磺胺和四环素类抗生素对大肠杆菌联合突变效应的研究

磺胺和四环素类抗生素对大肠杆菌联合突变效应的研究
宋雪薇;马清萍;于洋;宋春磊;林志芬;张饮江
【摘要】抗生素的滥用造成的环境安全问题已不可忽视,关于抗生素联合毒性效应研究较多,但联合突变效应研究较少.因此,本文以大肠杆菌为受试生物,研究了2种磺胺类抗生素(磺胺氯哒嗪(SCP)、磺胺二甲嘧啶(SMZ))和3种四环素类抗生素(二甲胺四环素(MH)、盐酸四环素(TH)和盐酸强力霉素(DH))单一及联合暴露时对大肠杆菌的突变效应.结果表明:在单一暴露下,磺胺类抗生素会促进大肠杆菌的突变效应,四环素类抗生素没有明显的促进作用;联合暴露下,磺胺类抗生素对大肠杆菌突变效应为相加,磺胺和四环素类抗生素对大肠杆菌突变效应为拮抗.本研究初步探索了抗生素对大肠杆菌的联合致突变风险,为今后环境中抗生素混合暴露的生态风险评价和抗生素污染控制标准制定提供一种理论支撑.
【期刊名称】《生态毒理学报》
【年(卷),期】2018(013)005
【总页数】8页(P110-117)
【关键词】磺胺;四环素;大肠杆菌;联合突变效应
【作者】宋雪薇;马清萍;于洋;宋春磊;林志芬;张饮江
【作者单位】上海海洋大学海洋生态与环境学院,上海201306;上海海洋大学海洋生态与环境学院,上海201306;环境保护部固体废物与化学品管理技术中心,北京100029;污染控制与资源化研究国家重点实验室,同济大学环境科学与工程学院,上海污染控制与生态安全研究院,上海200092;污染控制与资源化研究国家重点实验
室,同济大学环境科学与工程学院,上海污染控制与生态安全研究院,上海200092;上海海洋大学海洋生态与环境学院,上海201306
【正文语种】中文
【中图分类】X171.5
我国作为世界上抗生素的最大消费国，每年抗生素的消费量达20万吨[1]。

残留的抗生素在许多水域都有检出，如黄浦江上游支流中检测到四环素类抗生素含量为34.25～211.82 ng·L-1 [2]；南方某水库中检测到磺胺类抗生素残留量最大为130 ng·L-1 [3]。

磺胺和四环素类抗生素因具有价格低、抗菌谱广等优点被广泛使用，使得耐药菌大量产生，从而严重危害到人类健康[4]。

因此，深入研究这2类抗生
素对抗性基因形成的影响，对预防细菌耐药性产生具有一定的参考价值。

环境中残留的抗生素多为混合暴露，对微生物有联合毒性效应。

如任皓等[5]发现
盐酸金霉素、盐霉素和黄霉素两两分别组合对发光细菌的联合毒性表现为拮抗作用；高礼等[6]指出四环素和金霉素联合作用于羊角月牙藻时，联合毒性表现为相加作用，这会导致环境危害进一步加深[7]。

目前，对抗生素的联合暴露研究主要以生
长毒性效应作为指标[8]，多用毒性单位(TU)来表征混合物的联合毒性效应，较少
考虑其在环境中对微生物造成的致突变效应。

细菌获得抗性基因途径有2种，一种是个体间的水平转移，如宋春磊等[9]探讨了
在单一及联合作用下抗生素对接合转移频率的影响；另一种是在非致死的选择条件下，细胞会高频率地产生适应外界环境的有利突变[10]，导致抗性基因的产生，如采用四环素诱导，可使细菌对氟喹诺酮类抗生素产生耐药性[11]，喹诺酮等抗生素会使细菌产生耐药基因的浓度发生变化[12]。

目前对抗生素致突变的研究主要用于药物治疗，邵世峰等[13]认为联合使用抗生素更容易避免耐药基因的富集。

但目前
关于联合突变的研究较少，多为单一抗生素的突变效应，需要进一步研究混合抗生素的突变效应。

本文选择磺胺类抗生素(磺胺氯哒嗪(SCP)、磺胺二甲嘧啶(SMZ))和四环素类抗生
素(二甲胺四环素(MH)、盐酸四环素(TH)和盐酸强力霉素(DH))作为研究对象，研
究其对大肠杆菌突变的单一和联合突变效应，初步探索了抗生素联合暴露对大肠杆菌的致突变风险，为有效解决抗生素的耐药性与生态风险评价等问题提供理论依据。

1 材料与方法(Materials and methods)
1.1 试剂
所用试剂均购于Sigma-Aldrich化学制品有限公司(St. Louis, MO, USA)，纯度均≥99%，无需再提纯。

大肠杆菌(E. coli MG-1655)菌株购买于北京谱如汀生物技
术有限公司。

1.2 实验方法
1.2.1 突变效应的测定
工作菌液的制备：用接种环将F3菌种接入含5 mL单倍液体LB培养基的小摇瓶中，在37 ℃恒温震荡培养6 h至对数生长期，通过稀释或离心浓缩将OD600(菌液在600 nm处的吸光值)调整为0.5±0.01，然后使用1% NaCl稀释105倍，磁力搅拌后使细菌为工作菌液，可直接用于暴露实验。

单一暴露：采用微量肉汤稀释法对受试抗生素进行暴露实验，将待测化合物稀释成等对数梯度系列浓度，加入96孔板，每个浓度梯度点至少设置32个平行，同时
设置对照组，培养12 h至稳定期。

混合暴露：将2种药物按照等MIC(minimum inhibitory concentration, 最低抑菌浓度)比例进行混合，随后逐级稀释并暴露，方法与单一暴露相同。

生长效应测定：取30 μL稀释后的菌液至不含抗生素的平板培养基中，37 ℃ 恒温静置培养12 h，对筛选板上的菌落进行计数。

突变测定：从不加抗生素的对照组与各样本点取菌液至40 mg·L-1利福平筛选平板上，37 ℃恒温培养箱中静置培养12 h后对筛选板上的菌落计数。

1.2.2 数据处理
抗生素在浓度为c时对受试菌的毒性大小用抑制率pc来表述，计算方法如公式(1)所示。

(1)
式中pc表示c浓度下抗生素对受试生物的抑制率；Ac表示生长效应测定中c浓度处理组的菌落数目平均值；A0表示生长效应测定中空白对照组的菌落数目平均值。

采用Weibull方程(2)作为拟合模型对毒性数据进行拟合[14]，从而获得更精确的MIC。

pc=pmax-(pmax-p0)×exp (-)
(2)
式中pmax表征剂量效应曲线最高剂量的抑制率pc；p0表示浓度c为0时的抑制率pc。

根据拟合出的方程求出pc为pmax时所对应的最小浓度c，即为抗生素的MIC。

化合物对大肠杆菌的突变效应由促进率表示，计算如公式(3)所示：
(3)
式中，P表示促进率，f0、fc分别表示对照组、c浓度下在利福平培养基中筛选出的菌落数目平均值。

化合物对大肠杆菌的突变率促进率用Pm表示，计算公式如(4)所示：
(4)
表1 所用化合物及其相关参数Table 1 Detailed information of test chemicals 序号Serial numberCAS名称Name简称Abbreviation结构
StructureMIC/(mol·L-1)157-68-1磺胺二甲嘧啶SulfamethazineSMZ3.98E-05280-32-0磺胺氯哒嗪SulfachloropyridazineSCP4.39E-06324390-14-5盐酸强力霉素Doxycycline hyclateDH1.83E-06464-75-5盐酸四环素Tetracycline hydrochlorideTH1.15E-06513614-98-7二甲胺四环素Minocycline hydrochlorideMH3.61E-6613292-46-1利福平RifampicinRIF/
注： MIC为最低抑菌浓度，指抑制细菌生长80%的最低药物浓度。

Note： MIC stands for minimum inhibitory concentration, the lowest drug concentration that inhibits bacterial growth of 80%.
式中fc表示c浓度下利福平培养基中筛选出菌落数目平均值；Ac表示生长效应测定中c浓度处理组的菌落数目平均值；f0表示对照组在利福平培养基中筛选出的菌落数目平均值；A0表示生长效应测定中对照组的菌落数目平均值。

2 结果与讨论(Results and discussion)
2.1 磺胺和四环素单一暴露对大肠杆菌的突变效应
图1 磺胺和四环素类抗生素单一暴露对大肠杆菌的突变效应注：黑色方形为突变率促进率，红色圆形为突变次数促进率，红色实线为突变次数促进率拟合曲线，红色柱形为突变次数，白色柱形为总菌数。

Fig. 1 Mutation effects of single exposure of sulfonamide and tetracycline on Escherichia coliNote: the black square is the promoting rate of mutation rate; the red circle is the promoting rate of mutation times; the red solid line is fitting curves of the promoting rate of mutation times; the red column is the mutation times; the white column is the total number of bacteria.
本文选取2种磺胺类抗生素(SCP、SMZ)和3种四环素类抗生素(MH、TH、DH)
为受试化合物，测定了其单一暴露对大肠杆菌的突变效应，并用Origin软件中的Weibull函数进行拟合，R2均大于0.7，结果如图1所示。

由图1可知，SCP和SMZ对大肠杆菌突变具有促进效应。

SCP在浓度为8.8E-07 mol·L-1时突变次数促进率最大，为94.3%(如图1a)；SMZ在浓度为1.8E-05 mol·L-1时突变次数促进率最大，为145.06%(如图1b)。

SCP和SMZ在EC0(最
大无效应浓度)处能够明显促进大肠杆菌的突变，这是由于磺胺能够作用于叶酸合
成通路相关蛋白，抑制叶酸的合成[15]，而叶酸是合成dNTP库(胞内各游离脱氧
核糖核苷三磷酸的含量)的原料，dNTP库的平衡对维持体内遗传稳定有重要作用。

因此，当叶酸的合成受到抑制后，会影响细胞的突变率[16]。

由图1c, 1d, 1e四环素类抗生素的剂量效应关系可知：当所研究的四环素类抗生
素浓度大于EC0时，虽然能够诱导产生适应性突变，但是突变次数在整体上还是
被抑制。

这可能是由于四环素类抗生素阻碍了细菌的蛋白质分泌[17]，从而影响到了突变率[18]。

因此，推断四环素类抗生素进入环境后产生的风险小于磺胺类抗生素。

2.2 磺胺和四环素联合暴露对大肠杆菌的突变效应
根据单一暴露的结果，采用等MIC联合暴露方法，测定了磺胺与磺胺(SCP+SMZ)、磺胺与四环素类抗生素(SCP+DH、SCP+TH、SCP+MH)联合暴露对大肠杆菌的
生长及突变促进率的影响，并用Origin软件中的Weibull函数进行拟合，结果如图2(a, b, c, d)所示，其中，相对浓度表示实际浓度与化合物MIC(最低抑菌浓度)
浓度的比值。

图2 抗生素对大肠杆菌的联合突变效应注：蓝色实心点为突变次数促进率，红色
空心点为生长促进率；蓝色实线为突变次数促进率拟合曲线，红色虚线为生长促进率拟合曲线；图a为SCP+SMZ，图b为SCP+DH，图c为SCP+TH，图d为
SCP+MH。

Fig. 2 Mutation effects of combined exposure of antibiotics on Escherichia coliNote: the blue solid point is promoting rate of mutation times; the red hollow point is mutation rate; the blue line and the red line are curve fitting; figure a is SCP+SMZ, b is SCP+DH, c is SCP+TH, d is
SCP+MH.
研究表明，磺胺与磺胺对大肠杆菌的联合毒性为相加效应，磺胺与四环素类抗生素之间的联合毒性具有拮抗效应，但是目前还没有方法对突变联合效应进行研究[19]。

为了研究抗生素对大肠杆菌突变效应的联合作用，本文参考生长毒性联合作用的计算方法，从联合毒性TU推测采用抗性毒性单位(RU)来表征混合物对突变联合效应，如公式(5)所示：
(5)
式中，Ci,RCx是混合物对受试生物达到RCx效应浓度时各组分i的浓度，RCx,i是组分i在单一暴露时的RCx效应浓度。

本文使用RCmax作为RCx进行了RU计算，以确定混合物对这3个浓度效应的联合效应。

当RU<0.8时，联合效应为协同，当0.8≤RU≤1.2时，联合效应为相加，当RU>1.2时，联合效应为拮抗。

同时参照毒性实验中的毒性表征方法，根据拟合出的抗生素与突变促进率的剂量效应曲线计算了磺胺与磺胺、磺胺与四环素联合暴露时的抗性单位RU，突变促进率为1%时最低可观测突变促进效应浓度RC0-1及最高可观测突变促进效应浓度
RC0-2，突变促进率的最大值Pmax及其对应的浓度RCmax及突变促进面积PA。

RCmax可以理解为抗生素对突变促进作用开始降低的起始浓度，RC0-2是抗生素对突变促进作用结束的终点浓度和突变抑制作用开始的起点。

这2个参数均是突
变效应被抑制的重要参数。

其中，对突变没有Hormesis效应的化合物，可以认为是促进效应面积无限趋近于0，此时RC0-1、RCmax、RC0-2均约等于RC0，因
此本文使用RC0作为没有突变Hormesis效应的化合物的RC0-1、RCmax和
RC0-2。

计算获得的突变效应数据如表2所示。

由表2可看出：SCP与SMZ联合作用下RC0-2减小，说明联合暴露能够导致突
变促进效应的浓度区间向低浓度偏移，在基于RCmax的计算中，SCP+SMZ的RU介于0.8和1.2之间，说明磺胺混合物对促进突变效应的联合作用是相加。

除
此以外，联合暴露的PA大于单一暴露时的PA。

因此，推测SCP与SMZ的联合
具有一定的环境风险。

图2b, 2c, 2d的RC0-2介于2个化合物单一的RC0-2之间，可看出四环素与磺
胺的联合暴露从整体上减弱了SCP单一暴露时对突变的促进作用。

SCP+DH、SCP+TH、SCP+MH的RU均大于1.2，说明磺胺与四环素类抗生素混合物对促
进突变效应的联合作用是拮抗。

同时，磺胺和四环素类抗生素联合暴露时的Pmax 和PA均小于磺胺单一暴露时的Pmax和PA，说明这2类抗生素联合暴露的促进突变环境风险不会超过单一暴露的促进突变环境风险。

同时，Yang等[19]指出当受试生物为羊角月牙藻时，SMZ+SMX的TU为1.1，
即这2种磺胺的联合毒性为相加效应；在Long等[20]的研究指出，以大肠杆菌为受试生物，SCP+TH的TU为1.47，即磺胺与盐酸四环素的联合毒性为拮抗效应。

可以看出本文中TU与RU的效应相同，可能存在一定的相关关系，有待于未来进一步的研究。

可考虑用TU推测RU,并用RU法来评价混合物的联合突变效应。

表2 典型抗生素单一及联合暴露时突变促进效应浓度及其联合作用Table 2 Mutation promoting effect concentration and combined action of typical antibiotics in single and combined exposure组号Group number化合物简称AbbreviationRC0-1RCmaxRC0-2PmaxPARU(RCmax)1SCP-2.89-0.72-
0.27109.22102.57SMZ-3.20-0.84-0.30134.59137.78SCP+SMZ-3.48-1.17-
0.60132.48140.250.832SCP-2.78-1.03-0.58110.6991.74DH-1.27-1.27-
1.270.000.00SCP+DH-
2.97-1.01-0.6179.1569.002.883SCP-
3.22-1.15-
0.6682.02103.42TH-1.20-1.23-1.200.000.00SCP+TH-3.44-1.45-
0.9457.3057.421.274SCP-4.52-1.12-0.6085.30136.91MH-1.54-1.54-
1.540.000.00SCP+MH-4.28-1.44-0.7964.8288.431.73
综上，本文主要研究了2类抗生素的二元混合对大肠杆菌的突变效应，发现:(1)低浓度的单一暴露下，四环素类抗生素对大肠杆菌产生的突变风险小于磺胺类抗生素；
(2)磺胺类抗生素混合(SCP+SMZ)对突变效应的联合作用为相加，磺胺与四环素类抗生素混合(SCP+DH、SCP+TH、SCP+MH)对促进突变效应的联合作用为拮抗；
(3)抗性毒性单位(RU)法可以考虑用来评价抗生素混合对突变的联合效应。

在此基础上，可进一步开展：(1)三元及以上的混合抗生素联合毒性与联合突变效
应的研究；(2)联合毒性(TU)与抗性毒性单位(RU)的相关性研究。

随着对抗生素在
环境中混合暴露的研究深入，了解更多抗生素的生物学效应与评价方法，可进一步为评估暴露在环境中的抗生素风险提供帮助。

致谢：本研究受同济大学污染控制与资源化研究国家重点实验室自主研究(重点)项目(PCRRK16007)；国家自然科学面上基金(21577105，21777123)；国家水体污染控制与治理重大专项(2018ZX07109-1)；上海市科学技术委员会科研计划课题(14DZ2261100，17DZ1200103)；环境化学与生态毒理学国家重点实验室开放基金课题(KF2016-11)资助。

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