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北豆根总碱软胶囊的制备及质量控制
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 北豆根总碱软胶囊的制备及质量控制
 作者：朱孝芹，韩铁刚，刘翠哲
 【摘要】目的确定北豆根总碱(TAMD)软胶囊的生产工艺和质量标准。

方法以内容物沉降比为考察指标，筛选出适宜的处方，轧制软胶囊。

用酸性染料比色法测定北豆根总碱含量，高效液相色谱法测定蝙蝠葛碱含量。

结果所制制剂为黄色膏状物，检查符合2005版《中国药典》的相关规定;酸性染料比色法：线性范围为6～40 g ml-1 ，r=0.999 8 (n=7)，平均加样回收率为98.86%，RSD=0.58%;HPLC法：线性范围为0.01～0.1 mg ml-1，r = 0.999 8(n=7) ，平均加样回收率为99.25%，RSD=0.60%。

结论该制剂制备工艺简便可行，质量稳定可控。

 【关键词】北豆根总碱; 软胶囊; 制备工艺
 软胶囊是一种新剂型，能将油状物、药物溶液或混悬液、糊状物甚至药物粉末定量压注并包封于胶膜内，形成大小、形状各异的密封胶囊。

北豆根总碱软胶囊的内容物为黄色膏状物，由北豆根总碱与基质、润湿剂和助悬剂组成。

目前国内尚无该产品，测定软胶囊内容物中总碱和主要单体蝙蝠葛碱的含量并在此基础上制订软胶囊的质量标准，是保证产品质量的基础。

 1 仪器与试剂
 1.1 仪器JASCO高效液相色谱仪：RU1580泵，UV-15紫外-可见检测器(日本);HP-8453紫外-可见分光光度计(惠普公司);AG-254型电子分析天平(瑞士梅特勒);ZFQ85-A 型旋转蒸发仪(上海医械专机厂);JMS-80胶体磨(廊坊通用机械厂);RJNJ-1型压丸机(上海延安制药厂制药机械分厂)。

 1.2 试剂北豆根总碱软胶囊(自制，规格60 mg);蝙蝠葛碱(对照品，自制，含量99.0%);无水甲醇、磷酸、酚酞(分析纯);甲醇、乙腈(色谱纯);注射用大豆油(广东环叶制药有限公司);蜂蜡(广东威而特精腊开发有限公司);聚甘油酯(池田物产公司);明胶(青海明胶股份有限公司);甘油(广州启得利化工商贸有限公司);二氧化钛(美国WC D公司);丁
烯二酸(太原市侨友化工有限公司);食用柠檬黄(上海化学染料二厂)。

 2 处方与制备
 2.1 内容物处方中药软胶囊内容物一般由主药和稀释剂、润湿剂、助悬剂组成。

通过文献检索，兼顾成本，将稀释剂定为大豆油，助悬剂定为蜂蜡。

润湿剂常用吐温类，但吐温类可致红细胞膜破裂而溶血，故选用聚甘油酯这一新型表面活性剂，具备良好的乳化性能[1]。

选用正交实验法确定各组分用量，取处方量的大豆油，水浴加热，依处方加入蜂蜡、聚甘油酯，酯化后充分搅拌，加入处方量的主药，用胶体磨研磨后超声除去气泡。

内容物的质量以沉降系数作为考察指标，将内容物置于10 ml刻度试管中，测定内容物原始高度H0，以500 r min-1的速度离心4 h，测定沉降后的高度H，计算沉降比F=H/ H0，F值越大，内容物越稳定。

正交实验安排表见表1，结果见表2。

表1 正交实验安排表2 正交实验结果
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 风轮菜乙醇提取物对血管内皮细胞的保护作用研究
 【摘要】目的研究风轮菜乙醇提取物(EJCT)对血管内皮细胞的保护作用及机制。

方法分别用过氧化氢(H2O2 )和高糖建立体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)损伤模型。

MTT法检测细胞存活率;用试剂盒方法检测细胞超氧化物歧化酶(SOD)和乳酸脱氢酶(LDH)活力;用Griess 法测定上清液中NO2-浓度反映内皮细胞释放的一氧化氮(NO)。

结果不同浓度的EJCT能明显提高H2O2和高糖损伤的内皮细胞存活率，使
H2O2 损伤的内皮细胞内低下的SOD活力回升，降低高糖诱导的内皮细胞LDH释放。

另外，EJCT(3，10，30，100 mg/L)能增加HUVECs培养液中NO含量。

结论风轮菜乙醇提取物对血管内皮细胞具有保护作用，机制可能与其抗氧化和促进NO的合成有关。

 【关键词】风轮菜; 内皮细胞; 过氧化氢; 高糖; 一氧化氮
 血管内皮细胞介于血液与组织间，发挥着屏障作用，同时具有多种生理功能，对维持健康或病理环境下内环境的稳定起着积极作用。

大量的研究表明，内皮功能异常已经成为2型糖尿病患者血管并发症的始发因素[1]。

氧化应激是导致糖尿病患者血管内皮功能异常的重要因素[2,3]。

因此，氧化应激在血管病变的发病中起关键作用，抗氧化治疗具有重要的临床意义。

 唇形科风轮菜属植物主要的化学成分为黄酮类、皂苷类、有机酸类、芳香族类、三萜类、甾体类等。

目前的研究发现风轮菜属植物主要的药理作用为止血、抗菌、抗炎及免疫作用、抗辐射、抗肿瘤等[4]。

风轮菜属植物风轮菜在福建民间用于治疗糖尿病，提示其可能具有保护血管内皮细胞损伤的作用。

本实验室前期研究结果表明风轮菜乙醇提取物具有明显的降血糖作用[5]。

为了探讨风轮菜是否具有保护血管内皮细胞的作用，本研究采用H2O2 和高糖分别建立氧化应激损伤内皮细胞的模型, 观察不同浓度的风轮菜乙醇提取物对氧化应激损伤内皮细胞的保护作用, 并初步探讨其作用机制，为将其开发为糖尿病及其并发症治疗药物奠定基础。

 1 材料与仪器
 1.1 药材与试剂风轮菜全草采集于福建省莆田县萩芦镇，经中国药科大学中药资源学研究室秦民坚教授鉴定为Clinopodium chinense (Benth.) O. Kuntze。

风轮菜全草的80%乙醇提取物(EJCT，中国药科大学中药药理教研室提供，得率18%);胎牛血清和M199培养基(Gibco公司);胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶和乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na，南京生兴生物技术有限公司);噻唑蓝(MTT)和Endothelial cell growth supplement from bovine neural tissue(ECGS，Sigma公司);三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl，南京创瑞生物技术有限公司);磺胺和N-(1-萘基)乙二胺盐酸盐(国药集团化学试剂有限公司);硝普钠粉针(北京双鹤现代医药技术有限公司，批号20060609);乳酸脱氢酶试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20080331);超氧化物歧化酶试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20070619)。

其它试剂均为市售分析纯。

 1.2 仪器Multiskan spectrum MSS1500-320酶标仪，702型超低温冰箱和3111型细胞培养箱(Thermo Electron 公司);SW-CJ-IF超净台(苏州安泰空气技术有限公司);XSZ-D2倒置显微镜(重庆光学仪器厂);1-15K低温离心机(Sigma 公司)。

 2 方法
 2.1 原代人脐静脉内皮细胞的培养[6]采用胶原酶灌注消化法分离原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)。

无菌条件下，选取健康产妇脐带(长度约20 cm)，除掉两端破损及水肿，4℃保存于磷酸缓冲液(PBS)中，4 h内进行分离。

先用PBS 溶液冲洗静脉腔内血液，然后置于37℃培养箱内，用0.1%Ⅱ型胶原酶消化15～20 min，收集消化液于1 000 r/min离心5 min，弃上清，收集沉淀细胞。

细胞重悬于M199培养液(含10%胎牛血清;青霉素、链霉素各100 U/ml;ECGS 20 mg/L)中，移入预先铺好明胶的培养瓶内，于37℃、5%CO2 的培养箱中培养。

24 h 后PBS冲洗、换新鲜培养基，2～3 d更换培养基，约接种后4～6 d，当细胞生长覆盖80%左右培养面时，0.25%胰酶消化，1∶2比例传代。

内皮细胞Ⅷ因子相关抗原是内皮细胞所特有，用免疫组织化学法检测到分离培养的人脐静脉内皮细胞Ⅷ因子相关抗原为阳性。

 2.2 EJCT对H2O2 致HUVECs 脂质过氧化损伤的保护
 2.2.1 MTT法检测内皮细胞存活率[7] 取对数生长期HUVECs消化成单细胞悬液接种于96孔细胞培养板(2 104cell/孔)内，37℃，5% CO2预培养24 h后，更换M199培养液，分为5组，每组3个平行。

正常组为HUVECs的自然培养，模型组为HUVECs
与500 mol/L H2O2共培养，其余3组为EJCT (3，10，30 mg/L)与HUVECs及共培养，药物温育24 h之后，与H2O2共培养4 h，加入含0.5% MTT的培养基20 l，再培养4 h后，弃培养液，加入150 l的DMSO原液，振荡10 min，待结晶完全溶解后，用酶联免疫仪于490 nm波长处测定吸光值(A值)。

实验重复3次，每次3个复孔。

 2.2.2 SOD活性的检测细胞传代培养后随机分为正常组、模型组及各浓度药物作用组，给药剂量及方法同 2.2.1 。

实验结束时，弃细胞上清液，每孔加入50 l细胞裂解液(20 ml含：40 l 0.5 mol/L EDTA;4 ml 10% SDS;1 ml 1mol/L Tris-HCl;14.96 ml H2O，pH 6.8)，吹打细胞，然后取裂解液50 l，试剂盒方法测定SOD活性。

实验重复3次，每次3个复孔。

 2.3 EJCT对高糖致HUVECs损伤的保护[8]
 2.3.1 MTT法检测内皮细胞存活率取对数生长期HUVEC消化成单细胞悬液接种于96孔细胞培养板(1 104 cell/well)，培养24 h后更换M199培养基，将细胞分为5组，正常组为HUVECs的自然培养，模型组为HUVECs与30 mmol/L葡萄糖共培养，其余组为EJCT(3，10，30 mg/L)与HUVECs及葡萄糖共培养。

培养72 h后，各孔加入含0.5% MTT的培养基20 l，再培养4 h后，弃培养液，加入150 l DMSO原液，振荡10 min，待结晶完全溶解后，用酶联免疫仪于490 nm波长处测定吸光值(A值)。

实验重复
3次，每次3个复孔。

 2.3.2 LDH活性的检测细胞传代培养后随机分为正常组、模型组及各浓度药物作用组，给药剂量及方法同 2.3.1 。

实验结束时，收集细胞上清液，按试剂盒方法测定LDH活性。

各实验重复3次，每次3个复孔。

 2.4 EJCT对内皮细胞培养液中NO含量的影响取对数生长期细胞消化成单细胞悬液接种于96孔细胞培养板(2 104cell/孔)，37℃，5% CO2预培养24 h后，更换M199培养液，将细胞分为6组即正常组、EJCT (3，10，30，100 mg/L)、硝普钠(10 mg/L)组。

正常组为HUVECs的自然培养，药物组为不同浓度的药物与HUVECs共培养24 h后，以Griess法[9]测定细胞培养液中NO含量。

即100 l细胞培养液与100 l的Griess 试剂(1%磺胺溶于2.5%磷酸与等体积的0.1%萘乙二胺盐酸盐混合液)在室温下反应10 min，在酶标仪上于540 nm测定吸光度。

再根据NaNO2的标准曲线，计算出细胞培养液中NO2-的含量。

每次实验为3个平行，重复实验3次。

 2.5 统计学处理所有实验数据均以s表示，采用t检验进行组间比较，P 0.05 认为有统计学差异。

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仅供参阅！2.2 囊壳的制备[2]北豆根总
碱在光照情况下易分解，故在囊壳中加入二氧化钛做遮光剂，加入柠檬黄改变外观色泽。

此外，北豆根总碱为碱性，可加速囊壳的老化，所以在囊壳中加入1%的丁烯二酸来改变囊壳的溶解性。

称取明胶1.0 kg置化胶罐中备用，另外称取食用柠檬黄0.4 g溶于1 500 ml水中，将明胶浸泡36 h，使明胶充分吸水膨胀。

40℃水浴加热使明胶溶解，加入甘油750 g，阿拉伯胶浆250 g，二氧化钛8 g，丁烯二酸20 g，搅拌均匀。

60℃蒸发水分至处方量，超声波排除气泡后涂于不锈钢板，厚度1 mm，90℃干燥既可。

 
 2.3 软胶囊的制备称取大豆油1 266 g，水浴加热，加入蜂蜡80 g，聚甘油酯6 g，熔化后搅拌均匀，加入北豆根提取物648 g(含北豆根总碱600 g)，用胶体磨研磨后压制软胶囊。

每粒软胶囊内容物重0.20 g。

 2.4 整丸与干燥将软胶囊在室温(20～30℃)冷风干燥后置95%乙醇中，洗去油污后取出，于50℃干燥24 h。

将干燥后的软胶囊置包衣锅内，加入适量液体石蜡使均匀涂布。

铝塑泡罩包装。

批号分别为20051006，20051011，20051016。

 3 质量控制
 3.1 形状本品为黄色膏状物，味苦。

 3.2 鉴别取本品4粒，刮取内容物，加稀盐酸10 ml，振摇提取30 min，滤过。

取滤
液2 ml，加碘化钾碘试液2滴，即生成红棕色沉淀;另取滤液2 ml，加三硝基苯酚试液2滴，即生成黄色沉淀。

 3.3 检查符合《中国药典》2005版胶囊剂项下的各项规定。

 3.4 北豆根总碱含量测定[3]
 3.4.1 比色原理溴甲酚绿为一酸性染料，它的显色与pH值有关，溴甲酚绿在无水甲醇(pH=6)的条件下，可与北豆根总碱直接络合成绿色化合物，用于比色测定。

 3.4.2 检测波长的选择分别称取一定量的北豆根总碱软胶囊内容物(约相当于总碱15 mg)和空白制剂的内容物置10 ml容量瓶中，加入无水甲醇至刻度，超声提取30 min，补足失去的甲醇量，过滤。

取续滤液0.2 ml 置10 ml容量瓶中，加入0.1%溴甲酚绿溶液0.2 ml ,用无水甲醇定容，在200～700 nm进行扫描。

软胶囊内容物的甲醇提取液在620 nm处有最大吸收，而空白制剂没有吸收。

说明辅料对测定无影响。

 3.4.3 线性关系考察精密称取蝙蝠葛碱对照品2.0 mg，置10 ml容量瓶中，加无水甲醇溶解并定容作为对照品溶液。

分别精密称取对照品溶液0.3，0.5，0.8，1.0，1.2，1.5，2.0 ml，置10 ml容量瓶中，加入0.1%溴甲酚绿溶液0.2 ml，于620 nm处测定吸收度，随行试剂空白。

以蝙蝠葛碱浓度C对吸收度A进行线性回归，得标准曲线方
程：C=49.82A-0.84，r=0.999 8(n=7)，线性范围为6～40 g ml-1。

 3.4.4 回收率实验取经过含量测定的北豆根总碱(含量92.71%)约15 mg,分别精密称定5份置10 ml容量瓶中，按处方比例加入辅料，用自动涡流混合器混匀。

加入无水甲醇10 ml，超声提取30 min，补足失去的甲醇量，过滤。

取续滤液0.2 ml置10 ml容量瓶中，加入0.1%溴甲酚绿溶液0.2 ml ,用无水甲醇定容。

在620 nm处测定吸收度。

随行试剂空白。

根据标准曲线方程计算北豆根总碱的量和回收率。

结果见表3。

表3 北豆根总碱回收率实验结果
 3.4.5 样品含量测定按北豆根总碱软胶囊的最佳处方，制备3批样品，取3种批号样品各40 mg (约含总碱10 mg)，置50 ml容量瓶中，用无水甲醇定容，超声提取30 min，补足失去的甲醇量，过滤。

精密吸取续滤液1.0 ml置10 ml容量瓶中(浓度为2%)，加入0.1%溴甲酚绿溶液0.2 ml ,用无水甲醇定容。

在620 nm处测定吸收度，随行试剂空白。

根据标准曲线方程计算北豆根总碱的量。

结果3批样品的标示量分别为98.2%，99.6%，100.3%，符合方法学要求。

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仅供参阅！3.5 蝙蝠葛碱含量测定[4]
 3.5.1 色谱条件色谱柱为Discovery-C18(5 m，4.6 mm 250 mm);流动相为乙腈∶水∶
磷酸=16∶84∶0.15(V∶V∶V );流速0.5 ml min-1;波长208nm;柱温为室温;进样量20 理论塔板数：2300。

 3.5.2 干扰实验分别称取一定量的北豆根总碱软胶囊内容物(约相当于总碱15 mg)和空白制剂的内容物置25 ml容量瓶中，加入无水甲醇至刻度，超声提取30 min，补足失去的甲醇量，过滤。

取续滤液1.0 ml，置10 ml容量瓶中，挥干甲醇，用流动相溶解并定容。

按色谱条件检测。

空白制剂在25 min时无吸收峰，说明辅料对测定没有影响。

色谱见图1。

 3.5.3 线性关系考察精密称取北豆根对照品5.0 mg，置25 ml容量瓶中，用流动相溶解并定容，作为对照品溶液。

分别精密吸取对照品溶液0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，5.0 ml，置10 ml容量瓶中，用流动相稀释至刻度，按上述条件进行检测，以峰面积(A)对浓度(C)进行回归，得回归方程A=1.53 108 C +0.14 104 ，r=0.999 8(n=7),线性范围为0.01～0. 1mg ml-1。

a-对照品b-样品c-阴性样品图1 高效液相色谱图
 3.5.4 回收率实验取经过含量测定的北豆根总碱(含蝙蝠葛碱48.06%)约15 mg,分别精密称定5份置25 ml容量瓶中，按处方比例加入辅料，用自动涡流混合器混匀。

加入无水甲醇至刻度，超声提取30 min，补足失去的甲醇量，过滤。

取续滤液1.0 ml置10 ml容量瓶中，挥干甲醇，用流动相溶解并定容。

按上述色谱条件测定。

根据标准曲线方程计算蝙蝠葛碱的量和回收率。

结果见表4。

表4 蝙蝠葛碱回收率实验结果
 3.5.5 样品含量测定取3种批号样品40 mg (约含蝙蝠葛碱5 mg)，置25 ml容量瓶中，用无水甲醇定容，超声提取30 min，补足失去的甲醇量，过滤。

精密吸取续滤液2.0ml置10 ml容量瓶中，(浓度为4%)，挥干甲醇，用流动相溶解并定容。

按上述色谱条件测定。

根据标准曲线方程计算蝙蝠葛碱的量。

取3种批号样品40 mg (约含总碱10 mg)，结果3批样品的标示量分别为99.1%，100.5%，99.6%，符合方法学要求，其中蝙蝠葛碱含量不低于北豆根总碱的45.0%。

 4 讨论
 北豆根提取物味苦、疏水性强、对光热不稳定，适宜制成软胶囊。

建立北豆根总碱软胶囊的质量标准，需要解决两个问题：一是能否完全地把北豆根总碱从内容物中提取出来;二是辅料是否对测定造成影响。

本实验在参考北豆根提取物含量测定方法的基础上，很好地解决了上述两个问题，完成了北豆根总碱软胶囊的含量测定。

 【参考文献】
 [1] 时军，程怡.辅料在软胶囊剂型中的应用[J].中医药学刊，2003，21(9)∶1429.
 [2] 张亚中，张彤，陶建生.中药软胶囊的研究进展[J].中成药，2006，28(6)∶871.
 [3] 张怡，王爱华.北豆根气雾剂质量标准研究[J].中草药，2002，33(11)∶999.
 [4] 史自东，刘博.HPLC法测定蝙蝠葛酚性碱片中蝙蝠葛碱[J].中草药，2006，37(9)∶1347.
 医药卫生栏目
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