活动性肺结核患者PBMCs中INHBA基因的表达

活动性肺结核患者PBMCs中INHBA基因的表达
杨秉芬;翟斐;安红娟;曹志红;王若;程小星
【摘要】目的研究活动性肺结核患者外周血单个核细胞( peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)中抑制素βA亚基(inhibin, beta A, INHBA)基因的表达特点.方法使用密度梯度离心法分离PBMCs,然后用TRIzol提取细胞RNA,逆转成cDNA后,进行荧光定量PCR分析INHBA的表达.结果结核分枝杆菌H37Rv 菌体裂解液和结核分枝杆菌特异性抗原ESAT-6和CFP-10的多肽,显著性提高PBMCs中INHBA基因的表达,配对t检验p值分别为0.019和0.0013;在无抗原刺激的情况下,活动性肺结核与正常对照之间无显著差别(P=0.52);当使用结核分枝杆菌H37Rv菌体裂解液和结核分枝杆菌特异性抗原ESAT-6和CFP-10的多肽刺激PBMCs,INHBA在活动性肺结核患者组的表达显著性的高于正常对照组, t检验P值分别为0.016和0.010.结论 INHBA在结核抗原刺激后在PBMCs表达显著性升高,且在活动性肺结核患者组显著高于正常对照组,可能作为活动性肺结核的诊断标志物.
【期刊名称】《临床肺科杂志》
【年(卷),期】2019(024)005
【总页数】4页(P782-785)
【关键词】INHBA;活动性肺结核;抗原
【作者】杨秉芬;翟斐;安红娟;曹志红;王若;程小星
【作者单位】100091 北京,解放军第三〇九医院全军结核病研究所全军结核病防治重点实验室/结核病诊疗新技术北京市重点实验室;100091 北京,解放军第三〇九
医院全军结核病研究所全军结核病防治重点实验室/结核病诊疗新技术北京市重点实验室;100091 北京,解放军第三〇九医院全军结核病研究所全军结核病防治重点实验室/结核病诊疗新技术北京市重点实验室;100091 北京,解放军第三〇九医院全军结核病研究所全军结核病防治重点实验室/结核病诊疗新技术北京市重点实验室;100091 北京,解放军第三〇九医院全军结核病研究所全军结核病防治重点实验室/结核病诊疗新技术北京市重点实验室;100091 北京,解放军第三〇九医院全军结核病研究所全军结核病防治重点实验室/结核病诊疗新技术北京市重点实验室【正文语种】中文
结核病严重危害人类健康，结核病早期诊断对结核病的治疗效果和减轻患者的经济负担具有重要的意义。

INHBA即抑制素βA亚基，其表达与肿瘤细胞增殖相关，在女性主要由卵巢和胎盘表达，目前用于Down’s综合征的产前筛查和卵巢癌的诊断[1-2]，但是在活动性肺结核中的研究尚未见报道。

本研究使用荧光定量PCR 的方法检测INHBA在PBMCs中的表达，探讨其在结核病诊断中的应用价值。

资料与方法
一、临床样本收集
活动性肺结核样本，来自解放军第309医院结核病研究所住院治疗的患者，通过影像学检查和痰菌培养确诊活动性肺结核，并排除肿瘤、乙肝及其他感染性疾病，排除免疫性疾病及使用免疫抑制剂的患者。

正常对照样本选自解放军第309医院体检中心的健康对照，无发热咳嗽，胸片无活动性病症。

二、PBMCs的分离及培养
收集静脉外周血2mL，用1640基础培养基进行1:1稀释，使用Ficoll(GE Biosciences，美国)进行密度梯度离心，收集单个核细胞层的细胞，用1640培养
基洗涤细胞2次，离心所得细胞沉淀就是PBMCs。

部分细胞直接加入
TRIzol(Invitrogen，美国)溶解，部分细胞使用结核分枝杆菌H37Rv菌体裂解液(终浓度为10μg/mL)或者结核分杆菌特异抗原(ESTA-6、CFP10)的多肽库(每条多肽终浓度为1μg/mL)，37℃、5% CO2培养箱培养过夜，然后收集细胞加入TRIzol。

三、RNA提取
细胞用1mL TRIzol溶解，充分混匀后加入0.2mL氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟；12000g，4℃离心15分钟，样品分为三层，收集上层无色水相液体；加入0.5mL异丙醇，颠倒数次混匀，室温沉淀10分钟，12000g ，4℃离心10
分钟，弃上清；加入1mL含75%乙醇的无核酸酶的水，轻轻颠倒混匀，以清洗RNA沉淀，7500g，4℃离心10分钟，弃上清；沉淀置于冰上晾干(5-10分钟)；根据RNA沉淀量加入15-30μL的无核酶水，充分溶解混匀。

四、逆转录
使用PrimeScript反转录试剂盒(TaKaRa Biotechenology，日本)进行cDNA合成，5× PrimeScript Buffer 4μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1μL，Oligo
dT Primer 1μL，Random 6 mers 1μL，RNA 1μg，然后用无核酶水补足20μL。

反转录条件为：37℃ 15分钟，85℃ 5秒，4℃保持。

五、荧光定量PCR
使用KAPA SYBR快速定量PCR定量试剂盒(KAPA SYBR，美国)，分别加入2× Green Master Mix 10μL，引物浓度200nM，模板2μL，然后用无核酶水补足
20μL。

INHBA正向引物：5′-CAAGTCCTGTGAACAACC-3′；反向引物：5′-GTTAGATAGAGCCACTGAGT-3′。

GAPDH正向引物：5′-TGTTGCCATCAATGACCCCT-3′；反向引物：5′-TCGCCCCACTTGATTTTGGA-3′。

用LightCycler 480Ⅱ实时荧光定量PCR仪(Roche，美国)进行基因扩增和荧
光收集，反应条件：95℃ 3分钟；扩增反应：95℃ 5秒，60℃ 30秒，在延伸阶
段检测荧光信号，40个循环。

根据RT-qPCR扩增Ct值，计算目的基因ΔCt值(ΔCt=目的基因Ct值-内参基因Ct值)，然后计算目的基因的相对表达量(相对表
达量=2-ΔCt)。

六、数据分析
使用软件Graphpad Prism 6对实验结果进行统计分析，同一样本的不同处理的
比较采用配对t检验，组与组之间比较使用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结果
一、结核分枝杆菌H37Rv菌体裂解液对PBMCs的INHNA的表达影响
活动性肺结核患者PBMCs使用结核分枝杆菌H37Rv菌体裂解液刺激培养过夜后，提取RNA，逆转录后进行荧光定量PCR，与无抗原刺激的PBMCs比较，INHBA 基因表达显著性的升高，P值为0.019。

(见图1)。

图1 结核分枝杆菌H37Rv菌体裂解液对INHNA基因表达影响
ns:不用抗原刺激，lys: 使用结核分枝杆菌H37Rv菌体裂解液刺激，n=8，图中点表示INHBA基因相对内参GAPDH的表达量(2-ΔCt)。

二、ESAT-6和CFP-10抗原多肽对INHNA基因表达的影响
根据ESAT-6和CFP-10的氨基酸序列，合成长度为15个氨基酸的多肽，将其混
合用于刺激活动性肺结核患者PBMCs(每条多肽终浓度为1μg/mL)，培养过夜，
然后荧光定量PCR分析INHNBA的表达，结果显示ESAT-6和CFP-10抗原多肽刺激显著性的提高INHBA的表达(P=0.0013)。

(见图2)。

图2 ESAT-6和CFP-10抗原多肽对INHNA基因表达的影响
ns:不用抗原刺激，pool: ESAT-6和CFP-10抗原多肽刺激，n=8，图中点表示INHBA基因相对内参GAPDH的表达量。

三、无抗原刺激时PBMCs中INHBA基因的表达
提取PBMCs后直接提取RNA，并进行荧光定量PCR分析，结果显示活动性肺结核患者组(0.0036±0.00092)与正常对照组(0.0028±0.00059)PBMCs中INHBA基因的表达无显著差异(P=0.52)。

图3 无抗原刺激时PBMCs中INHBA基因的表达
nor:正常对照组，TB：活动性肺结核组，n=16。

四、结核分枝杆菌H37Rv菌体裂解液刺激后PBMCs中INHBA基因的表达
使用结核分枝杆菌H37Rv菌体裂解液刺激过夜后，收集PBMCs，检测其中INHBA基因的表达，结果如图4所示，使用t-检验分析INHBA基因表达量，活
动性肺结核患者组(0.71±0.125)显著高于正常对照组(0.36±0.036)(P=0.016)。

图4 结核分枝杆菌H37Rv菌体裂解液刺激后INHBA基因的表达
正常对照组，TB：活动性肺结核组，n=16。

五、ESAT-6和CFP-10抗原多肽刺激后PBMCs中INHBA基因的表达
使用ESAT-6和CFP-10抗原多肽刺激过夜后，收集PBMCs，检测其中INHBA
基因的表达，结果如图5所示，活动性肺结核患者组(0.34±0.065)显著高于正常
对照组(0.11±0.026)(P=0.010)。

图5 ESAT-6和CFP-10抗原多肽刺激后INHBA基因的表达
nor:正常对照组，TB：活动性肺结核组，n=8。

讨论
INHBA即抑制素-βA亚基，是TGF-β超家族的配体，与肿瘤的增殖相关，在肺癌、胃癌、卵巢癌和食管癌等肿瘤细胞中显著性升高，并与其预后相关[3-9]。

INHBA
在女性主要由黄体、垂体和胎盘表达，目前作为Down’s综合征的产前筛查和卵巢癌的诊断标志，还有研究表明孕妇体内INHBA含量的异常升高可能与子痫前期与及子痫发病相关[10]。

但是INHBA在活动性肺结核患者体内的表达及作用目前尚未见报道。

单核/巨噬细胞在抗结核免疫中具有重要的作用，最近研究表明单核
细胞中 miR-146a表达上调后M1型巨噬细胞细胞因子IL-6、IL-12、TNF-α、CD86和iNOS表达下调，而M2型巨噬细胞细胞因子Arg1、CCL17、CCL22和CD206表达上调，研究其机制，发现miR-146a通过靶向INHBA的3′-UTR区并抑制其表达，如果过表达INHBA就可以回复由miR-146a引起的细胞因子IL-6、IL-12和TNF-α的下调和Arg1、CCL17和CCL2的上调，因此INHBA在巨噬细胞的极化过程具有重要的作用，可能在结核病的发病和病程进展中扮演重要的角色[11]。

本研究通过荧光定量PCR检测INHBA基因的表达，结果显示，结核分枝杆菌
H37Rv菌体裂解液显著提高PBMCs的INHNA的表达(P=0.019)，同时ESAT-6和CFP-10抗原多肽显著提高INHNA的表达(P=0.0013)，在结核抗原刺激的情况下，PBMCs中INHBA表达显著性上调，而且结核分枝杆菌H37Rv菌体裂解液(0.71±0.125)比ESAT-6和CFP-10抗原多肽(0.34±0.065)对INHBA上调表达更高，可能是因为多肽主要刺激T细胞的反应，而裂解液成分复杂，同时激活T细胞和单核细胞，这有待我们进一步研究。

无抗原刺激时活动性肺结核患者组PBMCs中INHBA基因的表达与正常对照组无显著差异(P=0.52)，结核分枝杆菌H37Rv菌体裂解液刺激后活动性肺结核患者组PBMCs中INHBA基因的表达显著高于正常对照组(P=0.016)，ESAT-6和CFP-10抗原多肽刺激后活动性肺结核患者组PBMCs中INHBA基因的表达显著高于正常对照组(P=0.010)。

通过以上研究说明结核抗原特别是结核分枝杆菌特异性抗原刺激的情况下，INHBA基因的表达在活动性肺结核患者显著性升高，可能作为活动性肺结核的诊断标志物，这有待于我们以后扩大样本量进一步检测其在活动性肺结核患者、结核分枝杆菌潜伏感染者、肺部其他疾病患者和健康对照中的表达，验证其在活动性肺结核的诊断价值。

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