不同MHC-B单倍型SPF鸡对H9N2亚型禽流感病毒的抗性实验方案

不同MHC-B单倍型SPF鸡
对H9N2亚型禽流感病毒的抗性实验
一、研究背景
H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）在自然界中广泛存在，能感染包括禽类在内的多种属动物，虽然不会起感染禽类大量死亡，但该病毒传播能力强，存在范围广，可导致产蛋下降、免疫抑制病、与其他病原共感染时会出现高死亡率，给我国养禽业造成了巨大的经济损失。

目前，我国现有的商品化灭活苗无法完全保护免疫鸡免受H9N2亚型禽流感病毒的感染。

鸡的主要组织相容性复合体（Major histocompatibility complex，MHC）基因具有高度多态性，先前的研究表明不同MHC-B 单倍型的鸡对多种疾病的抗性具有显著差异（Bacon et al., 1983；Bacon et al., 2003；侯卓成等，2002）。

二、实验目的
本实验使用H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）人工感4个品系的MHC单倍型SPF鸡。

以喉头和泄殖腔排毒量以及各脏器的病毒载量为指标，对各品鸡系的H9N2亚型AIV抗性进行分析，探索不同MHC单倍型的SPF鸡系对H9N2亚型AIV的抗性差异，并从中筛选出抗性较强和较为易感的SPF鸡系。

抗性鸡系可在H9N2亚型AIV的预防和种群的净化中发挥重要
的作用，易感鸡系将为我国的H9N2亚型AIV实验研究及疫苗等生物制品的生产提供适合病毒生长的优良材料（廉传江等，2014）。

三、实验方案
20XX.02.06
准备好水槽、料槽，检查SFP鸡隔离器（共5个），然后使用甲醛熏蒸法熏蒸隔离器及动物舍，24 h后通风。

20XX.02.10
60只3日龄的MHC-B单倍型SPF鸡送到，带上脚标，随机分配到4个隔离器中（其中一个品系的鸡较多，可挑出部分作对照组，饲养于第5个隔离器中）。

20XX.02.13
攻毒前4 d，每个品系随机挑选3只鸡（共12只），采集3~4 mL 抗凝血，制备PBMC，用于流式检测，以确定不同鸡的CD3、CD4、CD8是否分布均匀。

20XX.02.17
致病性实验开始，具体实验方案如下：
组别品系
数量
（羽）
攻毒日
龄（d）
接种毒株
接种方
式
攻毒剂量
攻毒组
G1（B13）12
28
H9N2
（HN株）
点眼滴
鼻
0.2 mL/羽
( 107
EID50 )
G2（B15）12 G3（B2）12 G7（B19）12
对照组待定12 PBS 点眼滴
鼻
0.2 mL
注：
（1）攻毒前取一管之前保存的H9N2（HN株）病毒原液进行HA 检测，确定病毒没有降解后，开始稀释病毒。

病毒原液的EID50值为10-8.3/100 µL（之前测定过的），经灭菌PBS稀释40倍后，每200 µL病毒稀释液中含107 EID50的病毒（攻毒前需准备好10 mL 病毒稀释液）。

攻毒时每只鸡接种200 µL稀释好的病毒液（在隔离器内，一人保定鸡，另一人使用200 µL移液枪缓慢点眼100 µL，滴鼻100 µL）；对照组的鸡以点眼滴鼻方式接种200 µL 灭菌PBS。

（2）攻毒后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 d采集的喉头拭子和泄殖腔拭子（置于含20%甘油与10 000 UI双抗的1 mL PBS的1.5 mL离心管内），暂时冻存于-80℃冰箱。

后续用于检测攻毒后的排毒情况（先使用每份拭子的原液接种9~11日龄鸡胚，72 h后收胚测HA，选择阳性样品继续检测其EID50值）。

（3）攻毒后第2、4、6 d每组随机挑选5只鸡，各采集4 mL抗凝血（若鸡较小，采集3 mL血），分离PBMC，进行流氏检测，根据检测结果确定第二天需要剖杀的3只鸡。

（4）每组于攻毒后3、5、7 d挑选3只鸡剖杀，采集肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、十二指肠、空肠、回肠、盲肠，暂时冻存于-80℃冰箱。

全部脏器采集完各后取0.5 g研磨（可提前准备好装有灭菌钢珠的2 mL离心管，处理样品时将0.5 g脏器和1 mL含10 000 UI
双抗的灭菌PBS加入，统一使用可制冷的组织研磨器研磨），10 000 r/min离心5 min，取上清液，检测各脏器的病毒载量（先取每份样品研磨液的上清接种9~11日龄鸡胚，72 h后收胚测HA，选择阳性样品继续检测其EID50值）。

（5）攻毒后第14 d对全部存活鸡采集0.5 mL非抗凝血用于制备血清，进行HI检测。

（6）动物实验期间，每天安排人去动物房看2次鸡，并喂饲料和水（为避免污染，饲料和水均提前分装好，饲喂时经传递仓送入，打开传递仓门时要喷75%酒精，打开下一个传递仓之门前要换新手套）。

采样时间安排：
20XX.02.18（1 dip.）
（1）共60只鸡，采集喉头拭子和泄殖腔拭子。

20XX.02.19（2 dip.）
（1）共60只鸡，采集喉头拭子和泄殖腔拭子；
（2）每组随机挑选5只鸡，采集4 mL抗凝血，分离PBMC，进行流氏检测。

20XX.02.20（3 dip.）
（1）共60只鸡，采集喉头拭子和泄殖腔拭子；
（2）每组剖杀3只鸡，取脏器，暂存于-80℃冰箱。

20XX.02.21（4 dip.）
（2）每组随机挑选5只鸡，采集4 mL抗凝血，分离PBMC，进行流氏检测。

20XX.02.22（5 dip.）
（1）剩余45只鸡，采集喉头拭子和泄殖腔拭子；
（2）每组剖杀3只鸡，取脏器，暂存-80℃冰箱。

20XX.02.23（6 dip.）
（1）剩余30只鸡，采集喉头拭子和泄殖腔拭子；
（2）每组随机挑选5只鸡，采集4 mL抗凝血，分离PBMC，进行流氏检测。

20XX.02.24（7 dip.）
（1）剩余30只鸡，采集喉头拭子和泄殖腔拭子；
（2）每组剖杀3只鸡，取脏器，暂存-80℃冰箱。

20XX.02.25（8 dip.）
（1）剩余15只鸡，采集喉头拭子和泄殖腔拭子。

20XX.02.26（9 dip.）
（1）剩余15只鸡，采集喉头拭子和泄殖腔拭子。

20XX.02.27（10 dip.）
（1）剩余15只鸡，采集喉头拭子和泄殖腔拭子。

20XX.02.28（11 dip.）
（1）剩余15只鸡，采集喉头拭子和泄殖腔拭子。

20XX.03.01（12 dip.）
20XX.03.02（13 dip.）
（1）剩余15只鸡，采集喉头拭子和泄殖腔拭子。

20XX.03.03（14 dip.）
（1）剩余15只鸡，采集喉头拭子和泄殖腔拭子；
（2）剩余的存活鸡全部采集抗凝血（检测HI抗体水平）。

注：剩余的鸡不能处死，可能需要转移至另一动物舍，继续饲养（此时已过排毒期，可混合饲养于同一个隔离器内），期间每周采集抗凝血一次，制备成PBMC后冻存于液氮罐备用。

20XX.03.04~2019.03.05
致病性实验结束，打扫动物房和隔离器。

20XX.03.06~2019.04.06
订购9~11日龄鸡胚，检测喉头拭子、泄殖腔拭子、各脏器排毒情况，计算对应的EID50值。

首先取各拭子（共435×2=870份）和各脏器（共5×8×3=120份）的原液接胚，37℃孵育72 h后进行HA检测，HA结果为阳性的样品，做10倍梯度稀释，一般每个样品选3~5个稀释度，测定EID50值（具体稀释度参考上一批动物实验结果：喉头拭子1~4 dpi接种10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，5~6 dpi接种10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，7~14 dpi接种原液、10-1、10-2、10-3；泄殖腔拭子1~6 dpi接种接种原液、10-1、10-2、10-3、10-4，7~14 dpi接种接种原液、10-1、10-2；肝和脾接种原液、10-1、10-2；肾、十二指肠、空肠、回肠、盲肠接种10-
1、10-
2、10-
3、10-4；肺接种10-1、10-2、10-3、10-
4、10-5；若发检测过程发现特殊样品，再单独增加稀释度补测）。

附：
1. 本实验所需的实验材料及仪器
（1）实验材料
一次性使用静脉采血针、医用棉签（棉拭子，分大小两种）、5 mL 抗凝管、5 mL非抗凝管、10 000 UI双抗（青霉素和链霉素）、96孔V型微量反应板、1%鸡红细胞悬液、PBS（pH 7.2~7.4）、甘油、1.5 mL离心管、2.5 mL离心管、15 mL离心管（Corning；REF：430791）、50 mL离心管（Corning；REF：430829）、红细胞裂解液（天津市灏洋生物制品有限责任公司；Cat.#NH4CL2009）、3 mL吸管（Biologix Group Limited；30-0138A1）、RPMI-1640培养基（Gibco by Thermo Fisher Scientific TM；REF：C11875500BT）、细胞冻存管（Corning；REF：430659）灭菌钢珠、一次性耐用丁腈手套（包括S和M两种）、一次性口罩、一次性医用垫、75%酒精、医用棉花、大中小3中病料袋、冰盒、甲醛、高锰酸钾、铁盒（熏蒸用）、垃圾袋、黑色红色蓝色3种马克笔。

G1、G2、G3、G7系MHC-B单倍型SPF鸡（哈兽研）、9~11日龄SPF胚（梅里亚）及普通胚（大华农）、SPF鸡饲料（哈兽研）、SPF 饮用水（娃哈哈矿泉水）。

H9N2亚型禽流感病毒（HN株）由本实验保存。

（2）仪器
SPF鸡隔离器、生物安全柜、水平离心机（Eppendorf；Centrifuge 5810R）、恒温培养箱（37℃）、组织研磨仪（可加液氮冷却降温）、流氏细胞仪、振荡器（涡旋仪）、小型低温离心机、解剖台、各种量程移液枪等。

2. 部分实验操作技术
（1）鸡抗凝血与非抗凝血的采集方法（在隔离器内操作）一人单手保定鸡，拨开颈部羽毛，酒精棉擦拭颈静脉周围，血管突起后，另一只手将一次性采血针（斜面朝上）沿血管侧壁插入，针头在血管内不能晃动，另一人将采血针的另一端插入5 mL负压抗凝管/非抗凝管（抗凝血采集4 mL，非抗凝血采集0.5 mL）。

采血过程中，若血液流速太慢甚至停止，可适当调整针头位置使血液流速恢复正常；拔针时若有出血，立即使用干棉花止血，再使用马克笔在鸡的头部做标记，然后抓下一只鸡采集血液。

全部样品采集结束后，抗凝血尽快制备成PBMC；非抗凝血置于37℃度恒温培养箱1~2 h至血清析出，2000~3000 r/min离心5 min后，将血清吸出转移至1.5 mL离心管，如不立即做HI检测，可将血清暂存于-20℃。

注：采血前不要喂饲料。

（2）喉头拭子和泄殖腔拭子方法（在隔离器内操作）
将无菌棉拭子插入鸡的喉头/泄殖腔，转3圈沾取黏液后取出（喉头拭子沾有少量血液属于正常），将棉拭子头折断，置于含20%甘油
与10 000 UI双抗的1 mL PBS的1.5 mL离心管内，离心管（可提前编号）放置在冰盒上，再使用马克笔在鸡的头部做标记，然后抓下一只鸡采集拭子。

全部样品采集结束后暂时保存于-80℃冰箱。

注：采拭子前不要喂饲料。

（3）HA与HI试验
具体操作及判断标准可参照《高致病性禽流感诊断技术》（GB/T 18936—2003）中的HA与HI试验。

（4）PMMC的制备方法
参照天津市灏洋生物制品有限责任公司的TBD鸡外周血淋巴细胞分离液KIT（货号：LTS1090C）说明书。

取1×106分离得到的PMMC 进行流氏检测（检测CD3、CD4、CD8）。

（5）EID50的测定方法
将病毒液（若是浸泡于PBS中的棉拭子，先振荡，再10 000 r/min 4℃离心5 min，取上清；若是脏器，取0.5 g研磨，10 000 r/min 4℃离心5 min，取上清液）用含双抗灭菌PBS作10倍梯度稀释，连续稀释至10-10，每个稀释度（一般选3~5个稀释度接胚，具体稀释度可参考上一批动物实验结果）的病毒稀释液各接种3~5枚9日龄的SPF 鸡胚，每胚接种0.2 mL，置37℃恒温培养箱中孵育72 h，弃去24 h 前的死胚，72 h后将所有鸡胚放置于4℃冰箱过夜，然后再收获各胚的尿囊液并分别测定其HA效价，HA效价大于3 log2时，判定为鸡胚发生感染。

然后再采用Reed-Muench法计算出毒株的EID50值。

Reed-Muench法计算公式：
logEID50=高于50%的病毒稀释度的对数+距离比例×稀释系数的对数
距离比例=（高于50%感染率的百分数-50%）/（高于50%感染率的百分数-低于50%感染率的百分数）。