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参麦与丹参注射液治疗冠心病心绞痛的Meta分析
 【编者按】医药论文是科技论文的一种是用来进行医药科学研究和描述研究成果的论说性文章。

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 参麦与丹参注射液治疗冠心病心绞痛的Meta分析冠状动脉粥样硬化性心脏病是冠状动脉粥样硬化使管腔阻塞，导致心肌缺血、缺氧而引起的心脏病，它和冠状动脉功能性改变(痉挛)一起，统称冠状动脉性心脏病[1]。

心绞痛是由于心肌缺血，导致胸部及附近部位的不适症状。

随着人们生活水平的提高，生活节奏的加快以及工作压力的增大，冠心病心绞痛的发病人数也在逐年上升，现已成为导致人口死亡的主要原因之一。

近期研究表明参麦注射液可有效缓解心绞痛[2～8]，但由于样本数量较少，研究的质量亦未进行系统评价，故影响了结果的可信度。

本文对国内外有关参麦注射液与丹参注射液对照治疗心绞痛的临床随机对照实验(RCT)进行了系统评价，旨在为临床工作者提供更为可靠的证据。

 1 资料与方法
 1.1 文献纳入标准根据Cochrane协作网工作手册标准，制定参麦注射液治疗心绞痛的临床RCT的纳人标准。

①实验采用随机对照设计方案;②实验选择研究对象诊断参照国际心脏病学会和协会及世界卫生组织临床命名标准化联合专题组报告《缺血性心脏病的命名及诊断标准》[9];③文献中所选病人不合并严重器质性疾病及并发症;④治疗组为常规治疗基础上加用参麦注射液，对照组为常规治疗基础上加用丹参注射液;⑤以临床症状缓解率及心电图改善率为疗效判定指标。

 1.2 检索策略计算机检索Cochrane图书馆临床对照实验资料库(2009年第2期)、MEDLINE(1991～2009-03)、EMbase(1991～2009-04)、CBMdisc (1991～2009-04)、CNKI (1994～2009-04)，手工检索相关文献。

中文检索词为：参麦注射液、丹参注射液、心绞痛;英文检索词为：Shenmai injection，Danshen injection，angina pectoris。

通过查到文献的参考文献进行回溯性检索和引文检索作为补充。

 1.3 纳入实验的筛选由两名评价员独立阅读所获文献题目及摘要，在排除明显不符合纳入标准的实验后，对可能符合纳入标准的实验阅读全文，以确定是否真正符合纳入标准，而后交叉核对，意见不一致时通过讨论或征求第三方意见解决。

 1.4 质量评价纳入研究的方法学质量使用Jadad等[10]制定的量表进行评价。

计分为1～5分。

1～2分的实验被视为低质量研究，3～5分为高质量研究[11]。

 1.5 统计分析由两名评价员独立输入数据，采用Cochrane协作网提供的专用软件RevMan4.2进行Meta分析。

 1.5.1 异质性检验纳入研究间的异质性采用2检验，检验水准=0.1;用I2评估异质性大小，I2 25%表明异质性较小，25% I2 50%则为中等度异质性，I2 50%表明研究结果间存在高度异质性。

 1.5.2 选择统计模型若研究间无异质性，采用固定效应模型进行合并分析;反之，则采用随机效应模型，并从实验分组、药物疗程及剂量等方面进行亚组分析以探讨产生异质性的原因。

 1.5.3 发表偏倚评估依据纳入文献报道数据，以单个研究估计得来的治疗效果作为X 轴，以1/SE代替每项研究的样本量作为Y轴，利用RevMan 4.2绘制漏斗图。

若漏斗图近似对称，认为不存在发表偏倚;反之，则认为可能存在发表偏倚。

 2 结果
 2.1 纳入研究的情况计算机检索共初检出187篇文献，通过阅读文题、摘要和全文，最终纳入7篇文献。

文献筛选流程见图1，各纳入研究的基本资料见表1。

图1 文献筛选流程图
 2.2 纳入研究的方法学质量评价纳入的7篇文献均提及随机二字，但均未描述具体分组方案、是否采用了盲法以及失访或退出例数。

根据Jadad量表评分标准，纳入的7篇文献均为低质量研究(见表1)。

 2.3 异质性检验症状改善情况：x2 = 15.48，P=0.02，I2 =61.2%，存在高度异质性;心电图改善情况：x2 = 6.72，P=0.35，I2=10.7%，存在轻度异质性。

 2.4 Meta分析结果
 2.4.1 冠心病心绞痛症状改善情况7项研究均提供了治疗后心绞痛症状缓解情况即总有效率，由于纳入研究间存在异质性，经复习相关原文，未发现明显异质性原因，故采用随机效应模型进行效应量的合并，Meta分析结果显示Z=3.83(P=0.001)，
OR=6.71，95%CI (2.53，17.77)(见图2)。

 2.4.2 冠心病心绞痛心电图改善情况7项研究均提供了治疗后心电图改善情况即总有效率，由于纳入研究间存在异质性，经复习相关原文，未发现明显异质性原因，故采用随机效应模型进行效应量的合并，Meta分析结果显示Z=5.29(P 0.000 01)，OR=3.15，95%CI (2.06，4.82)。

见图3。

表1 各纳入研究的基本资料图2 参麦注射液与丹参注射液治疗冠心病心绞痛症状改善总有效率森林图图3 参麦注射液与丹参注射
液治疗冠心病心绞痛心电图改善总有效率森林图
 2.5 纳入研究的发表偏倚评估漏斗图图形近似对称，提示不存在发表偏倚(见图4)。

图4 发表偏倚评估漏斗图
 3 讨论
 3.1 纳入研究质量小结本系统评价共纳入7篇文献，均为临床RCT，无发表偏倚。

纳入研究存在如下方法学质量不足的问题：①所有文献均未提及具体随机化方案，因此存在随机方法不严谨或有无的可能性。

②所有研究均未描述是否实施分配隐藏，这将导致选择性偏倚。

③所有研究均未描述是否采用盲法，因此可能存在选择性偏倚、实施偏倚和测量性偏倚的可能性。

总之，本系统评价纳入研究的总体质量不高，因此导致结果的论证强度有限。

 3.2 疗效评价当冠状动脉的供血与心肌的需血之间发生矛盾，冠状动脉血流量不能满足心肌代谢的需要，引起心肌急剧的、暂时的缺血缺氧时，即产生心绞痛。

参麦注射液是由人参、麦冬等量提取的注射液，由经典方剂生脉散简化而来，具有降低心肌耗氧量、提高心肌耐缺氧能力、抗脂质过氧化、加速损伤心肌细胞DNA的复制和蛋白质的合成等功效[12]，因此参麦注射液在理论上可以预防和缓解冠心病心绞痛。

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 道地药材五鹤续断基因组脱氧核糖核酸提取方法的改进道地药材是传统中医药文化中的精品，是在特定产区的外界环境和产区内该物种的地方种群遗传性状等综合因素的作用下，形成的品质优、疗效佳的中药材[1]。

道地药材与非道地药材是不同产区的生物品，药材品质存在差异，但两者的形态和组织构造差异往往不明显，难以运用传统方法准确鉴别药材道地性。

随着分子生物学的发展，DNA分子鉴定技术及方法已广泛运用于中药材道地性与非道地性的鉴定[2]。

而DNA的分离纯化是DNA分子鉴定等分子生物学操作中的重要步骤，同样也是药用植物分子诊断技术中的关键环节。

由于中药材中含有的小分子次生物质，如萜类、黄酮、香豆素、有机酸、鞣质等含有酚羟基的化合物，氧化后易与DNA结合，引起DNA降解或抑制酶的活性;而广泛存在的多糖类由于与DNA同属大分子化合物，在一般提取过程中很难完全去除。

因此有必要不断摸索并建立不同条件下简单、快捷、高纯度的中药材基因组DNA提取方法。

本实验就是以道地药材五鹤续断的幼嫩叶片为试验材料，采用自行探索改良的CTAB法对五鹤续断基因组DNA进行了提取，得到了质量较高的五鹤续断基因组DNA，为应用于五鹤续断的遗传多样性、种质鉴定和基因指纹图谱的构建等分子水平的研究提供了基
本保证，也为其他道地药材在分子生物学水平方面的研究提供了一定的参考资料。

 1 材料与仪器
 1.1 材料五鹤续断叶片均采自湖北省恩施土家族苗族自治州鹤峰县走马镇万寺坪道地药材五鹤续断GAP研究及种植基地，经湖北民族学院医学院中药教研室袁成玉副教授鉴定，用干燥剂将叶片干燥后置于-80℃冰箱备用。

 1.2 试剂1mol/L Tris-HCl(pH8.0)，3 mol/L 乙酸钠，0.5mol/L EDTA(pH 8.0)，1 mol/L NaC1，氯仿/异戊醇24∶1，异丙醇，无水乙醇，70%乙醇，10%CTAB溶液，1.5 x CTAB提取液，CTAB沉淀液，5 mol/L NaC1，1 mol/L乙酸钠，10mg/ml RNaseA，高盐TE(含1 mol/L NaC1)，1 TE缓冲液，以上部分是用分析纯配制试剂;Taq DNA聚合酶、dNTPs等，购自大连宝生物有限公司;十六烷基三甲基溴化锭(CTAB)为Geneview分装，购自北京鼎国生物技术有限责任公司;琼脂糖购自北京华美公司。

 1.3 仪器SANYO超低温冰箱，Eppendorf 低温高速离心机，Eppendorf 梯度PCR 仪，BeckmanD/U530紫外分光光度计，恒温水浴锅，DYY-10C水平电泳仪，BIORAD 凝胶成像系统，研钵和研棒，移液器。

 2 方法
 2.1 基因组DNA的提取DNA提取以CTAB常规法[3，4]为基础。

为了克服多酚、多糖等次生物质对DNA纯度的干扰，提高获得DNA的数量和质量，同时还受到条件的限制，本研究对其进行了改良：①选取新鲜幼嫩的五鹤续断叶片，酒精消毒后快速放入超低温冰箱;②在没有液氮的情况下，利用超低温冰箱的冷冻作用和暗视野效应，再用预冷的研钵和研棒快速粉碎五鹤续断叶片;③不用饱和酚，增加一次氯仿/异戊醇的用量，避免残留蛋白质和酚等物质影响DNA的质量;④用1 mol/L NaCl，除去多糖物质，同时可减轻DNA的褐化。

 改良后的CTAB法具体提取步骤如下：①快速取出保存在超低温冰箱中的新鲜叶片3 g，放入已预冷冻的研钵中，迅速研磨成粉末，移入50 ml 离心管;然后加入8 ml的CTAB提取液(先预热到80℃)，充分混匀，65℃水浴中保温60 min，其间每20 min反转摇匀1次，取出样品，冷却至室温;②加入4 ml氯仿，混匀后，平放在震荡器上摇动10 min至抽提液与氯仿完全混合，室温下4 000 r/min离心15 min;③将上清液转移至另一离心管中;加入1/10量的10%CTAB液，摇匀;④加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，震荡15 min至混匀，室温下4 000 r/min离心5 min;⑤取上清液重复此步骤;⑥取上清液，加入等量的沉淀液，摇匀，室温放置10m in，然后4 000 rmin离心10 min;⑦取上清液加入1倍体积的预冷异丙醇，混匀，-20℃静置20 min使沉淀生成，12 000 r/min 离心5 min;⑧弃上清液，加入5 ml高盐TE(含1 mol/L NaCl)和5 l 10 mg/ml RNase A 在55℃摇床中轻摇至完全溶解;⑨加入1/10体积的3 mol/L乙酸钠和2倍体积的冰冻无水乙醇，充分混匀，-20℃静置20 min，使沉淀凝聚，用玻璃棒钩出呈絮恕状的DNA，在70%乙醇中洗涤2～3次，最后去除乙醇将沉淀放置风干，加入300 l TE缓冲液至完全溶解沉淀，再短暂离心。

 2.2 DNA的检测用紫外分光光度法测定DNA 260 nm 及280 nm 吸光值，然后根据A 260/280值判断DNA纯度并根据DNA 260 nm检测其浓度。

 用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA样品：取8 l DNA样品在1.0%的琼脂糖凝胶(含0.5 l/ml的EB溶液染色)中进行电泳分离，在紫外透射仪下检测DNA的纯度及降解情况。

用琼脂糖凝胶电泳法检测PCR产物：取8 l PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶(含0.5 l/ml 的EB溶液染色)中进行电泳分离，在紫外透射仪下检测PCR产物的扩增效果。

 3 结果与分析
 3.1 提取方法的凝胶检测和PCR反应检测分析从图1可以看出，基因组DNA浓度较高，呈现一条亮带，无降解，说明对五鹤续断鲜叶采用改进的CTAB法效果较好，能提取得到完整洁净的基因组DNA。

从图2可明显发现，用改进后的8个不同来源的基因组DNA为模板在五鹤续断18S rRNA基因的PCR扩增中均得到理想的带型。

1.利川 2.恩施 3.建始 4.咸丰 5.宣恩 6.鹤峰7.巴东图1 五鹤续断不同产地的样品DNA电泳图1.利川 2.恩施 3.建始 4.咸丰 5.宣恩 6.鹤峰7.巴东图2 不同产地的五鹤续断18S rRNA基因的PCR产物电泳图
 3.2 紫外分光光度计检测由表1可见，对于新鲜叶子采用改良CTAB法260/280值均
在1.80～2.00之间。

表明改良CTAB法的除杂效果较好。

由表2可以看出，改良CTAB法提取的基因组DNA浓度高，与琼脂糖凝胶电泳(图1)检测的结果一致。

表1 五鹤续断不同产地的紫外分光光度计纯度检测结果表2 五鹤续断不同产地的紫外分光光度计浓度检测结果
 4 结论
 道地中药材用分子生物学方法进行的道地性研究，是近年来发展起来的新的鉴定方法，它可弥补传统形态学和生化分类鉴定的一些不足[1]。

常用于中药材鉴定的分子生物学方法有RFLP，RAPD，AFLP，SSR，ISSR，DNA序列分析以及基因芯片等技术[5～12]。

本研究的方法就采用DNA序列分析的技术来进行道地药材五鹤续断的分子鉴定，为五鹤续断的道地性和分子系统发育关系提供基础性资料。

而进行这项研究关键步骤之一就在于提取高浓度的基因组DNA，可为后续实验提供高质量的目的基因，所以有必要探索五鹤续断基因组DNA提取的改进方法，为后续实验打下基础。

 五鹤续断植株应采集鲜嫩幼叶，此部位有丝分裂旺盛，DNA含量较高，是基因组DNA提取的理想部位。

采集后应立即进行消毒，避免提取出其它生物的DNA对五鹤续断基因组DNA的污染。

由于地域限制，再加上液氮运输不便，不易储存，故本实验运用超低温冰箱-80℃的超低温冷冻中药材植株鲜嫩叶片具有与液氮类似效应，同时还具有暗视野效应，较少了叶绿素含量，避免叶绿素对DNA提取的影响，本实验结果证实此方法较为有效。

已有研究发现[13，14]，五鹤续断等川续断富含多酚、多糖、蛋白质等复杂的初生及次生代谢产物，这些物质易与DNA不可逆地粘附在一起，从而抑制
DNA聚合酶等多种酶的活性，明显影响后续实验。

故在本实验中尝试不用饱和酚，增加一次氯仿/异戊醇的用量，尽量避免残留蛋白质和酚影响DNA的质量，同时还使用含1 mol/L NaC1的高盐TE，减少多糖对DNA含量的影响。

从实验结果来看达到了目的，取得了较好的效果，基因组DNA及PCR产物条带清晰无明显拖尾等现象。

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 临床研究证实丹参注射液是一种治疗冠心病心绞痛的有效药物[13，14]，本系统评价研究结果表明，在缓解冠心病心绞痛临床症状及改善心电图方面，参麦注射液均优于丹参注射液，提示参麦注射液治疗冠心病心绞痛疗效确切。

 3.3 局限性本研究最终纳入7篇文献，均为中文文献，Jadad评分均为1分，总体质量不高。

另外，7项研究间存在异质性。

这些均可以影响该系统评价的可靠性。

Meta 分析并不能取代大规模、多中心的RCT ，因为后者属于真正的治疗实验研究，随着新的研究资料不断的收集，结论应加以更新。

由于Meta 分析属于描述性二次分析，存在混杂偏倚、文献报道偏倚以及分析方法本身的一些缺点，在医学实践和科研中应该正确认识和合理应用Meta 分析。

 4 结论
 根据目前的研究结果表明，参麦注射液治疗冠心病心绞痛疗效确切。

但由于本研究中符合纳入标准的文献在数量及质量上的局限，有必要开展更多设计严谨、大样本、多中心的RCT来佐证这种趋势。

 【参考文献】
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 (发布时间:2011-04-24)
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