原核生物的基因表达与操作

3.3 可调控强启动子驱动的基因表达
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3.3.1 可调控的启动子 3.3.2 常用原核表达载体 3.3.3 提高蛋白的表达量 3.3.6 非融合蛋白的表达 3.3.7 融合蛋白的表达及纯化 3.3.9 增强蛋白质的稳定性 3.3.10 DNA整合入宿主染色体中 3.3.11 加强分泌
3.3.1 可调控的启动子
融合型蛋白表达
P
SD
Foreign DNA
融合型表达载体 融合基因
融合蛋白的表达及纯化
主要步骤：
1、构建融合蛋白表达载体：在外源蛋白的N或C端 加标记物（如谷胱甘肽S-转移酶标记物、6×组 氨酸标记物、Flag或HA肽段标记物、CBP标记物 等）；在标记物和外源蛋白之间插入一段可被 蛋白酶识别的氨基酸序列。
2. 诱导大肠杆菌细胞的外膜发生有限的渗漏， 导致胞内的蛋白质向胞外培养基方向分泌。 （可以分离到中等产量的蛋白质）
优点：
1. 蛋白质的酶解作用程度低 2. 由于分泌到胞外的蛋白质种类少，
因此目标蛋白容易纯化 3. 增进了蛋白质的折叠作用
缺点：
1. 在大肠杆菌细胞中表达的外源真 核蛋白质，通常是不会分泌到胞 外培养基中去的
➢ 周质：在大肠杆菌一类格兰氏阴性菌 中，位于内膜和外膜之间的细胞 结构部分。
➢ 在周质中表达的蛋白，需要信号肽序列 才能从细胞质中穿过细胞质内膜进入周 质。
优点：
1. 由于周质中蛋白质种类比较少，因此目标 蛋白质的纯化就比较简单
2. 蛋白质酶解的程度不甚严重 3. 促进了二硫键的形成及蛋白质的折叠作用
复性中常采用的方法：稀释复性 、透析复性、 超滤复性、 柱上复性等。
3、蛋白质的纯化
离子交换层析
层析类型
➢ 1. 选用一种适当的核酸内切酶，消化切割大肠杆菌 的染色体DNA
➢ 2. 接着将切割产生的DNA限制片断群体，同一种无 启动子的质粒载体重组，按实验设计要求使插入的 片断恰好紧邻报告基因的上游位置
➢ 3. 随后把此重组混合物转 1. 对大肠杆菌的背景知识，特别是基因表达调控 的分子机理有深刻的了解；
➢ 2. 是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适 用的寄主菌株和不同类型的载体；
➢ 3. 许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中 实现有效、高水平的表达；
➢ 4. 大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易 用于批量生产。
非融合蛋白抗宿主蛋白酶降解方法：
➢ 1、选用Ion-（黄嘌呤核苷）营养缺陷 型宿主菌
➢ 2、利用细菌蛋白酶抑制剂
3.3.7 融合蛋白的表达及纯化
融合蛋白：是指蛋白质的N末端由原核DNA 序列或其他DNA序列编码，C端由 真核DNA的完整序列编码。这样 的蛋白质有一段短的原核多肽或 具有其他功能的多肽和真核蛋白 质结合在一起，故称为融合蛋白。
包含体的洗涤（0.1%以下的中性去污剂，如Tween20）
包含体蛋白的变性（溶解）（变性剂：尿素、盐酸胍
蛋白质的复性及纯化
提高PH、温度及离子强度）
2、蛋白质的复性
通过缓慢去除变性剂使目标蛋白从变性的完 全伸展状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还 原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右 时复性过程开始，到2M左右时结束。对于盐酸胍 而言，可以从4M开始，到1.5M 时复性过程已经 结束。
λ噬菌体的左向启动子PL
➢ 来自λ噬菌体早期左向转录启动子，活性比Trp启 动子高约11倍；
➢ 受控于温度敏感的阻遏蛋白cI 。在低温(28-30℃) 时，cIts857阻遏蛋白可阻遏PL启动子转录。在高 温(42℃)时，cIts857蛋白失活，阻遏解除，促使 PL启动子转录。
3.3.2 常用原核表达载体
➢ 能够检测启动子活性强弱的新型质粒载体 系统。
➢ 来源于pBR322
检测启动子强弱的原理：
➢ 半乳糖激酶能够从ATP分 子上转移一个磷酸集团 给半乳糖分子，从而催化半乳糖发生磷酸 化作用，形成半乳糖-1-磷酸。
➢ 用同位素标记ATP，测定从ATP转移到半乳 糖去的32P的放射性强度，可推算报告基因 （galK）表达的半乳糖激酶的产量。
2. 由于分泌在胞外培养基中的蛋白 质相当稀释，因此目标蛋白质的 纯化过程比较复杂
3.4 原核生物表达产物的分离纯化
包含体蛋白的提取 蛋白质的复性 蛋白质的纯化 蛋白质的PEG化 蛋白质的质量检测
1、包含体蛋白的提取
细菌的收获
破碎 （超声破碎、机械破碎、化学方法破碎）
离心 （5000-10000g）
（氧化环境） 在正确折叠的蛋白质，在转运过程
中，在体内对信号肽进行切割
缺点：
1. 信号肽并非总是有助于蛋白质的 转运
2. 有可能形成包含体
3、胞外表达
➢ 使克隆在大肠杆菌细胞中表达的外源 蛋白质，分泌到胞外培养基中进行分 离纯化。
途径：
1. 用大肠杆菌细胞固有的途径，使真正属于分 泌型的蛋白质直接分泌到胞外培养基中。 （不是特别有效的程序）
➢ Lac(乳糖启动子) ➢ Trp(色氨酸启动子) ➢ Tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子) ➢ PL (λ噬菌体的左向启动子) ➢ T7噬菌体启动子
通过与阻遏蛋白的相互作用来控制基因的启动和停止
大肠杆菌的Lac启动子
➢ 来自大肠杆菌的乳糖操纵子 ➢ 由阻遏蛋白基因(LacI)、启动基因(P)、操纵基因
非融合型蛋白表达
P
SD
Foreign DNA
非融合型表达载体 非融合基因
非融合蛋白特点：
➢ 1、表达时要求高：SD序列与ATG的距离要 合适。即使改变2-3个碱基，表达效率也 会大受影响。
➢ 2、优点：能够较好地保持原来蛋白的活性。 ➢ 3、缺点：在宿主细胞内容易被蛋白酶降
解，蛋白产量低；分离纯化费时费力， 成本较高。
4、提高表达蛋白的稳定性，防止被宿主降解
➢ 若克隆的基因所用的密码子为宿主罕见 密码子，可对外源基因进行定点突变或 对宿主细菌进行改造。
3.3.6 非融合蛋白的表达
非融合蛋白：指所表达的外源蛋白的N端或 C端不含任何其他氨基酸。
所表达的蛋白质以真核蛋白的 mRNA的AUG为起始，在其氨基 端不含细菌多肽序列。
大肠杆菌中表达体系的不足：
➢ 1. 真核基因，在结构上同原核基因之间存在着很 大的差别。
➢ 2. 真核基因的转录信号同原核的不同。细菌的 RNA聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因 可能含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷 酸序列。
➢ 3. 真核基因mRNA的分子结构同细菌的有所差异， 影响真核基因mRNA稳定性。
(O)和编码3个与乳糖利用有关的酶的结构基因所组 成 ➢ 受活化蛋白和cAMP 的正调控，阻遏蛋白的负调控 ➢ 受IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）、TMG（硫甲基半 乳糖苷）、ONPG（邻硝基苯基半乳糖苷）的诱导 ➢ LacUV5启动子：Lac启动子的衍生物
大肠杆菌的trp启动子
➢ 来自大肠杆菌的色氨酸操纵子 ➢ 由启动子、衰减子、操纵基因及trpE的部分结构
分离有功能启动子的两个实例：
➢ 用大肠杆菌质粒pBR316筛选启动子 ➢ 用pK01筛选启动子
用大肠杆菌质粒pBR316筛选启动子
使用四环素（Tetr）作报告基因分离功能启动子 ➢ 1. 构建质粒pBRH3B和pBRH1 ➢ 2. 筛选启动子
用pK01筛选启动子
使用galK（半乳糖激酶基因）作报告基因 分离功能启动子
➢ 含Lac启动子的表达载体，如pOP203-13。 ➢ 含trp启动子的表达载体，如pDR720。 ➢ 含tac启动子的表达载体，如pKK223-3。 ➢ 含PL启动子的表达载体，如pPL-λ。 ➢ 分泌蛋白表达载体
➢ 融合型表达载体：----融合蛋白
➢ 非融合型表达载体：---天然完整蛋白
➢ 分泌型表达载体：----产物可跨膜分 泌至胞周间隙
优点：
1. 形成包含体 ➢ a. 蛋白质易于以高纯度和高浓度方式分离 ➢ b. 蛋白质受保护而免受胞内酶的降解作用 ➢ c. 蛋白质没有活性，因此不会使寄主细胞
受伤害
2. 蛋白质的产量高 二硫键的断裂以及转译修饰作用
的丧失，会导致外源片断编码的蛋白 质在大肠杆菌中超量表达。
3. 表达的质粒载体构建比较简单。
3.3.11 加强分泌
外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的表达部位:
➢ 1. 细胞质中表达 ➢ 2. 周质中表达 ➢ 3. 胞外表达
1、细胞质中表达:
➢ 外源基因在大肠杆菌寄主细胞质中高效表达时， 常会发生一种特殊的生理现象，形成包含体。
➢ 包含体：存在于细胞质中的一种由不可溶性蛋 白质聚集折叠而成的晶体结构物。影响其形成 的关键因素：电荷的平均数、形成转角的氨基 酸残基组分
3 原核生物的基因表达
与操作
3.1 原核生物的基因表达 3.2 有功能的启动子的分离 3.3 可调控强启动子驱动的基因表达 3.4 原核生物表达产物的分离纯化
基因克隆的技术路线
目的基因
载体
体外重组
重组子（杂合DNA）
转化
受体细胞
筛选阳性克隆
大量扩增，获得子代DNA
大肠杆菌表达体系
大肠杆菌表达体系优越性：
基因组成 ➢ 受阻遏蛋白和衰减子的调控，阻遏蛋白前体必须
与色氨酸结合才有活性 ➢ 3-β-吲哚丙烯酸（IAA）可竞争性抑制色氨酸与
阻遏蛋白的结合，提高转录活性。
Tac启动子
➢ 是一组由Lac和trp启动子人工构建的杂合启动 子，其启动能力比Lac和trp都强；
➢ 受Lac阻遏蛋白的负调节，受IPTG（异丙基硫代 半乳糖苷）的诱导 。
2、转化原核细胞并诱导表达 3、裂解细胞，亲和柱层析分离融合蛋白 4、切割融合蛋白获得目的蛋白
例：谷胱甘肽S-转移酶标记物
融合蛋白质的纯化的基本原理：
利用与融合蛋白质配偶体相对应的 配体作为吸附剂，制备亲和层析柱，通 过配偶体与配体之间的相互作用，过柱 的融合蛋白质被滞留下来，其它蛋白质 则流出柱外，经洗脱处理，便可回收到 纯化的融合蛋白质。
➢ 4. 许多真核基因的蛋白质产物，都要经过 转译后的加工修饰（正确折叠和组装）， 而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中 并不存在；
➢ 5. 细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基 因所表达的蛋白质分子，并把它们降解掉。
大肠杆菌表达载体
启动子
核糖体结合位点 转录终止子
3.2 有功能的启动子的分离
一般程序：
缺点：
1. 包含体 ➢ a. 蛋白质折叠了，再折叠的蛋白质可能无法
恢复其生物学活性 ➢ b. 蛋白质的终产量偏低 ➢ c. 蛋白质的生产成本比较昂贵 2. 还原的环境不利于二硫键的形成
（硫氧还蛋白系统、谷氧还蛋白系统）
➢ 3.蛋白质会被酶解 ➢ 4.蛋白质种类多，因此纯化比较复杂
2、周质中表达
3.3.3 提高蛋白的表达量
1、选择合适载体，提高翻译水平 ➢ 强启动子----提高转录水平 ➢ 核糖体结合位点（ATG---SD） ➢ 避免产物降解 ：分泌/融合表达
细菌蛋白酶抑制剂
2、选择合适宿主 ➢ Lac 启动子----LacI菌
➢ PL启动子-------- cI857 溶源菌
3、诱导表达 ➢ 温度诱导------PL ➢ IPTG的化学诱导----Plac、Ptac
分离功能的启动子
➢ 将大肠杆菌基因组的酶切片断，克隆在pOK1质粒 载体的单克隆位点上；
➢ 将DNA重组分子，转化给宿主细胞（GalE＋、 GalT ＋、GalK－），避免内源半乳糖激酶的干扰；
➢ 将它们涂布在麦氏培养基（含有PH值指示剂的中 性红和结晶紫，检测碳水化合物）上，筛选转化 子（重组子产生红色的菌落）。
➢ 报告基因（reporter gene）：特指那些编码 产物可以被快速测定的功能核苷酸编码单元 （半乳糖苷酶基因、碱性磷酸酶基因、萤光 素酶基因、半乳糖激酶基因以及氯霉素乙酰 转移酶基因等）。
➢ 追踪某种特定的DNA结构（重组质粒）是 否已经导入寄主细胞、抑或是器官和组织； 也可用来同任何一种目的启动子连接，因此 其表达活性可作为检测启动子功能的依据。
融合蛋白质中目的蛋白的纯化
➢ 1.溴化氰（CNBr）切割法： 能特异性的从甲硫氨酸残基处切割多肽链。如 胰岛素的制备。
➢ 2.胰蛋白酶切割法： 能从精氨酸或是赖氨酸残基羧基一侧进行特异 性的切割。
➢ 3.凝血因子Xa切割法： 能唯一地从特异识别序列C－末端切割多肽
3.3.9 增强蛋白质的稳定性 3.3.10 DNA整合入宿主染色体中