为药物开发设计的主流，与此同时冷冻电镜技术也在蓬勃发展。

冷冻电镜单颗粒分析技术和微晶电子衍射技术不仅能解析近原子分辨率的结构，而且能解析传统结构生物学无法解析的结构，帮助确认药物靶点，拓展可用药物靶点的研究范围和完善基于靶点结构的药物设计。

冷冻电子断层扫描技术在不久的未来可能提供细胞原位观察药物与靶点的作用。

为此，笔者也思考了冷冻电镜技术应用于新药研发方面的若干前瞻方向，以促进药品高质量发展，更好地理解冷冻电镜技术在药物开发中的价值和意义。